去内毒素大量提取
Triton X－114用于去除内毒素的研究
Triton X－114用于去除内毒素的研究吴中华【摘要】目的：探讨规模化生产原核表达重组蛋白的Triton X－114去除细菌内毒素的方法与效果。
方法以大肠杆菌表达的重组人干扰素α2b、重组人生长激素、重组葡激酶蛋白粗提液为原料，采用反复抽提相分离法，研究Triton X－114去除细菌内毒素的效果。
结果经一次Triton X－114抽提，能够去除蛋白粗提液中95％的细菌内毒素，蛋白收率保持85％以上，蛋白性质不受影响。
结论 Triton X －114反复抽提相分离法能够有效地去除细菌内毒素，适合于规模化原核重组蛋白的生产。
%Objective To evaluate an effective method to remove endotoxin with Triton X-1 14 phase separation for E.coli recombinant protein purifications.Methods Triton X-1 14 phase separation was used to remove endotoxin from crude preparations of recombinant human interferon α2b,human growth hormone,and staphylokinase.Results The reduction in endotoxin levels was greater than 95%with Triton X-1 14 phase separation,and recovery of the proteins after endotoxin removal was greater than 85%,meanwhile the charac-teristics of recombinant proteins did not change.Conclusions Triton X-1 14 phase separation is a kind of effective method to remove endotoxin for large-scale E.coli recombinant protein purifications.【期刊名称】《安徽医药》【年(卷),期】2016(020)005【总页数】4页(P848-851)【关键词】洗涤剂;内毒素类;重组蛋白质类/分离和提纯【作者】吴中华【作者单位】安徽省生物研究所，安徽合肥 230088【正文语种】中文大肠杆菌因其遗传背景清晰、操作简便、表达量高，是大量制备结构简单、不需要糖基化的重组蛋白的首选表达系统[1]。
内毒素及其去除
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
亲和层析 以组氨酸 、 组胺、 多粘菌素 B、聚阳离子等为配基
亲和层析
将内毒素底物LAL或多粘菌素 B(PMB)偶联于CNBr-Sepharose 或NHS-Sepharose上,以此介质特 异性吸附内毒素,而让蛋白通过 。
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
亲和层析
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
内毒素是什么
内毒素也称为脂多糖或 LPS，是革兰氏阴性菌 胞壁上一种成分（少数 阳性菌也能产生）。其 细胞壁外膜的外部脂质 成分完全由内毒素分子 组成 ，死亡时则会释 放大量内毒素。一个大 肠杆菌细胞约含有200 万个LPS分子
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
功能部分
浊度变化
浊度法
显色 基质法
0.006-15EU/ml
显色基团吸光度变化
部分药品由 于自身特殊 性无法通过 稀释法消除 干扰，因此 鲎试验还无 法完全取代 家兔热原试 验
缓慢翻转180°，目测 终点
简单,经济, 不需专用测定设 备 特异性不强 精密度、定量性差
简单、快速、灵敏 度高、检测范围宽
精度高、灵敏 度高 仪器和试剂贵,去除方法存在选择性差，样品回收率低等问题。下面主要介 绍几种生产中常用的方法
一
相分离法Triton X-114
二
阴离子交换层析
三
疏水层析与分子筛
四
亲和层析
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
相分离法Triton X-114
此法用于较大重组蛋白质（rCK-bb、Rck-mb）中LPS的去除 ，经过三次相分离后，LPS从104 EU/ml降到了几个EU/ml， 去除率超过97%，蛋白的回收率大于90%。
去内毒素的方法及检查方法
去内毒素的方法及检查方法注：这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。
热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。
其中脂多糖具有很强的热原活性。
由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。
【相关链接】热原的危害一、热原的性质及除去热原的方法1．高温法热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。
因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。
但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。
2．吸附法热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。
由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。
3．超滤法热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用 3.0～15nm超滤膜可将其除去。
4．蒸馏法热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。
5．酸碱法热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。
玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。
6．其它包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
二、热原的检查方法《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。
1．热原检查法由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。
《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
以TritonX114液相分离法去除质粒溶液中的内毒素
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内毒素清除剂成分
内毒素清除剂成分内毒素是革兰阴性细菌细胞壁中的一种成分，它在细菌死亡裂解后释放出来，是引起人体发热、炎症和休克等内毒素血症的主要病原体。
内毒素清除剂是一种能够中和内毒素活性的物质，可以有效减轻内毒素引起的病理反应。
本文主要介绍内毒素清除剂的主要成分。
