玻璃化冷冻卵母细胞及卵巢组织研究进展
女性生育力保存和保护的热点问题
女性生育力保存和保护的热点问题的种类与应用生育力保存技术主要包括卵子冷冻、卵巢组织冷冻、卵巢切片冷冻、卵泡切片冷冻等方法。
这些方法可以为患有生殖系统疾病或即将接受化疗、放疗等治疗的女性提供保护，使她们在治疗后仍然有可能怀孕。
此外，这些技术也可以为有计划推迟生育的女性提供选择，以便在未来的生育期间使用保存的卵子或组织。
随着技术的不断进步，这些方法的成功率和安全性也在不断提高。
2生育力保护对青少年和儿童的重要性青少年和儿童的生育功能尚未完全发育，但某些疾病或治疗可能会对其生育功能产生不可逆的影响。
因此，对于患有这些疾病或即将接受治疗的青少年和儿童，生育力保护非常重要。
这些方法包括卵巢组织冷冻、卵泡切片冷冻等，可以在治疗前采取措施，以保护他们未来的生育功能。
尽管这些方法的安全性和成功率尚未得到充分证明，但它们已经成为了青少年和儿童生育保护的重要手段。
3生育力保护的伦理和法律问题生育力保护涉及到一些伦理和法律问题，例如对于未成年人的决策权、对于保存的卵子或组织的处置等。
此外，一些国家的法律也对生育力保护进行了规范，例如对于保存期限、使用条件等的规定。
在进行生育力保护时，必须遵守相关的伦理和法律规定，以保障患者的权益和社会的公正。
4生育力保护的经济问题生育力保护需要耗费大量的时间和金钱。
例如，卵子冷冻需要进行多次取卵和冷冻，费用较高。
而对于一些家庭来说，这些费用可能是难以承担的。
因此，为了使更多的女性能够受益于生育力保护，需要制定相应的政策和措施，以降低费用并提高保障范围。
总之，生育力保存和保护已成为全球关注的热点问题，对于患有生殖系统疾病或即将接受治疗的女性、青少年和儿童来说，这些技术可以提供保护，使他们有机会获得后代。
在进行生育力保护时，需要遵守相关的伦理和法律规定，并制定相应的政策和措施，以降低费用并提高保障范围。
胚胎冻存是一种常用的生殖医学技术，特别适用于肿瘤患者。
该方法通常在化疗或放疗前10~14天获取卵母细胞进行体外受精，并冷冻保存胚胎，以保存患者的生育能力。
胎牛血清联合FSH对玻璃化冻存小鼠卵巢的保护作用
胎牛血清联合FSH对玻璃化冻存小鼠卵巢的保护作用苏芹;裴承斌;张淑雅;罗晓强;徐荣荣;王燕蓉;裴秀英【摘要】目的观察玻璃化冻存液中联合添加促卵泡刺激素(follicle-stimulatiny hormore,FSH)与胎牛血清对卵巢的保护作用,为优化卵巢玻璃化冷冻保存技术提供科学依据.方法将3周龄雌性ICR小鼠卵巢分为新鲜对照组(FCG)、空白对照玻璃化冻存组(B-VCG)、FSH干预玻璃化冻存组(FSH-VCG)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)干预玻璃化冻存组(FBS-VCG)、FBS联合FSH干预玻璃化冻存组(FBS+FSH-VCG)5组,采用卵泡计数方法计算正常卵泡率,采用免疫组织化学方法及蛋白免疫印迹技术观察凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达.结果 FBS+ FSH-VCG组的正常卵泡百分比高于B-VCG组(P=0.012),FBS+ FSH-VCG组和FBS-VCG(P=0.751)和FSH-VCG(P=0.693)组比较差异无统计学意义(P＞0.05);与FCG 组相比,玻璃化冻存各组卵巢组织内的凋亡蛋白Bax表达均升高(P均＜0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达均减少(P均＜0.05);与B-VCG组比较,FBS-VCG、FSH-VCG和FBS+ FSH-VCG组的Bcl-2蛋白表达较高(P均＜0.05),Bax蛋白表达率较低(P均＜0.05);在FBS+ FSH-VCG组中,Bcl-2/Bax比值大于1,Bcl-2表达占优势,与B-VCG组相比差异有统计学意义(P=0.034),FBS+ FSH-VCG组与FCG组Bcl-2表达相似.结论小鼠卵巢组织玻璃化冻存过程中胎牛血清和FSH的添加可以减少对卵巢组织的冷冻损伤,提高正常卵泡百分比,二者联合添加对卵巢的保护效果最好.