肿瘤外泌体的提取与鉴定
肿瘤外泌体的提取与鉴定
叶冬熳，于 韬
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｅｘｏｓｏｍｅｓ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｅｘｏｓｏｍｅｓａｒｅｖｅｓｉｃｌｅ－ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｖａｒｉｏｕｓｃｅｌｌｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｌｉｐｉｄｓ，ｇｅｎｅｔｉｃｓｕｂ ｓｔａｎｃｅｓｓｕｃｈａｓｍＲＮＡ，ｍｉＲＮＡｓ，ｅｔｃ，ｃａｎｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｉｎｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓｏｆ ｔｕｍｏｒｓ．Ｔｈｅｅｘｏｓｏｍｅｓｈａｖｅａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｅａｒｌｙｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆｔｈｅｔｕｍｏｒ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏｔｈｅｉｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｅｘｏｓｏｍｅｓｃａｎｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｂｏｄｙｆｌｕｉｄｓ．Ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｗａｓｏｕｔｌｉｎｅｄｏｎｔｈｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓ，ｓｅｖｅｒａｌｍｅｔｈｏｄｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｔｕｍｏｒｅｘｏｓｏｍｅｓ，ｅｘｏｓｏｍｅｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｅｘｏｓｏｍｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
目前我国癌症的发生率及致死率较高，近 ３０年来，中国 癌症在死因中构成比达到 ２２．３２％，死亡率达到 １３５．８８／１０ 万，其中常见的 肿 瘤 包 括：肺 癌、胃 癌、肝 癌、食 管 癌、结 直 肠 癌、胰腺癌、乳腺 癌、脑 瘤、白 血 病、淋 巴 瘤，占 全 部 癌 症 死 亡 的 ８４．２７％［１］。而目前诊断癌症的检查方法，主要是影像学 检查、实验室检查、活组织检查等，而多数患者就诊时已为晚
期。目前，一种更为精确的可以用来进行癌症的早期诊断的 检查方法受到国内外学者们的关注，即外泌体检测。外泌体 近年来成为学者们研究的热点，它对于肿瘤的早期发现、诊 断、预后监测治 疗 上 都 有 着 重 大 的 意 义。那 么，如 何 提 取 外 泌体并进行检测鉴定在研究过程中也变得尤为重要，本文就 外泌体的提取及鉴定方法作简要综述。 １ 外泌体介绍
【收稿日期】 ２０１８－０１－０５ 【修回日期】 ２０１８－０２－０５ 【作者单位】 中国医科大学肿瘤医院 辽宁省肿瘤医院超声科，辽宁
沈阳 １１００４２ 【作者简介】 叶冬熳（１９９３－），女，辽 宁 丹 东 人，在 读 硕 士，主 要 从
事肿瘤相关的超声诊断研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｍｕ＿ｙｄｍ ＠１６３．ｃｏｍ 【通讯作者】 于韬（１９７３－），男，吉林人，主任医师，硕士生导师，主 要从事肿瘤的医学影像诊断与介入治疗研究工作。Ｅ －ｍａｉｌ：ｙｕｔａｏ＠ｃａｎｃｅｒｈｏｓｐ－ｌｎ－ｃｍｕ．ｃｏｍ
现代肿瘤医学 ２０１８年 １０月 第 ２６卷第 ２０期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｏｃｔ２０１８，ＶＯＬ２６，Ｎｏ２０
·３３４１·
ｔｙｒｏｓｉｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｍＲＮＡｆｏｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏ ｍａｃｅｌｌｓｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ［Ｊ］．ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００３，４９（１）：１０４－１１２． ［３９］ ＨａｒｏｕａｋａＲ，ＫａｎｇＺ，ＺｈｅｎｇＳＹ，ｅｔａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ：Ａｄ ｖａｎｃｅｓｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉ ｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１４，１４１（２）：２０９－ ２２１．
ＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０１８，２６（２０）：３３４１－３３４４
【指示性摘要】外泌体是由各种细胞产生的囊泡样结构，包含蛋白质、脂质、遗传物质如 ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等，能 参与到肿瘤的发生、发展、侵袭、转移中。外泌体对于肿瘤的早期诊断、治疗、预后检测均有重要的作用。根 据其生物学特性，外泌体可以在体液中检测到，本文就外泌体的收集、提取及鉴定外泌体的方法进行概述。 【关键词】肿瘤外泌体；外泌体提取；外泌体鉴定 【中图分类号】Ｒ７３０．４ 【文献标识码】Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－４９９２．２０１８．２０．０４２ 【文章编号】１６７２－４９９２－（２０１８）２０－３３４１－０４
［４０］ ＷａｒｄＫ，ＡｍａｙａＣ，ＶｅｒｍａＫ，ｅｔａｌ．Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅ ｃｕｌｅｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｓｕｂｓｅｔｏｆｓａｒｃｏｍａｓａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｔｏｔｈｅｄｅ ｇｒｅｅｏｆｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌａｔｙｐｉａｉｎｌｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ ＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ，２０１５，３（１）：３１－３６．
１９８６年，外泌体最早被发现于网织红细胞上清液中，呈 囊泡样结构［２］。很多细胞都可以分泌外泌体，如血细胞、树 突状细胞、内皮细胞、神经细胞、肿瘤细胞等，外泌体被认为 是细胞间进行交流、交换信息的重要介质，这也是它能影响 肿瘤生长的重要生物学基础，外泌体含有蛋白、脂类物质，遗 传物质如 ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＤＮＡ片 段 等［３，４］。肿 瘤 细 胞 分 泌的外泌体参与肿瘤发展的多个方面，包括肿瘤的侵袭、逃 避外泌体收集
ＹｅＤｏｎｇｍａｎ，ＹｕＴａｏ
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＵｌｔｒａｓｏｕｎｄ，ＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＣｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＬｉａｏｎｉｎｇＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｔｉａｌ＆Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＬｉａｏｎｉｎｇＳｈｅｎｙ ａｎｇ１１００４２，Ｃｈｉｎａ．
peg离心法分离外泌体的步骤
peg离心法分离外泌体的步骤好啦，今天咱们聊聊一个挺有意思的东西——PEG离心法分离外泌体。
哎，别一听这些名字就觉得头大，其实呢，说白了就是通过一种简单的离心方式，把外泌体给分离出来。
可能你会想，什么是外泌体啊？别急，听我慢慢给你讲。
你知道，外泌体其实是细胞分泌出来的小小泡泡，啥意思呢？就是那些细胞通过它们把一些信号、蛋白质或者RNA等信息“寄出去”。
外泌体这玩意儿可在医学研究里大有用途，尤其是在疾病诊断和治疗领域。
那要是想把这些小泡泡给单独提取出来怎么办？这时候，PEG离心法就显得特别给力了！想要分离这些小小的外泌体，咱们得准备一些东西。
想象一下，咱们要做个小实验，首先得有细胞培养液。
这个细胞培养液就像是外泌体的“母亲”，细胞们在里面生长、分泌，外泌体就从中跑出来了。
好啦，得了这些液体后，接下来你要加入一种叫做PEG的东西。
PEG，哦，那可不是你在跑步机上跳的那个P.E.T.，它是一种叫聚乙二醇的化学物质，别看它名字拗口，其实PEG就像一位会魔法的“聚会策划师”，它能通过改变液体的浓度，让外泌体们聚集在一起。
加入PEG之后，我们开始转动离心机啦。
这时候，离心机就像个旋转木马上，能通过强大的离心力把细胞里的各种成分按大小和密度给甩开。
PEG就像磁铁一样，把外泌体聚集到一起，其他的杂质就会被甩到一边。
