16s 宏基因组分析
完整版)宏基因组测序讲解
完整版)宏基因组测序讲解宏基因组测序的目的是研究藻类物种的分类、与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部、微生物与环境以及与宿主的关系。
宏基因组，也称为微生物环境基因组或元基因组，是由Handelsman等于1998年提出的新名词。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的微生物研究方法。
它通过功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系为研究目的。
一般XXX包括从环境样品中提取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组文库是一种重要的研究工具，可以利用转入大肠杆菌中的宏基因组DNA载体，使以前无法研究的不可培养微生物的DNA得到复制、表达，从而进行研究。
所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。
对于宏基因组文库的DNA进行分析，有很多分析方法，主要分为表型功能筛选和序列基因型分析两类。
表型功能筛选是利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因，例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。
而序列基因型分析则是对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究，例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。
一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，并尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。
XXX是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的新的微生物研究方法。
它主要通过功能基因筛选和测序分析来研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。
在宏基因组学研究中，样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集是非常关键的步骤。
提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。
肠道菌群分析临床意义
肠道菌群分析临床意义引言肠道菌群是指人体肠道内数量庞大、多样性丰富的微生物群落。
随着研究的深入，人们逐渐认识到肠道菌群在人体健康与疾病中的重要性。
肠道菌群分析作为一种新兴的研究领域，正在逐渐被广泛应用于临床医学中。
肠道菌群分析技术肠道菌群分析主要依靠高通量测序技术，包括16S rRNA测序和宏基因组测序。
通过对肠道样本进行测序，可以获得丰富的菌群信息，并进行进一步的数据分析和解读。
16S rRNA测序16S rRNA是细菌的特异性标记基因，其序列在不同菌株之间具有一定的差异性，可以用来确定细菌的分类和进化关系。
通过对16S rRNA基因进行PCR扩增，并利用高通量测序技术进行测序，可以获得肠道样本中细菌的组成信息。
宏基因组测序宏基因组测序是对微生物群体中的所有基因进行测序，并通过比对到已知基因库进行注释和功能分析。
与16S rRNA测序相比，宏基因组测序可以更全面地了解菌群的功能和代谢能力。
肠道菌群与健康的关系肠道菌群在维持人体健康方面发挥着重要作用。
下面我们将从三个方面介绍肠道菌群与健康的关系。
消化与营养吸收肠道菌群参与人体对膳食纤维、抗生素和药物等的消化和吸收过程。
一些菌株可以分解膳食纤维，产生有益的短链脂肪酸，提供能量给肠道上皮细胞。
同时，肠道菌群也可以分解一些药物和抗生素，影响其药效和代谢过程。
免疫调节肠道菌群与人体免疫系统密切相关。
菌群可以通过调节免疫细胞的分化和功能，影响免疫应答的程度和性质。
正常的菌群结构可以维护免疫系统的平衡，对抗病原微生物的侵袭，预防自身免疫性疾病的发生。
疾病风险菌群失调与多种疾病的发生和进展有关。
肠道菌群的变化已被发现与肥胖、炎症性肠病、自身免疫性疾病、心血管疾病等疾病相关。
通过对肠道菌群的分析，可以预测疾病的风险，为防控和治疗提供依据。
临床意义肠道菌群分析具有重要的临床意义，包括以下方面。
疾病诊断通过对肠道菌群的分析，可以辅助疾病的诊断。
比如，通过检测某些疾病特异性菌株的存在与否，可以提高疾病的早期诊断率。
(完整版)宏基因组测序讲解
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
PICRUSt
3
第9到32天
已检测不到荧 蒽；但据推测， 这段时间在降 解前期反应的 中间产物
有关代谢的基因： 比如外源性生物降 解、碳水化合物和 脂质代谢、氨基酸 代谢等（说明荧蒽 的降解会持续到第 三阶段）
具体应用一
代谢阶段
菌属
代谢酶
该菌属基因对该 酶合成的贡献率
环双加氧酶α 《在多环芳烃污染土壤中微生物降解荧蒽的代谢网络的重建》
