pcr电泳配置
基因型鉴定-普通PCR及核酸电泳-20170306
基因型鉴定-普通PCR及核酸电泳
2017.03.06 [普通PCR]
一、准备
✓试剂&耗材
10×buffer、dNTP、Taq酶、引物、模板cDNA、双蒸水、冰、黄板子
✓仪器设备
掌上离心机、PCR仪
二、步骤
25ul反应体系：
10×buffer：2.5ul ；dNTP：2ul ；Taq酶：0.25ul ；引物：0.5+0.5ul ；ddH2O：15.24ul ；DNA：5ul
注：记得在设置参数时，sample的体积改成25ul
[核酸电泳]
一、准备
✓试剂&耗材
琼脂糖、1×TBE、核酸染料（EB替代物）、6×loading buffer
✓仪器设备
核酸电泳区域
二、步骤
1. 根据对应的核酸片段长度选择琼脂糖浓度：
2.根据样品数量、目的基因表达水平确定胶的大小及梳子的规格。
（一大块为100ml）
3.琼脂糖、1×TBE加入至锥形瓶中，用称量纸盖住瓶口，用微波炉加热至沸腾，完全溶解
4.冷却至50℃左右时（手背贴壁5s左右不觉得烫），按1：10000加核酸染料
5.混匀后加入到已插入梳子的凝胶床（记得放架子）
6.凝后拔出梳子，带架子放入电泳槽（槽内1×TBE要没过胶块）
7.核酸样品与6×loading buffer按5：1的比例混匀，上样
8.电泳（电压120V，电流80-100mA）
注：核酸电泳区域为污染区域，接触操作时应在丁腈手套外加PE手套；照胶可在本室，也可去3层。
pcr及电泳实验报告
pcr及电泳实验报告PCR及电泳实验报告引言：PCR（聚合酶链式反应）和电泳是生物学实验中常用的两种技术，它们在分子生物学研究中起着重要的作用。
PCR能够扩增特定DNA片段，而电泳则可以将扩增产物进行分离和检测。
本实验旨在通过PCR和电泳技术，对一段目标DNA 进行扩增和分析。
材料与方法：1. PCR反应体系：引物A、引物B、模板DNA、聚合酶、dNTPs、缓冲液、MgCl2、水。
2. PCR反应条件：预变性95°C 5分钟，变性95°C 30秒，退火55°C 30秒，延伸72°C 30秒，最终延伸72°C 10分钟。
3. 电泳装置：琼脂糖凝胶、TAE缓冲液、DNA标记物、扩增产物。
4. 电泳条件：电压100V，电流20mA，电泳时间30分钟。
结果与讨论：经过PCR反应，我们成功扩增了目标DNA片段。
在电泳分析中，我们观察到了明显的DNA条带。
这表明PCR反应成功，并且扩增产物的长度符合预期。
通过对扩增产物进行电泳分离，我们可以进一步分析和检测目标DNA。
PCR反应是一种体外扩增DNA的技术，它利用DNA聚合酶酶活性的特性，通过不断循环的变性、退火和延伸步骤，将目标DNA片段扩增到数以亿计的复制。
PCR反应体系中的引物是起到定位和扩增目标DNA的作用，引物的设计需要根据目标DNA的序列进行合理选择。
在本实验中，我们使用了引物A和引物B，它们的设计基于目标DNA的序列。
电泳是一种通过电场力将DNA分子在凝胶中分离的方法。
在电泳过程中，DNA 分子会根据其大小和电荷迁移速率的不同，形成不同的条带。
通过观察这些条带的位置和强度，我们可以对DNA样品进行分析和鉴定。
在本实验中，我们使用琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶是一种由琼脂糖和缓冲液制成的凝胶，它具有一定的孔隙度，可以使DNA分子在电场力下进行迁移。
电泳过程中，我们使用TAE缓冲液作为电解质，它可以提供适当的离子强度和pH值，保证电泳的正常进行。
pcr检测实施方案
pcr检测实施方案PCR检测实施方案。
PCR（聚合酶链式反应）是一种用于复制和扩增DNA片段的技术，广泛应用于医学、生物学、法医学等领域。
在疾病诊断和病原体检测中，PCR检测技术已成为一种重要的手段。
本文将介绍PCR检测的实施方案，包括样本采集、试剂准备、实验操作等内容，以帮助实验人员正确、规范地进行PCR检测。
一、样本采集。
1. 样本选择，根据需要检测的疾病或病原体类型，选择相应的样本类型，如血液、唾液、组织等。
2. 采集器具准备，准备好采血针、采血管、采集棉签等采集器具，并确保无菌。
3. 采集操作，按照标准操作程序，采集样本，并尽量避免污染和误差。
二、试剂准备。
1. PCR试剂准备，根据实验需要，准备好PCR反应体系所需的试剂，包括引物、酶、缓冲液等。
2. 试剂保存，按照说明书要求，正确保存PCR试剂，避免冻融、阳光直射等不良影响。
三、PCR反应。
1. 反应体系配置，根据所需扩增片段的大小和数量，配置PCR反应体系，包括引物浓度、模板DNA浓度、缓冲液浓度等。
2. 反应管标记，在反应管上标记好样本编号和实验日期，避免混淆。
3. 反应条件设定，根据引物特性和模板DNA特性，设定PCR反应的温度、时间等条件。
4. PCR反应操作，按照设定的条件，进行PCR反应，确保操作准确、无污染。
四、扩增产物检测。
1. 凝胶电泳，将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，观察扩增片段的大小和纯度。
2. 实时荧光定量PCR，对于定量检测，可使用实时荧光定量PCR技术，准确测定扩增产物的数量。
五、结果分析。
1. 结果解读，根据扩增产物的大小、数量和纯度，结合实验目的，进行结果分析和解读。
2. 数据记录，将实验结果详细记录在实验笔记或实验报告中，便于日后查阅和复现实验。
六、实验安全。
1. 实验操作安全，在实验操作过程中，严格遵守实验室安全操作规程，避免实验意外发生。
2. 废弃物处理，实验结束后，将废弃的试剂、反应管等废弃物按规定处理，保持实验室环境整洁。
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种利用DNA复制酶扩增DNA片段的技术。
通过PCR，可以产生大量特定的DNA序列，以便后续的分析和研究。
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析是一种常用的方法，用于确定扩增反应的成功与否，并得到扩增产物的大小信息。
琼脂糖凝胶电泳是一种分离和检测DNA分子的方法，基于DNA的大小和电荷的差异。
琼脂糖是一种高分子量的糖，在加热后形成凝胶状。
通过将DNA样品混合到熔化的琼脂糖溶液中，然后在电场的作用下，DNA分子会在凝胶中移动，从而分离成不同大小的带状条带。
这些条带可以被观察和测量，从而获得PCR产物的大小信息。