你想，所有的东西都在旋转，里面的液体各种高低起伏，外泌体通过这个过程就被浓缩了。
不过，离心这个过程得特别小心，你得掌握好时间和速度，要不然你辛辛苦苦分离出来的外泌体就成了“渣渣”，没啥用。
完成了离心之后，咱们就可以把沉淀物（也就是外泌体）从上面的液体中分离出来。
嗯，这一部分看似简单，但其实很考验手劲儿，要轻轻地把液体倒掉，不然外泌体说不定就跟着一起跑了。
小心点，千万不要掉以轻心，毕竟这可是细胞的“心血”，咱得珍惜它。
然后呢，剩下的就是把这些外泌体洗净。
为啥要洗呢？你可能会想，外泌体这么小，干净不干净不都一样吗？洗净是为了去掉那些还在液体中的杂质，有的可能是其他细胞的残骸或者是一些不太“友好”的分子，得把它们甩掉，留下纯净的外泌体。
外泌体提取的方法
外泌体提取的方法外泌体是一种小型的胞外囊泡，它们由细胞释放出来，带有许多生物分子，如蛋白质、RNA和DNA等。
这些外泌体在很多生物体中都被发现，包括植物、动物和微生物等，而研究它们已经成为了一个热门课题。
因此，外泌体提取方法的研究也愈发重要。
1. 已有的外泌体提取方法目前已经开发出了几种外泌体提取方法，包括差速离心、密度梯度离心和超滤等。
这些方法每一种都有其优点和限制。
下面将分别介绍这三种方法。
差速离心法这是当前最常用的外泌体提取方法。
差速离心法利用一个多步骤的过滤和离心过程来提取外泌体。
此方法通过圆盘刷子离心除去大的细胞残留和细胞碎片，然后再通过速度梯度离心 Pellet 小径的微粒（包括外泌体）。
最终，被Pellet收集的微粒经过洗涤和再次离心以获得纯化的外泌体。
但这种方法也存在一些问题。
例如：外泌体含量极小，容易堵塞过滤器，处理时间也较长等。
密度梯度离心法这种方法是通过使用梯度浓度离心的离心管来纯化和分离外泌体。
这种方法可以强制微粒沉降到其密度梯度离心中与之匹配的密度位置。
密度高的梯度位置收集纯化的外泌体。
但是，密度梯度离心法也存在一些限制，由于梯度的浓度特性，产生相当多的上清液需要处理。
超滤法超滤法可以使用聚酰胺膜筛，把自然和添加的物质、基质等从水或反向微乳液中移除。
超滤法是一种最新的外泌体提取方法。
此方法是通过微孔膜以外泌体大小排除液体中的大分子物质，而留下外泌体和其他小分子在膜上。
最后，外泌体可以从膜上收集。
但是此方法也存在缺陷，需要更昂贵的设备，如超滤膜和超滤器等。
2. 未来发展方向虽然以上方法都有其优点和缺陷，但随着技术的发展和研究的深入，可能会出现新的外泌体提取方法，以更快捷、更准确、更方便的方式提取外泌体。
例如，利用氮氧化物处理方法，可以在不使用离心机和过滤器的情况下，快速提取外泌体。
这种方法可以在较少的研究时间内提取足够数量的外泌体。
随着技术的不断发展，人们希望设计出更加高效的方法，以便更好地应用于外泌体的研究中，更广泛地使用这些方法，并更好地理解外泌体的分子机制。
外泌体功能与临床应用研究进展
外泌体功能与临床应用研究进展外泌体是由细胞分泌的膜性囊泡，是细胞间通讯的重要介质，参与到细胞间生物信号的传递。
目前有5种公认且较为常用的提取外泌体的方法。
外泌体在临床疾病研究中突破性的进展主要体现在外泌体参与肿瘤疾病的进展、外泌体中的核酸或蛋白可以作为疾病的分子标志物、外泌体可以作为药物的载体进行靶向治疗等方面。
外泌体在疾病中行使的功能使其极具向临床应用的优势。
本文主要从外泌体的发现、提取方法优缺点及其在临床疾病功能的研究进展这三个方面加以阐述。
标签：外泌体；提取方法；外泌体与临床疾病1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现[1-2]，1987年Johnstone 等[3]将其命名为“exosome”。
研究者最初认为外泌体是一种实验的人工制品、废物或死细胞的残留物[1]。
到20世纪90年代，Zitvogel等[4]和Raposo等[5]发现外泌体很可能是细胞间相互交流的一种新方式。
2007年，Valadi等[6]发现外泌体内携带有核酸（mRNA、microRNA等）和蛋白质，并可以被其他细胞捕获。
这一系列的突破性发现打开了外泌体研究的新篇章。
目前，外泌体提取方法各具特色，并能够得到用于研究的外泌体，因此外泌体研究在近几年呈现指数型上涨。
外泌体在临床疾病方面也有较多突破性的报道，这种纳米级的小分子有希望替代细胞治疗投入到临床应用之中。
1 外泌体定义与提取鉴定方法外泌体是携带核酸和蛋白质的直径为30～150 nm的膜性囊泡，外泌体表面表达CD63、CD9、CD81等表面标志物。
胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）为细胞分泌的由膜包裹的囊泡统称为胞外囊泡，其包括外泌体、外膜泡、微泡、微粒、凋亡小体和其他EV亚群。
外泌体起源于质膜循环途径中的膜腔或早期胞内体，这些膜腔或早期胞内体向内凹陷形成管腔内膜泡，进一步发展成为多泡小体，多泡小体在细胞内分子马达的牵引下与细胞表面融合，最终分泌出去[7]。
细胞外泌体提取方法
外泌体提取详细步骤及方法1、差速离心差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。