(K11943) 环双加氧酶β Mycobacterium (K11944) 90% 每个阶段的功能基因丰度，进而找到生物标记基因（丰度变化最大的基因） （分支杆菌属） 环裂解双加氧酶 (K11945) 荧蒽的初期降解 哪些菌种的功能基因对应荧蒽代谢的哪些酶、起多大作用。 (K00517) 85% Diaphorobacter 二氢二醇脱氢酶 83.6%-88.8% (K14582) 62.4% in stage 1– 荧蒽的后续降解 Hyphomicrobium 醇脱氢酶 (K13954) 76.8% in stage 3 （生丝微菌属） Agrobacterium 邻苯二酚2,3-双 （土壤杆菌属） 加氧酶(K07104) Sphingopyxis 反式 - 羟基亚苄 larger than 50% 基丙酮酸水合酶 醛缩酶（K14584）
精确度和局限性
85%--90%
精确度和局限性
在某环境中相似的、可供 参考的微生物基因的记载 越多，基因库越充足， PICRUSt的精确度越高。
效果与局限
碳水化合物和脂质代谢
能量代谢
环境信息处理（95%）
遗传信息处理（99%）
பைடு நூலகம்
核苷酸和氨基酸代谢
精确度和局限性
局限
1.它只能对已知微生物的已知功能进行功能预测，目前并不能完全代替宏
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16sDNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组-PPT
Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Saccharomyces
2.环境保护和污染修复
挖掘降解基因和功能菌株，进行生物修复 获取任何序列的基因或功能，由此合成新物质或发 现新的生物物种。 发掘极端环境为生物的新物种，了解其耐受机制， 帮助极端环境的污染修复。 从宏基因组中分离的重要基因元件组编成具有其他 活性成分、或可降解污染物功能的基因簇，以替代 原有不易降解化合物，或直接降解环境中石油烃、 有害有害化合物、重金属。
（1）基于序列的筛选方法
②.焦磷酸测序( Pyrosequencing)
焦磷酸测序技术是在焦磷酸盐测序法的基础 上结合一种乳胶材料和皮升级反应孔，将基因组 DNA 进行随机切割，批量地进行整个测序反应， 能够在相同的时间内破译 6×106组以上的基因组 序列，比 Sanger法要快100倍，提高了测序的效 率。
底物诱导基因 表达法SIGEX screening
1.样品中DNA的提取和富集
采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出 环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以 获得完整的目的基因或基因簇。所以提取原 则是在最大提取量和最小剪切力之间折中 常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法 (细胞提取法)
3.开拓天然产物新资源
2000年8月, Brady和 Clardy等人构建了一 个含有约7000000个5个, 并从 其中一个克隆发酵物 中分离出一系列具有 抗菌活性的长链N2酰 基酪氨酸类新化合物 1213
生物大数据技术在微生物组学研究中的使用教程
生物大数据技术在微生物组学研究中的使用教程随着生物学研究的发展和技术的进步，微生物组学成为了一门快速发展的新兴领域。
微生物组学研究旨在深入研究微生物的基因组和功能，以及微生物与宿主之间的相互作用。
生物大数据技术在微生物组学研究中扮演着重要的角色，为研究者提供了海量的数据资源和分析工具。
本文将介绍生物大数据技术在微生物组学研究中的使用教程，并分享一些常用的分析工具和方法。
一、数据获取与处理微生物组学研究所需的数据通常包括微生物基因组数据、宿主基因组数据以及它们之间的相互作用数据。
在这些数据的获取和处理过程中，研究者可以利用公共数据库和在线工具来获得并处理数据。
1.1 公共数据库的使用在微生物组学研究中，一些公共数据库成为了重要的数据资源，例如，NCBI （National Center for Biotechnology Information）可以提供丰富的微生物组学相关数据。
研究者可以在NCBI中搜索并下载与所研究微生物相关的基因组数据、宿主基因组数据以及它们之间的相互作用数据。
1.2 数据质量控制和预处理在微生物组学研究中，数据的质量控制和预处理非常重要。
数据质量控制包括去除低质量序列、去除污染序列、去除重复序列等步骤。
而数据预处理包括质量评估、序列拼接、序列组装等步骤。
研究者可以使用一些常用的工具，如Trimmomatic、FastQC和SPAdes等，进行数据质量控制和预处理。
二、微生物基因组分析微生物组学研究中的一个重要方面是微生物基因组的分析。
通过分析微生物基因组可以了解微生物的物种多样性、功能潜力以及微生物-宿主相互作用等。
2.1 物种分析物种分析主要是确定所研究样本中微生物的物种组成。
常用的方法包括16S rRNA基因分析和宏基因组分析。
16S rRNA基因分析通常用于分析微生物的物种多样性，而宏基因组分析则可以更全面地了解微生物基因组的功能潜力。
研究者可以使用一些常用的工具，如QIIME、mothur和MEGAN等，进行物种分析。
宏基因组学
,已发现的新基因主要有生物催化 剂基因、 抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因
• 土壤宏基因组学技术最引人注目的贡献是新生物 催化剂的发现 , 包括腈水解酶和淀粉酶( Rondon et al . , 2000 )、 蛋白酶、 氧化还原酶(Knietsch et al . , 2003)、 脂肪酶、 酯酶 ( Ki m et a l . ,2004; 2006)等 ,并且在此基础上获得新酶的许 多特征信息.