琼脂糖凝胶电泳分析的步骤如下：1.准备琼脂糖凝胶：将适量的琼脂糖粉末加入缓冲溶液中，加热并搅拌，使其溶解。
然后将琼脂糖溶液倒入凝胶模板中，插入梳子，待凝胶固化。
2.样品处理：将PCR产物与DNA标记物（如DNA分子量标记物）混合。
DNA标记物是一系列已知大小的DNA片段，用于标记未知PCR产物的大小。
3.载样：将样品和DNA标记物载入琼脂糖凝胶的孔中，通常使用微量移液器进行操作。
同时加入负向和正向的电源极，以形成电场。
4.电泳：使用适当的电压将琼脂糖凝胶浸入缓冲液中，然后启动电源，开始电泳。
DNA分子在电场的作用下，从孔洞区域向凝胶的另一端移动。
5.可视化：电泳结束后，可以使用紫外灯或染料（如溴化乙锭）将凝胶上的DNA分子可视化。
DNA分子会产生荧光，从而形成带状条纹。
6.分析：根据带状条纹的迁移距离和DNA标记物的大小，可以确定PCR产物的大小。
通过比较PCR产物的迁移距离和DNA标记物，并结合PCR的设计和预期产物的大小，可以确定PCR反应是否成功。
此外，可以使用图像分析软件测量和分析带状条纹的大小。
总结起来，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析是一种常用的方法，用于确定PCR反应的成功与否，并获取PCR产物的大小信息。
PCR技术详细步骤-从RNA抽提到电泳鉴定
PCR技术详细步骤－从RNA抽提到电泳鉴定最近在做PCR，发点相关知识，大家共同学习。
RNA抽提一，准备工作1，实验器具与材料：（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）吸头：1ml、200ul、20ul（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶：100ml（8）15ml塑料管一个（配75％乙醇用）2，实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。
（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。
（3）金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。
（不需要泡DEPC水）3，试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml 容量瓶中静置4小时后备用。
配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。
（2）75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。
（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5）Trizol：100ml/瓶存放于4℃二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
三，抽提步骤1．匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP 管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。
PCR电泳实验步骤
（二）PCR产物电泳鉴定1．目的：学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。
2．原理DNA分子在电场中会向正极方向移动。
不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。
3．试剂PCR产物，TAE电泳缓冲液，1000⨯溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖，DNA分子量标准4．实验准备配制TAE电泳缓冲液（50⨯储存液，pH约8.5：Tris碱242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd water 定容至1L），6⨯加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。
5．操作步骤（1）称取0.4g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE电泳缓冲液(1⨯)，放入微波炉中烧开（1min）。
注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。
（2）戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60︒C）。
（3）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。
胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。
在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。
（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。
（4）在水平电泳槽中加满1⨯TAE电泳缓冲液。
根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。
（5）待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。
用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。
凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。
（6）在凝胶上选择相邻的加样孔。
用10μl的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3μl DNA分子量标准物）。
加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。
看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。
菌落PCR及菌液电泳经验
