两相溶剂萃取法
《双水相萃取技术》课件
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
双相萃取方法
双水相萃取过程的步骤：
双水相 分配
图3.1 双水相萃取的工艺流程图
细胞匀浆液
PEG
第一 步双 水相 萃取
+盐（或是葡聚糖）
分离机
下相 细胞碎片 杂蛋白 （核酸、多糖）
上 相（PEG相） （目标产物）如prot、E +盐 第二步双水相萃取
静置分层 下 相（盐相） 核酸多糖 上 相（PEG相） 目标产物
2.5.双水相萃取分离影响因素
2.5.5温度的影响 分配系数对温度的变化不敏 感，这是由于成相聚合物对 蛋白质有稳定化作用，所以 室温操作活性收率依然很高， 而且室温时粘度较冷却时低， 有助于相的分离并节约了能 源开支。
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2.6 双水相中的分配平衡
研究表明，生物分子的总分配系数 c
Kp
2
2.5.双水相萃取分离影响因素
2.5.3离子环境对两相体系分配的影响 在双水相体系中加入电解质,由于阴、阳离子在两相中的 分配差异,形成穿过相界面的电位, 从而影响带电大分子 物质在两相中分配。如在PEG/Dextran系统中加入NaClO4 或KI时,可增加上相对带正电荷物质的亲和效应,并使带负 电荷的物质进入下相;
双水相萃取
1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和可溶性 淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶液，随后分成两 相，上相含有大部分明胶，下相含有大部分琼脂(或可溶性淀粉)。 再如下图中，2.2％的葡聚糖水溶液与等体积的0.72％甲基纤维 素钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。
(2)盐的种类和浓度
盐的种类(离子组成)影响蛋白质、核酸等生物大分子 的分配系数，盐浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且 扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。
天然药物化学成分的提取方法
（3）逆流连续萃取法
利用两相溶剂比重不同可自然分层和分散液滴穿过 连续相溶剂时发生传质的原理，用一根或数根萃取 管制成逆流连续萃取装臵。管内的瓷环，增加液滴 上升的路程和在连续相中停留的时间，更重要的是 上升的液滴因撞击填充物而被分散，扩大了两相溶 剂萃取的接触面积，使萃取更完全。
（4）液滴逆流层析法（DCCC）
溶剂的分类
* 强极性溶剂：水 * 亲水性有机溶剂： ������ 能与水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮） * 亲脂性有机溶剂：
不与水任意混溶，可分层（正丁醇及其以后的试剂）
常用溶剂的极性大小顺序： 石油醚<四氯化碳<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮 <乙醇（甲醇）<水
提取溶剂的选择
被提取成分的极性是选择提取溶 剂最重要的依据。
天然药物化学成分的 提取方法
天然药物化学成分的主要类型
1 生物碱：为一类存在于生物体内分子中含有氮原子的有 机化合物的总称；一般具有碱性，可与酸成盐。游离生 物碱具亲脂性；生物碱盐具亲水性。 2 苷类（甙类）：为一类经水解后可产生糖和非糖两部分 的化合物。非糖部分叫苷元。苷具亲水性，苷元具亲脂 性。 3 挥发油：为一类可随水蒸气蒸馏出来的与水不相混溶的 油状液体的总称。具有香味或特殊气味的中药往往都含 有挥发油。挥发油具亲脂性。 以上三类为主要的有效成分类型。
超临界流体萃取的原理
主要是根据超临界流体对物质有很强的溶解能力，且改变温度或 压力即可改变流体的密度、粘度和扩散系数，流体对物质的溶解特 性也随之改变，因此，可将不同性质的成分分段萃取或分步析出， 达到萃取分离的目的。
中药提取常用的超临界流体（二氧化碳）的优点
1. 2. 3. 4. 临界温度（Tc=31.4）接近室温, 热敏成分稳定. 临界压力（Pc=7.37 MPa）不太高, 易操作. 本身呈惰性，与化合物不反应. 价格便宜.