该方法包括几个步骤，包括低速离心去除细胞和凋亡碎片；更高速离心以消除更大的囊泡；最后高速离心沉淀外泌体：300×g离心10分钟，取上清。
2000×g离心10分钟，取上清。
10，000×g离心30分钟，取上清。
100，000×g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100，000×g离心90分钟。
2、密度梯度离心该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体与非囊泡颗粒分离，例如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。
因此，该方法将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体。
但是，合适的离心时间非常重要，否则如果它们具有相似的密度，则仍可在外泌体中发现污染颗粒。
3、尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC）是基于大小而非分子量实现分离大分子。
该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根据其直径通过微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。
尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。
此外，可以将不同的洗脱溶液应用于该方法。
与离心方法相比，色谱分离已被证明具有更多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响，这可能会改变囊泡的结构。
目前，SEC是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。
不过，该方法耗时较长，不适合大量样本处理。
4、过滤超滤膜也可用于分离外泌体。
根据外泌体的大小，从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。
最常见的过滤膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径，可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌体，也有设计成微柱多孔硅纤毛结构以分离40-100nm外泌体：不过，该方法由于过滤膜的粘附，可能会损失外泌体，并且过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。
外泌体提取方法比较
外泌体提取方法比较外泌体是一种细胞外膜囊泡，通过一系列特殊的细胞分泌机制，从宿主细胞中释放出来。
外泌体中富含多种生物活性分子，如蛋白质、核酸、脂质和代谢产物等，对细胞间信息传递、免疫反应、炎症调节等生理和病理过程具有重要作用。
因此，外泌体的提取和分离成为研究其功能和应用的重要步骤。
目前常用的外泌体提取方法包括差速离心、超滤、密度梯度离心、覆膜及抗体磁珠法等。
以下将对这些方法的原理、优缺点进行详细介绍。
1.差速离心法：差速离心是一种简单且常用的外泌体提取方法。
它是通过逐步增加离心力，将细胞碎片和大颗粒物质从上清液中分离出来，最后得到外泌体的方法。
优点是操作简单、效果可靠，适用于大规模外泌体提取。
缺点是纯度较低，提取得到的外泌体中可能夹杂有其他细胞碎片和蛋白质聚集体。
2. 超滤法：超滤法是利用滤膜孔径选择性筛选颗粒物质的方法。
通常使用滤孔直径为20-100 nm的滤膜进行过滤，将大颗粒物质和细菌滤出，实现外泌体的提取。
优点是简便快速，可以得到较高纯度的外泌体。
缺点是容易因滤膜堵塞导致提取效果不佳，并且只能得到一部分外泌体。
3.密度梯度离心法：密度梯度离心法是根据物质密度的差异进行分离的方法。
通常使用等体积或等体积百分比的梯度溶液（如葡萄糖或蔗糖）进行离心，不同密度的物质会在梯度中分层沉淀。
外泌体的密度较低，往往在低密度梯度中聚集。
优点是可以分离得到高纯度的外泌体，并且可以细致分离不同类型的外泌体。
缺点是操作复杂，耗时较长。
4.覆膜法：覆膜法是指通过将培养基中的细胞和碎片离心去除后，直接在细胞上清液上方加入覆盖材料（如覆膜、多孔膜等），使外泌体通过覆盖材料进入上清液的方法。
优点是操作简单，不需要额外的离心步骤。
缺点是提取得到的外泌体纯度较低，可能夹杂有其他颗粒物质。
5.抗体磁珠法：抗体磁珠法是利用表面覆盖特定抗体的磁性微珠，通过与外泌体表面标记物质的特异性结合来实现外泌体的提取。
优点是提取效果稳定，纯度较高，可以选择性地提取一些类型的外泌体。
外泌体鉴定蛋白
外泌体鉴定蛋白介绍外泌体是一类赖以解决细胞间相互作用难题的细胞外囊泡，它们包含了细胞产生的多种生物分子，如蛋白质、核酸和脂质等。
这些分子可通过外泌体释放到细胞外，进而影响周围环境中的细胞和组织。
研究发现，外泌体中所含有的蛋白质在细胞信号传递、免疫调节以及疾病发生发展等方面扮演着重要的角色。