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2016(038)006【总页数】6页(P629-633,封2)【关键词】玻璃化冻存;小鼠卵巢;正常卵泡百分比;胎牛血清;FSH Bcl-2/Bax【作者】苏芹;裴承斌;张淑雅;罗晓强;徐荣荣;王燕蓉;裴秀英【作者单位】宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室/宁夏生殖与遗传重点实验室,银川750004;宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室/宁夏生殖与遗传重点实验室,银川750004;宁夏医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系,银川750004;宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室/宁夏生殖与遗传重点实验室,银川750004;宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室/宁夏生殖与遗传重点实验室,银川750004;宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室/宁夏生殖与遗传重点实验室,银川750004;宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室/宁夏生殖与遗传重点实验室,银川750004;宁夏医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系,银川750004【正文语种】中文【中图分类】R588.6近年来，通过卵巢组织的深低温冻存及解冻后的卵巢组织移植，为接受肿瘤放、化疗治疗的女性提供生殖保险备受国内外学者的关注。
“冻卵”可以保存生育能力？
核心提示：据日本时事通信报道，日本生殖医学会上月26日决定，准许为将来备孕的单身女性冷冻并保存自身卵子。
这一举措一方面是为了应对担心自身卵子随着年龄增长而老化的单身女性群体，另一方面也是为了防止无限制冷冻等医疗失序现象的发生。
这项技术的在国内应用情况如何？大龄女青年是否都可以通过这项技术保存自己的生育能力？“冷冻”会对卵子有伤害吗？“冷冻卵子”是否可以培育出试管婴儿？医学上如何“取卵”？具体花费有多少？“冷冻宝宝”、“时光婴儿”是否都健康呢？带着这些问题，39健康网采访了中山大学附属第六医院生殖医学中心副主任方丛教授。
本文指导专家：中山大学附属第六医院生殖医学中心副主任方丛教授未婚大龄女青年是否都可以去“冻卵”？国内“冻卵” 必须要有医学指征前不久一则38岁美剩女，求“冻卵”遭拒的新闻在网上流传(新闻详细>>>)，对此，方丛教授指出，在国内，要做冷冻卵子必须有严格的医学指征。
冷冻卵子，俗称“雪藏卵子”、冻卵，即取母体健康时的卵子冷冻，阻止卵子随人体衰老，待想生育时取出冷冻的卵子使用即可。
目前“冻卵”属于辅助生殖范畴，通常针对有肿瘤疾病、需要进行放疗或化疗等治疗手段的，或是由于不孕需要做试管婴儿手术而提取了卵子的，只有以上情况方可以对生育能力进行“保存”。
具体指女性肿瘤患者进行放、化疗前(同时这个患者有可能长期生存)需要保存生育力而采取冷冻卵子，通常的做法是卵巢里的不成熟卵子抽出在体外培养成熟后冷冻保存，或者将卵巢取出冷冻组织，待肿瘤愈后再解冻进行辅助生育。
此外“冻卵”也适合于有不孕症的妇女在取卵当日由于各种原因不能提供精子而采取的办法，此类申请“冻卵”的女性必须持有结婚证、生育证、身份证，否则医院不得接受申请。
大龄女星青睐“冻卵”似乎成为了一股潮流，网上纷传林志玲、舒淇、林心如等明星拟“冻卵”，民间也有不少大龄单身白富美欲求效仿，对此，方丛教授坦言，“潮流”不可盲从，适时自然生育才是首选，而年老者更不适宜“冻卵”。
人类卵巢组织的冷冻保存
［ ｂｔ ｃ ｈ ｙｐ ｓｒ ｔ ｎ ｆｖｒ ｎ ｉ ｕ ｎ ｅ ｏ ｒｌ ｄ ｎ ｏｒ ｅ ｕｃｏ ｒ ｏ ｅ． ｏ Ａ ｓ ａｔ ｅ ｒ ｒ ｅ ａｏ ａ ａ ｓ ｅ ａ ｓ ｒ ｆ ｔｉ ａ ｄｃｉ ｎｔｎ ｏ ｗｍ ｎＮ ｗ ｒ ］Ｔ ｃ ｏ ｅ ｖ ｉ ｏｏ ｉ ｔｓ ｃ ｒ ｔ ｅｅ ｉ ｙ ｎ ｅ ｔ ｎ ｆ ｉ ｆ