取10ul ddH2O至1.5ml的EP管，用灭菌牙签挑单菌落至其中，分散均匀，顺便用牙签转接至新平板做标记后培养，取菌落稀释液1ul到薄壁管，加入预混PCR溶液9ul，进行PCR 验证。
加100ul LB（含相应抗生素如氨苄青霉素）至菌落稀释的1.5ml EP管，然后拿去培养，EP管可以固定在漂浮板或者放在EP管架上用纸包好。
培养好的菌液离心倒去上清液，用残留的液体分散菌体沉淀，加入30ul的破菌电泳缓冲液（SDS 0.5%,Tris-HCl 0.04mol/L,EDTA 0.002mol/L,蔗糖 0.4mol/L，溴酚蓝 0.02％，NaOH 0.1mol/L），50-70度C 水浴15min，12000r/p 离心15min，取上清液30ul电泳，染色后观察，也可以使用前先把染料加入到破菌电泳缓冲液中，比例是一般电泳1/4，如果感觉多了再减少。
PCR相关介绍
PCR的大体操作流程TAE和TBE各代表什么EP1101 500mlEP1102 1000ml产品说明:快速电泳缓冲液以硼酸盐为基础，是常规的核酸电泳缓冲液如Tris-硼酸(TBE)或Tris-醋酸(TAE) buffer的升级换代产品。
快速电泳缓冲液允许在高电压电泳，产热少，分辨率高，电泳速度极快，可以在几分钟内完成电泳。
用1%浓度的琼脂糖凝胶即可高分辨率分离PCR片段，带型锐利。
特点：◆高电压电泳数分钟内完成，比TBE/TAE快3倍◆特别适合PCR片断，对短条带分辨率极高且带型锐利◆不影响核酸条带回收、转膜、EB观察用法：◆用纯水将20×快速电泳缓冲液稀释为1×快速电泳缓冲液。
◆用快速电泳缓冲液配制琼脂糖凝胶。
也可用TBE/TAE缓冲液配制凝胶。
◆用快速电泳缓冲液进行电泳。
小胶电压150 V，中等或大胶电压200-250 V。
应优化电压。
◆EB可加入快速电泳缓冲液或凝胶内，紫外观察核酸条带。
储存：室温或4℃。
关于核酸染料核酸染料GELVIEW产品编号包装EP1501 1mlEP1502 10ml产品说明：Gelview是一种新型核酸染料，当用琼脂糖电泳检测DNA时，Gelview与核酸结合后能产生极强的荧光信号，其灵敏度比EB高，其使用方法与EB完全相同。
由于溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂，对人体有很大危害，而Gelview经检验未发现有致癌作用，因此用其代替EB是一种很好的选择。
在紫外透射光下，双链DNA呈现极其鲜明的绿色荧光。
使用方法：◆将20ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%～2%）在微波炉中融化。
◆待胶冷却至50-60℃时.加入2μl Gelview，轻轻摇匀，避免产生气泡。
◆倒胶，待琼脂糖凝胶完全凝固后上样电泳。
◆电泳完毕在紫外灯下观察。
若使用数码相机照像记录，则关闭相机的闪光灯，放在自动档即可；若使用凝胶成像系统照相，通过调节光圈、曝光时间，选择合适的滤光片，可得到成像清晰、背景较低的照片。
PCR扩增产物的电泳分析
PCR扩增产物的电泳分析凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种.一、琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等.(一)凝胶浓度:凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定.琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围(二)电泳缓冲液核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀.TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解.10XTBE缓冲液的配制Tris硷，108克EDTA，9.3克硼酸，55克H2O至，1000ul(其PH应为8.0～8.2)临用时用水稀至0.5XTBE(20倍稀释.(三)核酸电泳的指示剂与染色剂1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似.指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便.染色剂:核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色.溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察.银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收.(四)电泳1.电泳装置:电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等.2.电泳方法:(1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子.(2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA 片段，可配制1.2～1.7%浓度的琼脂糖用于电泳.3.配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化.冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固.4.向电泳槽中倒入0.5XTBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子.如样品孔内有气泡，应设法除去.5.在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内.6.接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负).电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算).7.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳.一般200～400bp的PCR产物50V 电压，电泳20～40min即可.(3)溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小.