赭曲霉甾体11α-羟化酶基因AOH在毕赤酵母中的表达及功能分析

赭曲霉甾体11α-羟化酶基因AOH在毕赤酵母中的表达及功能分析郭凯;曹通;黄琳琳;刘晓光;王正祥;路福平【摘要】11α-羟基左旋乙基甾烯双酮(11α-OH-GD)是生产高效避孕药去氧孕烯的关键中间体.丝状真菌赭曲霉(Aspergillus ochraceus)TCCC41060可以转化左旋乙基甾烯双酮(GD)形成11α-OH-GD,但该转化反应特异性低,副产物偏高,限制了其工业应用.为了研究赭曲霉转化GD特异性偏低的机理,本文克隆了赭曲霉11α-羟化酶基因AOH并构建了表达载体pPIC3.5,K-AOH,获得了重组毕赤酵母菌株.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹实验(Western blot)分析表明,AOH重组蛋白相对分子质量为6.12×104,与预测结果一致.对转化产物进行薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分析结果显示,AOH重组菌株能够转化GD,形成目标产物11α-OH-GD以及3种副产物.以上结果表明:AOH基因编码的甾体11α-羟化酶对底物GD转化反应的特异性较差.%11α-hydroxy-13-ethyl-gon-4-en-3,17-dione(11α-OH-GD)is a key intermediate in the synthesis of desogestrel,a major ingredient of the third generation of oral contraceptive.Filamentous fungusAspergillus ochraceusTCCC41060 can convert 13-ethyl-gon-4-en-3,17-dione(GD)into 11α-OH-GD.However,low reaction specificity and high-level side prod-ucts limit its application in large-scale preparation of 11α-hydroxy-GD.In order to investigate the mechanism of low reaction specificity ofA.ochraceus TCCC41060 on substrate GD,cDNA of 11α-hydroxylase geneAOH was cloned and ligated to plasmid pPIC3.5,K in order to generate expression vector pPIC3.5,K-AOH;and then recombinantP.pastoris strains express-ing AOH were constructed.SDS-PAGE and Western blot analyses indicated that AOH was 6.12×104,which was consistent with the predicted size.TLC and HPLC analyses showed that the AOH recombinantP.pichia strain was capable of trans-forming GD into the target product 11α-OH-GD and three types of side products.The results indicated that the 11α-hydroxylase withAOH gene has poor specificity of conversion reaction on GD.【期刊名称】《天津科技大学学报》【年(卷),期】2017(032)005【总页数】6页(P34-38,78)【关键词】赭曲霉;11α-左旋乙基甾烯双酮;毕赤酵母【作者】郭凯;曹通;黄琳琳;刘晓光;王正祥;路福平【作者单位】工业发酵微生物教育部重点实验室,工业酶国家工程实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室,工业酶国家工程实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室,工业酶国家工程实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室,工业酶国家工程实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室,工业酶国家工程实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室,工业酶国家工程实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457【正文语种】中文【中图分类】Q786甾体化合物具有广泛的药理活性，在抗炎、抗肿瘤、调节性功能及生育控制等方面有着极其重要的作用[1]．