初动力．
进入 ２ 世纪 的今天 ，凡是可能发生卵巢损伤 １ 的患者都可 依靠 冷冻 技术 保存 其生殖 内分 泌功 能 ．本 文对 卵巢 组 织 冻 融技 术 的研 究 现状 及 目前 仍存在的问题作一综述．
１ 国 内外 研 究 进 展
１１ 冷 冻 方 案 ．
根据冷冻生物学原理 ，组织细胞在冷冻过程 中易遭受两种冷冻伤害 ：（）细胞内冰晶的形成 １ 造成对细胞 的机械损伤 （ 可称为胞 内冰晶损伤） ； （） 冷 冻 过程 中细 胞 脱 水 ，造 成 细 胞 内的 电解 质 ２ 浓度与渗透压升高 ，因而伤害到细胞 （ 可疗 离子射线可 使许 多女性 的卵巢受损 ，导致绝 经 、卵巢早 衰 、 不孕等并发症．有些患者即使 以后怀孕 ，仍然会 发生流产 、早产 、低体重儿等产科并发症［ １ １ ，极大 的影 响着女性患者的生活质量 和身心健康．因此 如 果 在抗 癌 治 疗 前 通 过冷 冻技 术先 将 卵 巢 组 织 冷 冻保存起来 ，待治愈后再移植 回患者体 内 ，将使 患者卵巢功能得 以保存 ，还可使患者 免受 由激素 替代疗法带来 的许多副作用 ，如乳腺癌 、子 宫内 膜 癌 等 ． 这 也是 人 类 研究 卵巢 组 织 冷 冻技 术 的最
【 作者简介】陈二花 （９０～） １８ ，女 ，山西 怀仁县人 ，在读硕士研究生 ，主要从事不孕症及女性生殖健康研究工作．
胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术
➢ 冷冻过程
快速冷冻法
由室温开始以1℃/min的速度降至-5~-7℃诱发结晶，在此 温度下平衡10min℃，然后以0.3℃/min的速度降至30℃~40℃，投入液氮保存。
一步冷冻法
牛和山羊目前仍处于试验阶段
牛7日龄囊胚可在2.1mol/L甘油、0.25mol/L蔗糖混合液中 室温下脱水2min，将装有胚胎的细管垂直放在液氮罐颈部 5min，结晶后投入液氮。
非渗透性保护剂
这是一类大分子化合物，能溶于 水，性 保护剂促使细胞脱水，减少细 胞内冰晶形成；组成玻璃化液 时，可有效降低渗透性保护剂 的分子浓度、可使发生玻璃化 的相变温度升高、可促进胞质 及保护液玻璃化；解冻时，为 卵母细胞和胚胎提供一个高渗 环境，避免水分进入胞内过快 而产生的渗透性破裂。
冷冻方法
一、卵母细胞的冷冻 保存
➢ 卵母细胞的获得 活体卵巢采卵 屠宰动物卵巢采卵
1.抽吸法 2.切割法 3.剥离法 刀片切割卵巢可采取卵巢 内部卵泡
➢ 卵母细胞的分级与筛选 牛的卵母细胞可分为以下几个等级：
1. A级：外周有3层以上致密卵丘细胞，卵母细胞胞 质均匀并充满于透明带内。
2. B级：外周有1~3层卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀。 3. C级：卵丘细胞扩散，卵母细胞胞质不均匀。 4. D级：无卵丘细胞的裸卵，细胞质不均匀，且有
➢ 细胞的冷冻保存并不在于能 否长期耐受低温，而是在于 冷冻和解冻时对细胞的致死 性作用（致死性温区-50~15℃）
一、胚胎和卵母细胞在低温冷冻保存过程中 的受损机制
➢ 在冷冻过程中，冰晶首先在细胞外液中形成，此时冰晶与 溶质分离，使细胞外液浓度升高、渗透压增加，细胞内水 分渗出产生溶液效应。
➢ 随着温度继续下降，细胞外冰晶不断形成，未冻结部分的 溶液浓度增加，细胞内外的渗透压差增大。这时可能发生 两种情况：
三种冷冻方法对人卵巢组织卵泡形态和凋亡的影响
三种冷冻方法对人卵巢组织卵泡形态和凋亡的影响赵淑芹;仇雪梅;丁晨;王磊;黄淑娟;马兆文【摘要】目的：探讨两步法冷冻、玻璃化冷冻和程序化冷冻法冻融人类卵巢组织的冷冻效果，以期探索更优的卵巢组织冷冻方案。
方法收集6例人卵巢组织，每例修剪成4块，分别随机分配到两步法冷冻组（A 组）、玻璃化冷冻组（B 组）、程序化冷冻组（C 组）和新鲜对照组（D 组），组织学分析4组卵泡形态学变化，并通过 TUNEL 法评估卵泡的凋亡情况。
结果两步法冷冻组始基卵泡和初级卵泡的异常形态卵泡率比玻璃化冷冻组和程序化冷冻组明显降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。