• 海表层水样 为研究海洋生命的代谢潜力和海洋生态学提供
了前所未有的原始素材；海洋蕴藏着巨大的生物 多样性和复杂性 ,宏基因组学研究将大大促进人 们对它的认识。 • 极端环境水体 (如酸性矿水、 深海 )
由于其苛刻的物理化学条件,使得其中的微生 物群落也较为独特 ；利用环境基因组学对其开展 微生物生物群落结构及生理代谢对环境变化响应 的研究 ,将促进我们更好地理解这些极端环境生 态系统并对其加以调控和利用。
序列分析法
• 微序列技术 (Micr oarray)采用集约化和平面处 理原理 ,在微小片基上高密度而有序地排列大量 基因片段、 EST或寡核苷酸片段 ,从而形成 DNA 微矩阵 ,又称基因芯片。
• 焦磷酸测序技术( Pyrosequencing) 是在焦磷酸 盐测序法的基础上结合一种乳胶材料和皮升级反 应孔 ,将基因组 DNA进行随机切割 ,批量地进行 整个测序反应，能够在相同的时间内破译 6 × 106组以上的基因组序列 ,比 Sanger法要快100 倍 ,提高了测序的效率。
将一条完整的目标序列随机打断成小的片段 , 分别测序 ,然后利用计算机根据序列间的重叠关 系进行排序和重新组装, 并确定它们在基因组中 的正确位置 。
• 优点：为筛选新的天然产物提供了 一种可选择的途径, 从中挖掘上百 万个新基因,揭示不可培养微生物 的代谢途径.
基于reads宏基因组测序分析报告解读
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五、功能数据库注释——基于reads的功能分析基本步骤
基于reads的功能分析基本步骤: 1）使用HUMAnN2软件（2018年发表在Nature methods），将质控和去宿主之 后的序列与蛋白质数据库（UniRef90）进行比对（基于DIAMOND）； 2）过滤掉比对失败的reads； 3）统计UniRef90各个蛋白的相对丰度（RPKM ，reads per kilobase per million），校正样本比对成功reads(mapped reads)数以及基因长度后的丰度。 4）根据UniRef90 的ID 和各个功能数据库ID的对应关系（主要来自LinkDB），统 计各个功能数据库对应功能相对丰度。 5）从各个数据库功能的相对丰度表出发，进行相对丰度柱形图展示，Circos图展 示，丰度聚类热图展示，组间功能差异LEfSe分析，组间功能差异pair-wise多重比 较DunnTest分析，显著差异功能物种来源柱形图分析，KEGG通路图填色，功能 与环境因子（或者其它组学数据）的相关性分析。
专注微生态
2020.09.14
Ø项目概述
目
Ø项Hale Waihona Puke 流程录Ø测序数据处理
Ø物种注释
Ø功能注释
Ø抗性基因注释
Ø相关性分析
2
一、项目概述
近年来，环境和生物体相互作用的微生物群体逐渐成为新兴的研究热点， 而大量复杂的微生物群体存在培养困难，构成复杂（包括细菌、古菌、真菌、 原生生物、病毒甚至小型真核生物）。因此如何用高通量精准的了解这些群体 的构成，基因功能分布以及具体的表达活性和代谢状况成为首要问题。
Nature：宏基因组关联分析综述——你想要的全在这
Nature：宏基因组关联分析综述——你想要的全在这本文转载自“锐翌基因”，已获授权。
Nature于去年7月6日紧随Science4月29日的特刊，推出业内顶级专家主笔的6篇有关“肠道菌群-宿主相互作用”的重量级综述和观点透视专辑，提供了肠道菌群在多个领域的和临床应用发展中的重要进展。
本期专辑的推出，为肠道菌群和肠道健康的研究和转化再一次摇旗呐喊。
宏基因组关联分析（MWAS）作为微生物组研究的一把利器，正在微生物与疾病研究中发挥越来越重要的作用。
今天小锐说事儿便跟大家聊聊6篇雄文中的一篇来自微生物研究领域大牛Jack A. Gilbert（美国环境、医院和家庭微生物组计划发起人，点击名字查看教授简介）主笔的综述文章，有关宏基因组关联分析在疾病领域的研究进展。
文章主旨本综述总结了疾病相关生物学过程中微生物的作用，并详细介绍了宏基因组关联分析（MWAS）方法以及它在关联微生物与疾病表型中的研究成果。
MWAS与GWAS的异同点从概念上来说，宏基因组关联分析（MWAS）与全基因组关联分析（GWAS）的确有共同点，都是将某些复杂的特征（比如物种或基因）与表型关联起来。
但是，这两者之间存在以下几个非常重要的区别：第一，微生物中的基因数量与人的基因数量比值接近100:1；第二，几乎所有的个体都具有相同的基因，但所携带的微生物种类和基因差异巨大；第三，人体的基因表达量很容易计算，而大部分微生物组数据只能通过相对丰度进行量化。
因此，微生物组分析很有难度；第四，人体基因组是不会改变的（除癌症等特殊情况），而个体所携带的微生物组在不断变化。
快速了解MWAS1.MWAS能够将物种注释到种水平，对基因进行预测及功能注释，另外还有少部分转录本和蛋白相关的分析。
2.宏基因组测序和组装为确保样品间的比较有意义，首先应保证足够测序数据量，因为被检测到的基因数会随着测序数据量的增加而增加，直到饱和。
与从肠粘膜、口腔、皮肤、阴道和胎盘这些部位采集的样品相比，粪便样品宿主污染比较少，不超过总数据量的1%。