二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA 序列分析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离.聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围见表2.*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).(一)材料1.电泳仪器:电泳仪，垂直电泳槽及其附件.2.30%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N，N'一亚甲基双丙烯酰胺，1克H2O，加至100ml装于棕色瓶内，4℃可保存二个月.3.10%过硫酸铵过硫酰铵，1克加水至，10ml4℃可保存一周，-20℃可保存一个月.4.1XTBE电泳缓冲液5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)(二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳:根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角.3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止.5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会.6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE缓冲液.7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则.8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡.9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳.10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果.12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高的灵敏度，可用银染.。
PCR扩增和电泳检测(共28张PPT)
（ Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应） 是指在体外，通过特异DNA引物扩增核酸分子中 某个特定区域的技术。
PCR的反应体系
DNA模板 原料： dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP) ；
酶： Taq聚合酶（嗜热细菌中分离得到） 引物：（单链DNA片段） Mg2+（维持酶活性所必需） PCR缓冲液：维持pH，保护Taq酶
混样
2μL载样缓冲液、 2μL 核酸荧 光染料，10μLPCR产物混匀。
点样
将上步混好的样10 μL加到凝胶 孔中。
电泳 90V电压下电泳10~20min。
制胶
将琼脂糖加入电泳缓冲液, 在微波炉中加热溶解至透明。
将凝胶倒入制胶器的槽中
（60oC）
将梳子从制胶槽中拔出
取出凝胶板放入电泳槽中
向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶
PCR技术原理
变性 退火 延伸
PCR三步曲
预变性
变性 90~95℃
退火 40~60℃Fra bibliotek延伸 70~75℃
保温
PCR仪
用于PCR的预混液（ 500L 体系）：
ddH2O
10×butter
MgCl2 dNTP混合液
引物1 引物2
模板DNA Taq DNA聚合酶
310 L
50 L 40 L 20L
25L 25L
循环次数 35
琼脂糖凝胶电泳
1、基本概念 以琼脂糖凝胶作为介质,DNA在外加电场的 作用下泳动的技术。
2、实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以 形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决 定于琼脂糖的浓度。
琼脂糖凝胶电泳基本原理
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
电泳
1、凝胶制备：根据样品数量，配置相应孔数的凝胶，一般浓度为1-2％。
①配置1×TAE：1ml50×TAE + 49ml双蒸水，摇匀，备用。
②配胶：0.3-0.45g琼脂糖+30ml 1×TAE，0.5-0.75g琼脂糖+50ml 1×
TAE,1.0-1.5g琼脂糖+100ml 1×TAE，以此类推。
③熔化：微波炉熔化至液体完全透明。
④冷却：熔化的琼脂糖冷却（可用自来水冲洗三角瓶）到60～70℃时，加入EB 替代物
(30ml琼脂糖+1.8-2ul; 50ml琼脂糖+2.5-3ul;100ml琼脂糖+5-6ul)轻轻混匀。
2、铺胶：将冷却致60℃左右的凝胶倒入准备好的胶床内，插上梳子。
凝胶厚度3～5mm。
3、室温下静置1小时左右，凝胶固化。
拔下梳子，将凝胶置于电泳槽中，并使
样品孔位于电场负极。
4、向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液:越过凝胶表面即可。
原梳齿处(样品孔)即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。
5、上样：用10ul移液枪吸取5ul PCR产物，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，然后吸取5ul Marker到样品孔中。
6、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳：开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。
电泳条件：电压120v；时间0.5小时左右。
7、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
8、电泳结果分析：
①用凝胶成像系统观察条带。
②保存图片。