玻璃化冷冻组始基卵泡异常形态率低于程序化冷冻组（P ＜0.05），初级卵泡异常形态率两组差异无统计学意义（P ＞0.05）。
各冷冻组卵巢皮质中始基卵泡的凋亡差异均无统计学意义（P ＞0.05）。
卵巢间质细胞中，两步法冷冻组间质细胞凋亡率较玻璃化冷冻组和程序化冷冻组明显降低，差异有统计学意义（P ＜0.05），玻璃化冷冻组和程序化冷冻组差异无统计学意义。
结论人体卵巢组织冻融后大部分卵泡形态保持正常，两步法冻存效果优于玻璃化冷冻法和程序化冷冻。
%Objective:To compare the cryopreservation effect of two-step freezing,vitrification and slow programmed cooling in order to explore a more effective method for human ovarian tissue cryopreservation. Methods:6 samples of adult ovarian tissue were collected and divided into 4 groups randomly:the two-step freezing group,the vitrification group,the slow programmed cryopreservation group and the fresh group. Stromal cells and follicles in ovarian cortical tissues were ana-lyzed by histological analysis. Follicles apoptosis were analyzed by TUNEL assay. Results:Thetwo-step freezing group showed a significant lower percentage ofabnormal morphology of follicles(Primordial and Primary)than the vitrification group and slow programmed cryopreservation group. In the percentage of abnormal morphology of primary follicles,the vitri-fication group showed no significant differences with the slow programmed cryopreservation group,and showed a significant lower percentage of abnormal morphology of primordial follicles than the slow programmed cryopreservation group. In the percentage of apoptotic follicles,there was no significant difference among three cryopreservation groups(P > 0. 05). In o-varian stroma cells,the two-step freezing group showed a significant lower apoptotic percentage than the vitrification group and slow programmed cryopreservation group,and there was no significant difference between the vitrification group and the slow programmed cryopreservation group. Conclusion:Morphology of most follicles can remain normal after human ovarian tissues are frozen and thawed,and the two-step freezing method is better than vitrification and slow programmed cooling.