天然的甾体化合物往往药理活性较低，在甾体化合物的特异位点上引入羟基可以显著提高其药理活性与生物学活性[2]．甾体化合物结构复杂且含有多个非对称中心，传统的化学合成很难在甾体骨架的特定位点引入羟基．微生物转化与化学合成相比有着特异性强、效率高、污染低等优点[3]，已广泛应用于甾体药物的工业化生产．工业上重要的微生物甾体羟基化位点有C11α、C11β、C9α、C16α等，其中C11α、C11β 羟基化是最重要的微生物甾体羟化反应，其产物广泛用于皮质激素药物生产．目前工业上用于甾体C11α羟基反应的菌种主要有黑根霉(Rhizopus nigricans)和赭曲霉(Aspergillus ochraceus)[4]．赭曲霉主要用于转化环氧黄体酮，生产其11α–羟基衍生物．但由于赭曲霉对不同甾体底物的转化特异性差异较大，使其应用范围受到限制．例如赭曲霉转化底物左旋乙基甾烯双酮(GD)，只有 60%,的11α–羟基左旋乙基甾烯双酮(11α-OH-GD)产物形成，而11α-OH-GD 是合成第 3代口服避孕药去氧孕烯的关键中间体．因此，提高赭曲霉转化 GD的产物特异性能够降低去氧孕烯的生产成本．已有的研究表明丝状真菌甾体羟化酶属于细胞色素 P450(Cytochrome P450，CYP)单加氧酶[5]，它们主要结合在内质网膜上，通过在甾体骨架特定位点引入氧原子将一系列亲脂性的甾体化合物转化为相对较为亲水的衍生物．真菌甾体羟化酶活性所需要的电子由 NAD(P)H–细胞色素 P450还原酶(Cytochrome P450 Reductase，CPR)提供[6]．参与赭曲霉甾体转化的11α–羟化酶基因 AOH已在昆虫细胞 Sf9中实现了表达[7]．目前尚不清楚赭曲霉对GD11α–羟化特异性偏低的原因，是 AOH 基因产物本身的酶学性质决定的还是由于其他基因的产物导致．因此，本文采用酵母异源表达系统来评价AOH基因产物的甾体转化特异性．毕赤酵母是一种成熟高效的外源蛋白表达系统[8]，已有不同来源的CYP基因在毕赤酵母中成功表达，如白斑角鲨CYP17[9]、大螯虾 CYP2L1[10]、植物 CYP79D1[11]、真菌PcCYP1f[12]以及人CYP17基因[13]等．本研究选择毕赤酵母GS115作为AOH基因的表达宿主．1.1.1 菌株与质粒赭曲霉(Aspergillus ochraceus)TCCC41060、大肠杆菌(E．coli)JM109均为本实验室保存．毕赤酵母(Pichia pastoris)及其胞内表达载体 pPIC3.5,K购自Invitrogen公司．1.1.2 试剂限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SacⅠ，SolutionⅠ连接试剂盒及 Pyrobest DNA聚合酶，Takara公司；YNB与生物素，国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、石油醚，天津化学试剂六厂；丙烯酰胺、过硫酸铵、β–巯基乙醇等蛋白电泳相关试剂，Sigma公司．TBS缓冲液和 TBST缓冲液．引物的合成及序列的测定由北京华大公司完成．1.1.3 培养基LB培养基(g/L)：蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉5．MD、YPD、YPG、BMGY、BMMY 培养基根据Invitrogen公司毕赤酵母操作手册配制．1.1.4 甾体物质左旋乙基甾烯双酮(底物，GD)和11α–羟基左旋乙基甾烯双酮(产物，11α-OH-GD)均由北京紫竹药业有限公司提供．1.2.1 11α–羟化酶基因的克隆根据 GenBank中已经发表的目标基因(AOH)序列(GI：83974441)，分析限制性内切酶位点，设计上、下游引物，引物序列分别为：5′-CGGAATTC ATGCCCTTCTTCACTGGGC-3′ ；5′-ATAAGAAT GCGGCCGCTCACCCACTGACCAATAA-3′．