双水相萃取解析
➢ 一般采用室温操作： 成相系统聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋 白质不会发生变性； 常温下溶液粘度较低， 容易相分离； 常温操作节省冷却费用。
4.双水相萃取技术的发展
（1）历史：
➢ 早在1896年，Beijerinck发现，当明胶与琼脂或明胶与 可溶性淀粉溶液相混时，得到一个混浊不透明的溶液，随 之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉）， 这种现象被称为聚合物的不相溶性（incompatibility）； ➢ 20世纪60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A及同事 最先提出了双水相萃取技术； ➢ 1979年，西德的Kula M R等人首次将ATPE应用于生物产 品分离；
➢大量研究表明：生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统 间的各种相互作用，主要有静电作用、疏水作用和亲和作用等， 其分配系数可为各种相互作用之和。
ln m ln me ln mh ln ml
①静电作用：两相系统中若有带电溶质存在，会ห้องสมุดไป่ตู้大分子在两 相间的分配系数产生影响。（图5-15） Donnan Potential:当大分子或粒子带有静电荷时，在带有电荷 分配不相等时，就会在两相间产生电位差，称为道南电位。 ②疏水作用：某些大分子物质表面具有疏水区，溶质的表面疏 水性会对其在两相间的分配系数产生影响。
3.影响双水相分配的主要因素
高聚物的相对分子质量 高聚物的浓度 盐的种类和浓度 PH值 温度
（1）高聚物的相对分子质量：
➢在高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的相对分子质 量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如细 胞或细胞碎片和细胞器，将更多地分配于该相。
以PEG-Dextran体系为例，↓Dextran→K↓ ↓PEG→K↑（表5-4）
天然药物有效成分提取分离技术（研）.
天然药物有效成分提取分离技术（研）.天然药物有效成分提取分离技术中草药以植物药为主，⽽植物都是由复杂的化学成分所组成。
其中主要有纤维素、叶绿素、单糖、低聚糖和淀粉、蛋⽩质和酶、油脂和蜡、树脂、树胶、鞣质及⽆机盐等。
其中，许多物质对植物机体⽣命活动来说不可缺少，称为⼀次代谢产物。
⼀般认为它们在药⽤上是⽆效成分或杂质。
⽽另外⼀些化学成分如：⽣物碱、黄酮、蒽醌、⾹⾖素、⽊脂素、有机酸、氨基酸、萜类、苷类等对维持植物⽣命活动来说不起重要作⽤，称为⼆次代谢产物，这些物质在植物体内虽含量很少，多则百之⼏，少则百万分之⼏，甚⾄更少。
但它们往往具有较强的⽣理活性，其中有些已应⽤于临床，我们称之为有效成分。
当然有效成分与⽆效成分的划分是相对的，如天花粉的引产有效成分是蛋⽩质，⾹茹中的多糖对实验动物肿瘤有显著的抑制作⽤。
在进⾏中草药成分提取前，应注意对所⽤材料的原植物品种的鉴定并留样备查。
同时要系统查阅⽂献，以充分了解，利⽤前⼈的经验。
中草药有效成分的提取分离⼀般有下⾯两种情况：第⼀、从植物中提取已知的有效成分或已知的化学结构类型者。
如从⽢草中提取⽢草酸、⿇黄中提取⿇黄素；三棵针中提取黄连素等(提取有效成分)。
或从植物中提取某类成分如总⽣物碱、总酸性成分。
如从银杏叶中提取总黄酮；从⼤黄中提取总蒽醌(提取有效部位)。
⼯作程序⽐较简单。
⼀般先查阅有关资料，特别是⼯业⽣产的⽅法，搜集⽐较该种或该类成分的各种提取⽅法，再根据具体条件加以选⽤。
(注意先重复该⽅法，得到产品后，再结合⽣产实际，不断改进⼯艺，达到⼤⽣产要求)。
第⼆、从中草药中寻找未知有效成分或有效部位时，情况⽐较复杂。
只能根据预先确定的⽬标，在临床或药理试验配合下，经不同溶剂提取，以确定有效部位。
然后再逐步划分，追踪有效成分最集中的部位，最后分得有效成分。
⼀、中草药有效成分的提取对中草药化学成分的提取，通常是利⽤适当的溶剂或适当的⽅法将植物中的化学成分从植物中抽提出来。
两相溶剂萃取法的原理
两相溶剂萃取法的原理两相溶剂萃取法是一种广泛应用于分离纯化化合物的技术，其基本原理是利用两种互不相溶的溶剂，将要分离的化合物从一个溶液中迁移到另一个溶液中。
该技术在化学、生物化学、制药和食品工业等领域中被广泛应用，因为它不仅能够对化合物进行高效分离，而且往往不需要高成本的设备或处理步骤。
选择相互不溶的两个溶剂，并将它们加入到一个混合物中。
两个溶剂中至少有一个会与要分离的化合物相互作用。
接着，将要分离的混合物加入到两相溶液中，并充分混合，直至化合物均匀分布在两个溶剂中。