【期刊名称】《泰山医学院学报》【年(卷),期】2016(037)003【总页数】4页(P241-244)【关键词】卵巢组织;玻璃化冷冻;两步法冷冻;程序化冷冻;人【作者】赵淑芹;仇雪梅;丁晨;王磊;黄淑娟;马兆文【作者单位】枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东枣庄 277100;枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东枣庄 277100;枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东枣庄 277100;枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东枣庄 277100;枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东枣庄 277100;枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东枣庄277100【正文语种】中文【中图分类】R711卵巢组织的冷冻保存为肿瘤患者，或患有卵巢早衰等其他疾病的患者提供了保存自身生殖内分泌功能及生育能力的可能性。
2022女性生育力保存技术全文
2022女性生育力保存技术（全文）随着全球生育力呈现出明显下降的趋势，中国的生育力下降也已经成为比较严重的社会问题。
女性肿瘤患者的一些相关治疗，例如化疗、盆腔放疗、造血干细胞移植、涉及卵巢的手术治疗都可能对生育力造成显著的损伤。
而非肿瘤疾病，主要涉及顽性免疫性疾病、需造血干细胞移植的良性血液性疾病、早发性卵巢功能不全（prematureovarian insufficiency , POI）相关疾病,虽然只占女性生育力保存需求的8%~19% ,但仍然值得我们关注。
目前女性生育力保存相关技术主要涉及胚胎冷冻、卵子冷冻、卵巢组织冷冻及相关衍生技术如卵母细胞体外成熟、卵泡培养等。
1胚胎冷冻及卵子冷冻冻融胚胎移植技术已存在30余年，目前冻融胚胎移植与新鲜胚胎移植妊娠率无明显差别，是已婚育龄女性进行生育力保存的有效方法。
根据国内外生育力保存指南建议，卵母细胞冷冻保存和胚胎冷冻保存一样，都是生育力保存的一线治疗方案，主要针对无配偶的未婚女性。
在我国，胚胎冷冻和卵子冷冻均是以玻璃化为主流的冷冻方法，已经基本代替了程序冷冻法。
对于安全性，从目前的研究随访结果来看，冻融胚胎移植周期除文献报道可能出现新生儿体重高于新鲜胚胎移植外，围产期母儿并发症及新生儿出生缺陷并没有明显的增加。
根据《冷冻胚胎保存时限的中国专家共识》，胚胎冷冻6年内不影响妊娠结局，但尚无足够证据证实胚胎冷冻保存时间超过6年对冻融胚胎移植安全性有影响。
目前也无证据表明长期保存玻璃化冷冻卵子存在安全性问题。
女性卵子冷冻时的年龄与活产率密切相关，35岁以下女性冷冻卵子的活产率随着冷冻卵子数的增多而持续增高，大于35岁女性冷冻卵子累计到20枚其活产率将不再增加。
2卵巢组织冷冻卵巢组织冷冻适用于青春期前的儿童或需紧急生育力保存的患者。
对于已接受化疗的患者，相较于胚胎冷冻与卵子冷冻而言，更推荐选择卵巢组织冷冻，其原因是化疗对于分裂活跃的细胞具有更加明显的毒性作用，而对始基卵泡相对不敏感。
女性生育力保存
• IVM可以用于肿瘤患者，不耽误肿瘤相关治疗，没有肿瘤播散的风险， 是肿瘤患者保护生育力的有效途径。
四、卵巢组织冷冻与移植
• 随着冷冻技术的发展，20世纪末有多项研究发现卵巢组织冻存解冻后可以恢
复正常卵泡形态。此后，卵巢组织冻存移植技术开始应用于临床。自2004年
其他冷冻保护剂（大分子物质）
维持胶体渗透压；降低胚胎透明带损伤的机会；提高冷冻液的黏滞 系数： 白蛋白、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐、羟乙基淀粉