1.活性炭：活性炭是一种非常有效的吸附剂，能够吸附内毒素、细菌和其他杂质，从而将其从血液中清除。
2.琼脂：琼脂是一种多糖，能够与内毒素结合，减缓内毒素的生物学活性，从而减轻其毒性作用。
3.胆酸：胆酸能够与内毒素结合，形成水溶性的复合物，进而通过胆道排出体外，达到清除内毒素的目的。
4.磷脂：磷脂是一种细胞膜的成分，可以结合并清除内毒素，减轻其毒性作用。
5.IgG抗体：IgG抗体是一种能够识别并结合内毒素的免疫球蛋白，通过与内毒素结合，降低其生物学活性，从而减轻其毒性作用。
6.α-氨基正丁酸：α-氨基正丁酸是一种氨基酸，可以与内毒素结合，抑制其生物学活性，从而减轻其毒性作用。
7.益生菌：益生菌可以通过调节肠道菌群平衡，抑制内毒素的产生和释放，从而降低内毒素的毒性作用。
8.巯基化合物：巯基化合物可以与内毒素结合，抑制其生物学活性，从而减轻其毒性作用。
9.超氧化物歧化酶：超氧化物歧化酶可以清除内毒素释放的自由基，从而抑制其毒性作用。
10.金属螯合剂：金属螯合剂可以与内毒素结合，抑制其生物学活性，从而减轻其毒性作用。
11.氨基酸多肽：氨基酸多肽可以识别并结合内毒素，抑制其生物学活性，从而减轻其毒性作用。
12.中药提取物：中药提取物中的某些成分可以抑制内毒素的产生和释放，从而降低内毒素的毒性作用。
13.其他天然物质：其他天然物质如壳聚糖、透明质酸等也可以结合并清除内毒素，减轻其毒性作用。
总之，内毒素清除剂的成分多样，包括活性炭、琼脂、胆酸、磷脂、IgG抗体、α-氨基正丁酸、益生菌、巯基化合物、超氧化物歧化酶、金属螯合剂、氨基酸多肽、中药提取物以及其他天然物质等。
天根DP117-无内毒素质粒大提试剂盒说明书
For personal use only in study and research; not for commercial use产品简介本试剂盒采用独特的硅胶模吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。
同时采用特殊的溶液P4和过滤器CS1，可有效的出去内毒素、蛋白质杂志；整个提取过程仅需1h，方便快捷。
使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化和细胞转染多种细胞等试验。
推荐每次菌液使用量：高拷贝质粒推荐使用量为100ml，得率一般在500-1500μg左右；低拷贝质粒推荐使用量为200ml，得率一般在200-600μg左右。
注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1.溶液P1在使用前先加入RNase A （将试剂盒中提供的RNase A全部加入)，混匀，置于2-8℃保存。
2.第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇。
3.使用前先检查平衡液BL，溶液P2和P4是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
4.注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖紧盖子。
5.使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤管中抽出，避免滤膜因压力而松动。
6.提取的质粒量与细菌培养浓度，质粒拷贝数等因素有关。
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P4的用量；洗脱缓冲液推荐在65-70℃水浴中预热，可以适当延长吸附和洗脱时间，以提高提取效率。
7.实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。
8.用平衡液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。
质粒DNA 浓度及纯度检测得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
纯化的质粒DNA OD260/OD280通常在1.8-2.0左右，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的实验中。
无内毒素提取质粒原理
无内毒素提取质粒的原理
无内毒素提取质粒的原理主要基于改进的SDS-碱裂解法。
该方法首先通过添加蛋白酶K以及其他缓冲液，使细胞内的蛋白质发生降解和沉淀，通过离心将蛋白质等杂质分离出来。
这一步的目的是去除细胞内的蛋白质，以便后续提取纯净的质粒DNA。
接下来，向样品中加入特定的离心管或纯化柱，这些离心管或纯化柱内部包含着特殊的材料（如硅胶、磁珠等）或离心管壁上有吸附质粒DNA的功能基团。
在加入缓冲液的条件下，质粒DNA会与这些材料或功能基团结合。
通过洗涤缓冲液的重复添加和离心的操作，将非特异性结合的杂质、盐离子等从离心管或纯化柱中洗去，以确保提取到的质粒DNA的纯度。
最后，在特定的洗脱缓冲液条件下，质粒DNA会从材料表面或功能基团上被解离出来，形成纯净的质粒DNA。
在整个过程中，内毒素不会被提取出来，因此提取出的质粒DNA是无内毒素的。
需要注意的是，无内毒素提取质粒的方法需要使用高质量的试剂和设备，并且操作过程需要严格控制，以保证提取出的质粒质量符合要求。
去内毒素的方法及检查方法
去内毒素的方法及检查方法注：这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。
热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。
其中脂多糖具有很强的热原活性。
由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。
【相关链接】热原的危害一、热原的性质及除去热原的方法1．高温法热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。
因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。
但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。
2．吸附法热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。
由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。
3．超滤法热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用 3.0～15nm超滤膜可将其除去。
4．蒸馏法热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。
5．酸碱法热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。
玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。
6．其它包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
二、热原的检查方法《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。
1．热原检查法由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。
《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。