此时，要分离的化合物将会选择性地从一个溶液中迁移到另一个溶液中。
这是由于化合物在两个溶剂中的溶解度不同，它会选择溶解度更高的溶剂中分布得更多。
将两个溶液分离，并从中提取出所需的化合物。
（1）所选用的两种溶剂的化学性质和物理性质。
（2）溶剂的选择，通常会使用极性大且无毒的溶剂比如乙酸乙酯（EtOAc）、丙酮、甲醇（MeOH）和环己烷等。
（3）溶剂中存在的离子浓度和pH值。
（4）化合物本身的性质，包括其溶解度、极性、分子量、热力学常数等。
（5）反应系统的温度和压力。
需要注意的是，两相溶剂萃取法虽然具有很高的分离效率和选择性，但也存在一些限制。
在有些情况下，多种化合物在两相溶液中的行为可能会比较复杂，这会导致操作难度增加。
该技术还存在一些操纵上的问题，如溶剂的回收、废液的处理、萃取时的剪切力等。
尽管存在这些限制，两相溶剂萃取法仍然是一种性能优良、操作简便的技术，在化学和生命科学等领域中得到了广泛的应用。
两相溶剂萃取法可以用于研究分离和纯化各种化合物，包括无机和有机化合物、天然产物、合成产物、蛋白质、核酸和细胞等。
两相溶剂萃取法已被广泛地用于分离精油、脂肪酸、色素、植物次生代谢物、维生素等天然产物，以及药物、多肽、糖类、核酸等有机化合物的纯化。
在饮料和食品加工中，两相溶剂萃取法还可用于去除苦味物质、调味剂、色素等。
随着科学技术的发展，两相溶剂萃取法的应用也不断扩展。
双水相萃取技术
新型功能双水相系统
温度敏感型双水 相体系
聚合物浓度的影响
聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的 长度为零，此时分配系数为1，即组分均 匀的分配于上下相. 随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合 物的总浓度增大，系统远离临界点，系线 长度增加，两相性质的差别(疏水性等)增 大，蛋白质分子的分配系数将偏离临界点 处的值(K=1)，即大于1或小于1。因此,成 相物质的总浓度越高，系线越长，蛋白质 越容易分配于其中的某一相。
盐的种类影响
在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数， 不同电解质的正负离子的分配系数不同，从而产生不 同的相间电位。由于各相要保持电中性，使得带电生 物大分子，如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。
盐浓度的影响
盐的浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰 乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相 体积比。 例如，PEG/磷酸盐体系中上下相的PEG和磷酸 盐浓度及Cl-在上下相中的分配平衡随添加NaCl 浓度的增大而改变，这种相组成即相性质的改变 直接影响蛋白质的分配系数，如图。 离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这 一特点，通过调节双水相系统的盐浓度，可有效 地萃取分离不同的蛋白质。
lnK=lnK0+lnKe+lnKh+lnKb+lnKs+lnKc
式中，下标e、h、b、s、c分别表示静电作用、疏水作用、生 物专一性、分子大小、形态结构对分配系数的贡献。lnK0是 包括其他因素（盐的水合作用、配体相互作用）在内的分配 系数。
静电作用
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影 响，利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表 达式： lnK=Mλ/RT M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数;R-玻尔兹曼常数；T-绝对温度。 生物大分子物质的M值一般很大，λ的微小变化 会引起分配系数很大的变化。因此利用不同的表面 性质，可以达到快速分离非电介质型的大分子溶质 的目的。
第二章_天然药物化学成分的提取与分离
五、透析法
透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜， 而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的 方法。例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖 等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖 等杂质。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内， 而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而 加以分离精制。透析是否成功与透析膜的规格关系 极大。