冷冻损伤机制
LOG O
1
冰晶形成
2 冷休克
冷冻损伤机制
3 溶质效应
4 重结晶
5 渗透性休克
冷冻损伤机制
“冰晶效应”：低温显微镜与高速摄影仪的完美组合（小鼠）
卵巢组织冷冻与移植
2016首例冻存卵巢组织移植报告
2018国内首次冻存卵巢组织移植成功报道
卵巢组织冷冻与移植
流程 卵巢组织提取→ 皮质层切片→ 脱水 → 加入冷冻保存剂→-196℃液氮保存 →“唤醒”卵巢组织→ 自体移植
共识
生殖专家
肿瘤专家
妇科专家
血液专家
风湿免疫专家
遗传专家
包括精子保存，睾丸和附睾 组织的保存。（常规冷冻、 单精子和稀少精子冷冻’）
卵子/胚胎保存
慢速/快速玻璃化冷冻卵子 （成熟，未成熟）、卵裂 期胚胎（D2/D3/D4）、 囊胚期（3期、4期、5期、 6期）。
卵巢组织保存
是青春期前女性和癌症治 疗无法被延迟的保护女性 唯一生育力的方法
其他方法
如放射治疗前的卵巢移位， 生殖干细胞移植等
国内首例生育力保存技术
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ
ＧＡ ０ Ｊｉｎｇ，ＣＡ，Ｘｉａ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｃｅｎｔｅｒ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＧＡ ０ Ｊｉｎｇ）；Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ矿Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ，ｔｈｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＸｉｎｊｉ犹ｇ
细胞［２Ｊ的生存率和胚泡形成率。玻璃化冷冻前预平
但不影响卵子冷冻过程中的脱水，也不影响卵子的 再水化．包被的颗粒细胞对ＭⅡ期卵子的冷冻起一 定的保护作用。
卵巢组织玻璃化冷冻
衡时间及温度及膜渗透性会影响冷冻效果．寻求各 参数的平衡点对获得好的预平衡效果十分必要。
二、玻璃化冷冻保护剂的应用及改进
常用细胞内冷冻保护剂有：ＤＭＳＯ、甘油、丙二 醇（ＰＲＯＨ）、ＥＧ等，细胞外冷冻保护剂有蔗糖、海藻 糖等。多数学者认为，ＥＧ＋ＤＭＳＯ和大分子糖类是比
冻样本的体积。可更容易玻璃化。近期Ｆｕｊｉｈｉｒａ等［ｓ］ 研究发现．去除卵丘细胞的冷冻并不影响卵母细胞 复苏后的存活率。但可降低其胚胎的发育能力。
Ｐｕｐｐｅｎ．Ｌｉｎｇｈａｍ等对卵丘颗粒细胞研究表明，其不
寻找最适平衡时间也有助于改善冷冻效果。有研究 发现，采用逐步平衡法或洗脱法有助于改善冻融后 鼠ＧＶ期卵细胞、人ＭⅡ期卵细胞及人３一原核期卵
细胞骨架、膜完整性等的损伤。自玻璃化冷冻鼠胚
胎首次成功后，该技术已广泛应用于卵母细胞和卵 巢组织的冷冻。 玻璃化冷冻人卵母细胞 Ｙｏｏｎ等将体外受精一胚胎移植（ＩＶＦ．ＥＴ）患者
早在１９７３年。Ｌｕｙｅｔ就证实液体的凝同可分为 两种形式：一种是晶体化，液体中的分子呈有序排 列；另一种为非晶体化即玻璃化，液体中的分子呈 无序排列．保持未凝同前的状态。玻璃态介于液体
存活率不高。
万方数据
・２４３・
一、玻璃化冷冻载体和程序的改进 玻璃化冷冻技术主要是以提高冷冻和解冻的 速率为基本目的。共同特点就是采用微小冷冻载
着于染色体的纺锤体的微管蛋白在冷冻过程中易
受温度变化及保护剂的影响而发生解聚，妨碍姐妹
染色单体分离．导致染色体分裂异常，卵细胞受精 后将导致染色体非整倍化、双精子受精及卵裂抑 制。有研究发现，冷冻后的卵细胞通过孵育，微管会 以一种时间依赖性的方式重新聚合。适当的孵育，
适时受精，纺锤体的结构和功能恢复，将有助于正
体，尽可能减少保护液的用量以提高速率。快速降
温有利于玻璃化形成，所以为提高热传导性采用各 种载体，主要有麦管、拉细麦管（开放、封闭）、拉细 玻璃管、铜环、尼龙环、电子显微镜栅以及无载体微 滴法。Ｌｕｃｅｎａ等【１］采用１５％乙二醇（ＥＧ）＋１５％－－＂甲 基亚砜（ＤＭＳＯ）＋０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖为保护剂，微滴法 （Ｃｒｙｏｔｏｐ）进行卵细胞玻璃化冷冻，解冻后做胞浆内 单精子注射（ＩＣＳＩ），７２ ｈ后移植。结果发现：卵细胞