其中下划线部分为限制性内切酶识别位点．利用康为世纪公司总 RNA提取试剂盒提取底物，诱导 6,h赭曲霉总 RNA，取2,μL电泳分析所提总RNA质量．以总RNA为模板，反转录合成cDNA，再以上、下游引物进行cDNA PCR扩增．PCR扩增程序：95,℃预变性 5,min；94,℃变性30,s，61,℃退火 30,s，72,℃延伸 2,min，30个循环；72,℃延伸10,min．PCR产物经电泳分析，胶回收后4,℃保存备用．1.2.2 重组毕赤酵母的获得携带EcoRⅠ/NotⅠ黏性末端的 AOH 基因片段和表达载体 pPIC3.5,K按体积比 3﹕1混合后，添加SolutionⅠ16,℃过夜连接．连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞后，涂布于含50,μg/mL氨苄青霉素的 LB平板，37,℃倒置培养10,h．挑取单菌落于LB平板上密集划线，37,℃过夜培养．接种环刮取菌体，碱裂解法提取质粒．重组质粒经EcoRⅠ、NotⅠ酶切验证正确后进行测序分析．得到的重组质粒命名为pPIC3.5k-AOH．重组质粒 pPIC3.5,k-AOH经限制性内切酶SacⅠ线性化之后，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布于固体MD培养基上，30,℃培养至单菌落出现．将长势好的单菌落依次对点到 G418-YPD平板上(含遗传霉素 G418质量浓度分别为 1、2、4,mg/mL)，30,℃培养 2～3,d，筛选高拷贝转化子．石英砂振荡法提取高拷贝转化子基因组，PCR(程序同上)扩增验证．选取GD11α–羟化活性最高的转化子作为后续实验的出发菌株．1.2.3 重组菌株的摇瓶培养出发菌株于新鲜 YPD平板上三区划线，30,℃培养 48,h，挑单菌落于 30,mL YPG 液体培养基中，30,℃、220,r/min培养 24,h，移取 1,mL种子液到50,mL BMGY 培养基中，相同条件培养至 A600＝17．4,℃、5,000,r/min离心 5,min，收集菌体并转接到BMMY 培养基中，调节起始 A600＝8，相同培养条件下诱导目的蛋白表达．每24,h补加甲醇0.5,mL以维持诱导．1.2.4 重组蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹实验(Western blot)分析离心收集出发菌株24、48、72,h发酵液分析蛋白表达水平．将细胞分装于离心管中，加入等体积酸洗玻璃珠，涡旋 40,s，冰上放置 40,s，重复 15次．4,℃、12,000,r/min离心 10,min，并将上清液转移至干净容器中，准备 SDS-PAGE分析．按 Takara产品目录配制 12%,的分离胶，浓缩胶为 5%,的蛋白胶．取20,μL蛋白上清液与5,μL 5×loading buffer混合，沸水浴10,min，准备电泳样品．上样完成后进行电泳操作，直至loading buffer指示剂前沿迁移至凝胶底部时结束电泳．然后将蛋白胶放入考马斯亮蓝染色液中，染色1,h．弃去染液，加入脱色液，脱色至蛋白条带清晰可见．电泳结束后，取出 SDS-PAGE蛋白胶置于容器中，加入转膜液．剪取与蛋白胶相同大小的硝酸纤维素膜及滤纸 8张，置于清水中 2,h后，取出浸于转膜液中．依次将 3层滤纸、蛋白胶、硝酸纤维素膜以及3层滤纸置于半干式转移电泳槽中，压平避免产生气泡．恒流80,mA下进行转膜1,h．用适量TBS缓冲液清洗转膜后的硝酸纤维素膜10,min后，置于清水中，加入适量丽春红进行染色．室温下将膜浸于封闭液中封闭处理2,h，加入抗His标签鼠单克隆抗体(稀释5,000倍)，4,℃孵育过夜．封闭完成后，弃去一抗封闭液，然后依次用 TBST清洗膜 2次，每次10,min，TBS 清洗膜 1次．同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2,h．经 TBST脱色，TBS清洗后，PVDF膜用Odyssey红外激光成像系统(美国LICOR公司)进行成像．1.2.5 重组菌株GD11α–羟化活性检测称取甾体底物 0.05,g溶于 0.5,mL甲醇中．将菌体转接至 BMMY诱导培养基中，同时将预溶于甲醇的底物加入诱导培养基中，30,℃、220,r/min诱导转化72,h，吸取 0.5,mL发酵液至 1.5,mL EP管，并加入0.5,mL乙酸乙酯萃取．