蒸气逸出（也叫放气）
静置分层 有机相 絮状物
（乳化） 水相
激烈振摇 1 - 2min
水相和絮状物
有机相
少量多次原则
3～ 5次
二、沉淀法 （一）酸碱沉淀法
利用天然药物中游离酸性（或碱性）成分可与碱性（或酸 性）试剂反应生成盐而溶于水，再加酸（或碱性）试剂，重 新生成原来的游离酸性（或碱性）成分而从溶液中沉淀析出 的性质，滤过（或加有机溶剂萃取）而与其他成分或杂质分 离的一种方法。
适当溶剂
药物 。
常温/温热
浸泡
有效成分
适用于：能溶于水且 遇热稳定成分的提取。
2、煎煮法 药物（加水加热）→煮沸→煎煮液 （煎煮器勿使用铁锅） 注意事项：a、浸没药材b、微沸c、渣继续煎 煮2-3次 小量：首次煮沸20-30分钟 大量：首次煎煮1小时，第2、3次煎煮可酌减
煎煮法与冷浸法的比较：
• 优点：效率高 • 缺点：煎煮液粘稠，滤过困难，杂质多， 易发生霉变
七、分馏法
对沸点相近的混合物，在分馏柱内反复进行气化、 冷凝、回流等程序而分离的一种方法。
第三节 色谱分离法
1906年，俄国植物学家Tswett
目的：分离植物色素 过程：将植物绿叶的石油醚提取液倒入 玻璃管中，并用石油醚不断淋洗， 逐渐形成色带，各色素成分被分离
石油醚
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两相溶剂萃取法
教学目标： 1、掌握分次萃取法的操作过程； 2、熟悉萃取剂的选择原则； 3、了解两相溶剂萃取法的原理。
教学重难点：
1、重点包括萃取剂的选择、分次萃取 法的操作过程和注意事项；
2、难点在于萃取过程中乳化现象的预 防和破坏方法。
复习提问
1、天然药物化学成分主要提取方法有哪些？
二、基本原理
两相溶剂萃取法的理论依据是分配定律。
K=CU/CL
(K表示分配系数，CU表示化学成分在上相溶剂中 的浓度，CL表示化学成分在下相溶剂中的浓度。)
萃取剂
被萃取液
（极性小） （极性大）
＋
A化合物 B化合物
两相混合（不混溶）
A化合物 B化合物
萃取液
A化合物极性﹥B化合物极性 被萃取液
B化合＋A物化合物
取（ A ）次。
A.3-4 B.1-2 C.5-6 D.8-10 E.3-5
5.萃取时破坏乳化层不能用的方法
是（ B ）。
A.搅拌乳化层 B.加入酸或碱 C.热敷乳化层 D.将乳化层抽滤 E.分出乳化层，再用新溶剂萃取
课堂总结
1.基本原理； 2.萃取剂的选择原则；
※ 3.萃取技术。
作业
萃取时一般在什么情况下发生 乳化现象？应如何处理？
混合物
分↓ 离
两相溶剂萃取法 沉淀法 透析法 分馏法 盐析法 色谱法 （重）结晶法
有效成分
↓
鉴定
一、两相溶剂萃取法
是指在提取液（被萃取溶液）中加入一 种与其不相混溶的溶剂（萃取剂），充分 振摇增加两相接触的面积，使原提取液中 的某种成分转溶至萃取剂中，而其他成分 仍保留在原提取液中，待两相完全分层后， 分离两相,又称液-
原理是（ C ）。
A.两相溶剂互溶 B.两相溶剂极性相同 C.两相溶剂互不混溶 D.两相溶剂颜色不同 E.两相溶剂密度有差异
3.萃取剂的选择原则不包括下列哪项（ D ）。
A.互不相溶 D.极性相近
B.较好分层 C.溶解度大 E.分配系数差大
4.萃取次数应遵循“少量多次”的原则，一般萃
谢 谢！
答：溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、超临界流 体萃取法，其中天然药物有效成分最常 用的提取方法是溶剂提取法。
.简述影响提取效率的主要因素有哪些？
答：主要有溶剂的选择、提取技术、浓度 差、天然药物的粉碎度、温度、时间 等，其中选择适宜的溶剂是溶剂提取 法的关键。
【新课导入】
天然药物粗粉
↓
提取
溶剂提取法 水蒸气蒸馏法 超临界流体萃取法
图—萃取原理示意图
三、萃取剂的选择原则
不相混溶 较好分层
根据分离物质的 极性选择萃取剂
K相差越 大越好
四、萃取技术
方法
分次萃取法
逆流连续 萃取法
1.分次萃取法（又称简单萃取法）
梨形分液漏斗
注意检漏、排气、 振摇、静置。
留层
检漏
视具体情况而定
萃取剂 用量
第一次为水提取 液的1/2至1/3
萃取 次数
遵循“少量多次”的 原则，一般3-4次
乳化现象
预防乳化（避免猛烈振摇、改用混合溶剂等）
乳化已形成需及时破坏（7种方法） 严重时可选用逆流连续萃取法
2.连续逆流萃取法
课堂练习
1.两相溶剂萃取法的原理是利用混合物中
各成分在两相溶剂中的（ B ）。
A.密度不同 B.分配系数不同 C.移动速度不同 D.萃取常数不同 E.介电常数不同