四、卵母细胞外围结构影响及其处理方法 改进 多数学者认为，虽然卵丘细胞对卵母细胞具有 分泌支持作用。但需把卵丘去除到相同的程度，以
便冷冻保护剂的加入和取出能够同步化，避免由于
卵母细胞的个体不同而使保护剂渗入和去除的水 平参差不齐而无法确定适宜的冷冻剂平衡时间。同
时去掉一部分卵丘细胞可以在一定程度上减少冷
一、冷冻前卵巢组织的处理 组织块的厚度过大影响保护剂的渗透，过小易 造成卵泡破坏过多。并且产生无用的组织块。目前
万方数据
对组织切片的处理大部分剪成厚约１ ｍｉｌｌ．表面积
１ ｉｎｌｎ２—１
应用前景及展望 一、卵母细胞玻璃化冷冻的应用前景
ｃｍ２的大小。厚度不超过２ ｍｍ。Ｓｃｏｔｔ等［８］冷
冻不同形状的人类卵巢组织块及组织切片．解冻后 进行体外培养，在７ｄ。呈立方体的组织块出现较多的
与胚胎植入前的人未成熟卵细胞及受精卵发育【４］。
ＧＶ期卵细胞相对成熟卵母细胞来说有比较低的冷
冻后染色体异常率，但其发展依赖于体外成熟技术
的发展。ＧＶ期卵母细胞的玻璃化冷冻并不影响核 成熟或者内质网的连续性。但是正常胞质的成熟会 因内质网的重聚而受阻断［引。
良好的临床效果。微滴玻璃化冷冻（ｓｓｖ），因液滴的 体积仍不是很小，细胞易被污染，不易标记，降低了 推广价值。开放式拉细麦管法（ｏＰｓ）冷冻虽提高了 冷冻及解冻速度，但难以拉制，在液氮中容易炸裂。 浮起。解冻方面，在许多实验里成功地使用过高速 率的解冻方法，即将细胞直接投入解冻液中进行解
ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ
ｔｏ
ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｒｅ
ｎｅｗ
ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ
ｔｈｅ ｃｌｏｓｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｏｖａｒｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｏｃｙｔｅ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｉｓ
（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ，ＰＶＰ）、聚乙二醇（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ
亦有文献报道在慢速冷冻中可通过增加蔗糖浓度
的方法达到类似玻璃化冷冻后效果［１２］。近年来成熟
卵母细胞的玻璃化冷冻有了显著成效，但其成功率 仍低于胚胎冷冻。自该项技术应用于临床的２０年 来。有一百余名婴儿出生。可以说仍处于实验阶段［１３】。 虽然结果鼓舞人心，但技术的有效性仍需评价，尤 其是高浓度冷冻保护剂的影响和标本直接与液氮 接触带来的污染问题。还有各种冷冻技术带来的一 定遗传风险都决定今后研究方向应为冷冻方法的 优化与安全性。在卵母细胞的冷冻过程中，阻止细 胞内形成的冰晶造成的损伤曾是冷冻技术的瓶颈 问题，现在随着玻璃化技术逐渐为人们接受和认
于人卵母细胞冷冻并获得成功，迄今为止卵母细 胞冻融技术已探索近二十年。但因卵母细胞具有 胞质丰富、表面积／体积比值小等特点．冷冻过程
中纺缍体及细胞骨架的易受损伤性，所以解冻后
由于其质点不规则排列，能始终保持溶液的水分子
作者单位：８３００５４乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院生殖 助孕中心（高静现在武警新疆总队医院妇产科）
・２４２・
・综述・
玻璃化冷冻卵母细胞及卵巢组织研究进展
高静综述蔡霞审校
【摘要】玻璃化冷冻技术近年已广泛应用于生殖领域，尤其是在女性生育力的储备方面展示其特