剧烈振荡20,s后室温静置10,min．12,000,r/min离心 5,min，吸取50,μL 上层萃取相于1.5,mL EP管，进行后续产物形成分析．1.2.6 转化产物分析方法薄层色谱(TLC)检测定性分析：用直径 0.3,mm的毛细管吸取萃取相 2.5,cm，点样于硅胶层析板上．点样位置距离层析板下边 1,cm，点样间距0.5,cm．在层析缸中，分别加入 1,mL乙酸乙酯和石油醚，混合均匀并饱和30,min后，硅胶板放入层析缸中展开．待溶剂前锋距离基线7,cm时，完成层析，取出放通风厨处挥发掉有机溶剂，放紫外分析仪下观察、拍照．高效液相色谱(HPLC)检测定量分析：将待测萃取样品于通风厨，65,℃挥发掉乙酸乙酯，用 1,mL无水乙腈溶解，过0.22,µm 膜除气泡，存样品于进样瓶．HPLC条件：色谱柱为 C18反向柱(4.6,mm×250,mm，5,μm)，流动相为乙腈水溶液(体积比为80﹕20)，流量 0.8,mL/min，柱温20,℃，进样量10,μL，检测波长254,nm．提取甾体底物诱导条件下的赭曲霉总 RNA，琼脂糖凝胶电泳分析总 RNA质量，28S rRNA和 18S rRNA 两条条带清晰，且亮度比约为 2﹕1，说明提取的 RNA完整性较好．以 cDNA为模板，上、下游引物 PCR扩增 AOH基因，0.8%,琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，结果如图1所示．PCR产物条带清晰单一且大小符合预期．扩增产物经纯化回收后送至华大基因进行测序，测序结果与GenBank中报道的一致．重组质粒的构建如图 2所示．经 EcoRⅠ单酶切、EcoRⅠ/NotⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果如图 3所示．双酶切泳道可见约 9,000,bp大小的载体片段和1,587,bp大小的目的基因片段，说明载体构建成功．重组质粒 pPIC3.5k-AOH经SacⅠ线性化后，电击转化毕赤酵母 GS115感受态细胞．在含 G418的 YPD平板上筛选高拷贝转化子，然后提取基因组，用 1.2.1节中的引物扩增目的基因，琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，可见AOH基因已整合到毕赤酵母GS115基因组中即重组菌株构建成功．按照毕赤酵母表达手册诱导重组蛋白表达，经细胞收集、裂解后，取20,μL蛋白上清液做样，进行SDS-PAGE电泳，结果如图5(a)所示．含空载的毕赤酵母无目的蛋白产生，而含 AOH基因的重组毕赤酵母经 24、48、72,h诱导后，均有目的蛋白产生，相对分子质量为6.12×104．Western blot结果如图5(b)所示，有单一的蛋白条带，与预测目的蛋白大小一致，说明重组菌株可实现重组蛋白的诱导表达．TLC结果如图6所示，含空载毕赤酵母不具有转化GD生成11α-OH-GD的功能，而AOH基因重组毕赤酵母具有该转化功能，在目的产物水平线上有阴影面积形成，并且赭曲霉与重组菌株均形成3种副产物 a、b、c．HPLC 结果如图 7所示，重组菌株样品中11α-OH-GD和GD出峰时间与赭曲霉一致．除此之外，两者均含有 3种副产物峰．该结果表明 AOH基因编码的甾体11α–羟化酶对底物GD的较低反应特异性是造成赭曲霉对底物GD的11α–羟基化特异性低的原因之一．本文从赭曲霉 TCCC41060中克隆了甾体11α–羟化酶基因 cDNA，并连接到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5k，获得了具有催化 GD生成11α-OH-GD的重组毕赤酵母菌株．这表明毕赤酵母 GS115的NADPH–细胞色素P450还原酶可以为赭曲霉C11α–羟化酶提供电子．对GD转化产物分析显示AOH重组毕赤酵母菌株和AOH基因来源的赭曲霉在转化GD时均会形成3种副产物，且TLC和HPLC检测很可能是同样的副产物，而空载体转化的毕赤酵母菌株则不会对底物产生转化作用，亦无类似副产物产生．这些结果提示赭曲霉对甾体化合物的转化特异性较低，主要是由于AOH基因编码的甾体11α–羟化酶自身对底物的羟化反应特异性较低造成的．因此，对AOH基因进行定向改造有望构建用于转化GD的高效工程菌．【相关文献】［1］ Mahato S B，Garai S. 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