因此，鉴定外泌体中的蛋白质成为研究者的一个重要课题。
外泌体鉴定方法外泌体的鉴定方法主要包括以下几种：1. 质谱法质谱法是当前外泌体鉴定蛋白质的主要方法之一。
通过质谱仪对外泌体样本进行分析，可以获得蛋白质的质量谱图。
然后通过与数据库中的质谱数据进行比对，可以鉴定出样本中存在的蛋白质。
这种方法准确性高，但需要较为复杂的实验设备和分析技术。
2. 免疫印迹法免疫印迹法是一种常用的蛋白质检测方法，也可用于外泌体中蛋白质的鉴定。
首先将外泌体样本进行蛋白质提取，并使用SDS-PAGE进行分离。
然后将分离后的蛋白质转移到膜上，并使用特定的抗体进行检测。
通过观察特定蛋白质与抗体的结合情况，可以确定其是否存在于外泌体中。
3. RNA测序除了蛋白质外，外泌体还携带有丰富的核酸，如mRNA和miRNA。
通过对外泌体中RNA的测序，可以鉴定出外泌体中存在的特定蛋白质的编码基因。
这种方法可以提供一种从基因水平上鉴定外泌体蛋白质的手段。
4. 免疫荧光染色免疫荧光染色是一种用于检测蛋白质分布和定位的方法。
对于外泌体鉴定，可以通过标记特定蛋白质的荧光标记物（如荧光抗体）与外泌体进行共染色，然后使用荧光显微镜观察标记物的分布情况。
这种方法提供了一种直观的方式来确定外泌体中的特定蛋白质。
外泌体鉴定蛋白的意义外泌体中所含有的蛋白质在许多生物学过程中发挥着重要的作用。
下面列举了外泌体鉴定蛋白的几个意义：1.细胞间通讯：外泌体释放的蛋白质可以作为信号分子在细胞间进行通讯。
通过鉴定外泌体中的蛋白质，可以了解细胞间通讯的机制及其调控因子。
2.免疫调节：外泌体中的蛋白质在炎症和免疫反应过程中发挥重要作用。
外泌体正规操作方法
外泌体正规操作方法
外泌体（Extracellular Vesicles，EVs）是一类具有膜包裹的细胞外体，可以通过分泌进入细胞外液。
以下是外泌体的正规操作方法：
1. 细胞培养和外泌体收集：
- 选择适合外泌体比较丰富的细胞系，如癌细胞系等。
- 使用含有足够营养物质的培养基进行培养，在细胞生长到80-90%的密度时进行收集外泌体。
2. 细胞外泌体的分离和富集：
- 低速离心：对细胞上清和培养基进行低速离心，将细胞碎片和大颗粒物质沉淀。
- 高速离心：将低速离心上清进行高速离心，以沉淀分离出外泌体。
- 滤膜过滤：可以使用0.2至0.8微米的滤膜，通过滤膜将外泌体分离出来。
3. 外泌体的纯化和浓缩：
- 过滤：使用0.2至0.45微米的滤膜，将外泌体悬液过滤以去除细胞碎片和大颗粒物质，得到纯化的外泌体。
- 超速离心：将外泌体悬液进行超速离心，将外泌体沉淀。
- 液氮冷冻：将外泌体悬液进行液氮冻结保存，以便后续分析或实验操作。
4. 外泌体的鉴定和表征：
- 电镜观察：使用透射电子显微镜观察外泌体形态和结构。
- 免疫学鉴定：使用外泌体表面标记物的抗体进行免疫学检测，如CD63、CD81等。
- 蛋白质分析：使用质谱分析等方法对外泌体中的蛋白质进行分析。
需要注意的是，在操作过程中应避免外泌体的污染和损伤，同时应遵循生物安全操作规范。
干货外泌体的提取储存、临床应用和给药途径
干货外泌体的提取储存、临床应用和给药途径摘要：外泌体是细胞分泌的纳米级细胞外小囊泡，携带核酸、蛋白质、脂质等生物活性物质，在机体的生理病理过程中发挥作用。
与脂质体、纳米颗粒等合成载体相比，外泌体的内源性和异质性使其在疾病诊断和治疗领域具有广泛而独特的优势。
直径约 40-100nm 的外泌体是由细胞分泌的生物纳米级球形脂质双层囊泡，以 1.13-1.19 g ∙ mL-1 的密度漂浮在梯度溶液中。
1981 年，科学家Trams 等将质膜来源的囊泡统称为外泌体，并首次提出了“外泌体”的概念，将其视为具有5'-核苷酸酶活性的膜囊泡，可能具有生理功能，起源于各种细胞系培养物的分泌物。
外泌体 Exosomes目前定义的外泌体（40-100nm）于1983年首次在绵羊网织红细胞中发现，科学家Johnstone 等人追踪了网织红细胞成熟过程中的转铁蛋白受体，发现外泌体的形成是成熟红细胞中转铁蛋白受体丢失的机制细胞。
为了将它们与其他类型的细胞外囊泡(EV) 区分开来，它们被命名为外泌体。
然而，值得注意的是，根据ISEV 2018 指南，“外泌体”一词即使被广泛使用，也被建议替换为“小细胞外囊泡(sEVs)”一词，由于分离方法上的困难。
研究发现，外泌体含有核酸、蛋白质、脂质、细胞因子、转录因子受体等生物活性物质。
其中，外泌体蛋白成分主要分为两类，一类是公共成分，参与这一过程囊泡的形成和分泌，即外泌体无处不在，包括膜转运和融合相关蛋白（如Rab、GTPases）、热休克蛋白（如HSP70、HSP90）、四跨膜蛋白超家族（如CD63、CD81）、 ESCRT 复合物相关蛋白（如 Tsg101、Alix）、整合素等；另一种是特异性成分，与其祖细胞密切相关，即细胞特异性，如抗原呈递细胞来源的CD45和MHC-II。
随着外泌体研究的深入，其应用越来越广泛。
外泌体可以在生理和病理过程中发挥作用，充当细胞间通讯和物质交换的介质。
外泌体的提取、鉴定和保存方法研究进展