有的优势。目前胚胎玻璃化冷冻已较成熟，并应用于临床。首次卵母细胞玻璃化冷冻的成功以及实验动物 卵巢组织成功移植并获得分娩给研究带来无限希望，但目前仍处于实验阶段。研究者企图从不同角度解 决难题。卵母细胞冷冻后，细胞结构的易损伤性造成的低复苏率．以及对卵巢组织玻璃化冷冻的可行性探 索，对生殖领域提出新挑战。由于卵巢组织冻存与卵母细胞的冻存有着密不可分的联系，就两者国内外新 进展做综述。
活婴的病例。
如冷冻保护因子（ＧＳＦ）在使用浓度为０．０１％时可使 冷冻存活率增加１９％一３１％。较低浓度的抗冻蛋白 可通过与氢原子结合附着在冰核表面。阻止水分子 形成冰晶。如果用这些新型的无毒抗冻剂冷冻卵母 细胞，卵母细胞的冷冻保存将进入一个新阶段。
三、细胞骨架的损伤及其保护 成熟的卵细胞正处于第二次减数分裂中期，附
ｓｕｃｃｅｓｓ
ｏｆ ｏｏｃｙｔｅ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．ｂｕｔ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｉｓ ｓｔｉｌｌ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｗｉｔｈ
ｓｕｃｃｅｓｓ ａｌｅ
ｄｅｈｖｅｒｙ ｂｒｉｎｇ ｍｏｒｅ ｈｏｐｅ
和晶体之间，跨膜物质浓度和渗透压差别不大，细 胞膜不易损伤。在玻璃化冷冻过程中，高浓度冷冻 保护剂在冷冻过程中同化，形成无结构的玻璃态，
多余的卵细胞进行玻璃化冷冻：玻璃化保存的卵
细胞解冻后妊娠率为２１．４％，每次胚胎移植种植
率为６．４％（８：１２５），认为用玻璃化法保存人类卵
细胞可行。１９９９年Ｋｕｌｅｓｈｏｖａ等首先应用玻璃化
ｏｎ
Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｏｃｙｔｅ ａｎｄ Ｏｖａｒｉａｎ Ｔｉｓｓｕｅ
Ａｒｍｅｄ Ｐｏｌｉｃｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ
ｏｆＸｉｎｊｉ舰ｇ，Ｕｒｕｍｑｉ ８３００５４，Ｃｈｉｎａ（ＣＡＩＸｉａ）
ｒｅｃｅｎｔ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ
常受精及冻存卵细胞的发育。Ｒｈｏ等［３］认为。细胞松 弛素Ｂ和２．巯基乙醇能增加冷冻保存过程中牛成
熟卵细胞微管的稳定性。紫杉醇（Ｔａｘ０１）是一种细胞 骨架保护剂。有研究指出。紫杉醇可以促进冻融后
冻融后存活率达９６．７％。受精率８７．２％，卵裂率
９４．３％．妊娠率５６．５％。Ｃｒｙｏｔｏｐ法玻璃化冷冻是一种 高效、快速、经济的人卵细胞冷冻保存方法．并具有
ｙｅａｒｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｉｔｓ
ｕｎｉｑｕｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｍａｌｅ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．Ａｔ ｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｈａｓ ｂｅｅｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｍｏｒｅ ｍａｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｏｖａｒｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ
冻（即升温从一１９６℃至３７℃，升温速度为７５ ｏＣ／ｓ）。 另有研究表明。采用２．５ ｍｉｎ的四步法解冻人卵的 效果优于５ ｍｉｎ的四步法。Ｈｏｎｇ等应用四步法玻璃 化冷冻人类成熟卵细胞．以２．５ ｍｉｎ时间间隔和５ ｒａｉｎ时间间隔为速率复温后比较发现．２．５ ｍｉｎ时间 间隔比５ ｍｉｎ时间间隔对植入前胚胎发育更有效。
Ｐｌａｎ，２００９，２８：２４２—２４５）
近年来随着玻璃化冷冻方法的应用，卵母细胞 冷冻后的妊娠率有了阶梯性提高的同时。也为卵巢 组织的冻存提供新思路。这为女性生殖能力的贮存