外泌体的提取、鉴定和保存方法研究进展蒲双双【摘要】外泌体是一种直径介于40～100 nm之间的膜性囊泡,由活体细胞分泌产生,广泛存在于人体各种体液中,富含多种蛋白质和RNA,是细胞间传递生物信息的重要载体,在生理调节和病理发展中都发挥重要作用,是近年来研究的热点.为更深入研究外泌体生物学作用机制,提取高质量的外泌体是首要步骤,基于此,笔者就外泌体的各种提取方法及其优缺点以及鉴定和保存方法的研究进展作如下综述,希望此文能为研究者们提供一些参考,为后续研究打好基础.【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2018(033)005【总页数】4页(P157-160)【关键词】外泌体;提取;鉴定;保存【作者】蒲双双【作者单位】山东中医药大学附属医院检验科,济南 250011【正文语种】中文【中图分类】R446外泌体，于1987年由Johnstone等[1]在研究绵羊网织红细胞时发现，是一种直径介于40～100nm的囊泡样结构。
在电子显微镜下，外泌体由双层磷脂膜包裹，内含丰富的蛋白质以及micro RNA等成分，其中一些独特的蛋白(如CD9，CD63，CD81，HSP70，TSG101等)还可作为外泌体的特征蛋白，在外泌体提取和鉴定中起重要作用。
起初，外泌体被认为是细胞排泄的废物，但近年来，越来越多的研究表明外泌体参与物质运输，还携带和传递重要的生物信息[2]，在介导免疫抗原递呈、树突状细胞的活化、神经退行性疾病发生、肿瘤细胞抗原的转移及肿瘤诊断治疗中发挥重要作用[3～5]。
随着蛋白质组学和基因组学等分析手段的发展，外泌体介导的生物学效应及其背后的分子机制将会更加清晰，但在此研究过程中，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要的步骤，也是一切后续实验的基础，毕竟只有高纯度、高活性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。
为此我们对目前常用的外泌体提取、鉴定和保存的方法及其优缺点做如下综述：1 外泌体提取方法1.1 超速离心法(差速离心法) 超速离心法是目前制备外泌体的经典方法，是根据外泌体的沉降系数差速离心将其分离出来。
外泌体提取方法总结
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10 min，吸取上清液,然后2 000×g离心10 min;吸取上清液后,10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体.用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于—80℃备用。
2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝。
此后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。
接着将血清以3,000×g离心10分钟。
将上清液以无菌PBS 以1:1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟,然后以200,000×g进行2小时超速离心。
将颗粒在a中洗涤大量PBS,通过0。
2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。
为了从体液(例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆,肿瘤腹水)中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。
血浆用紫色的管子,EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。
在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。
外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。
该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体(Caby等，2005).基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。
材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清,尿液,细支气管灌洗或肿瘤腹水)磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机50毫升聚丙烯离心管0。
22微米过滤装置（如Steritop，Millipore)超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表 3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3。