五种烟草病毒TMV
【2019年整理】五种烟草病毒TMV
检测步骤
1.3 单重RT-PCR
单果重RT-PCR用2P电5CMμR泳-LMb检PuLC测fVfeR结反r 标［转准7录5反0酶m应反m体转o系l录/L:合1T4成r．is各-H3病Cμl毒L( pdcHdDH8N．2AO8第，) 一2，．链2050μmLm10ol×/L 以TMV、CM(2VNμ、HLT4dEN)V2T、SPO( 各4，2．0．5m1%moTlw/Le)e，n210］μL，上2游μL和2下5 游mm引o物l /混L M合g物Cl2， PVY 和TVBM( 各V 150种μm病ol /L) ，0． 2 μL Taq DNA 聚合酶( 5 U /μL) 和2 μL 毒的反转录产cD物N作A 为模P板C。R PCR 反应循环参数: 94℃预变性3 min; 94℃变性 反应的模板，30经sP，C4R8℃扩退火30 s，72℃延伸1 min，循环30 次; 72℃延伸 增分别得到大10小m为in2。37取、5 μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较 273、347、456 和547 bp 的5 条特异性条带
检测步骤
1．2引物的设计与筛选
应用Primer Premier 5． 0 引物设计软件分别设计这5 种病 毒的特异引物TMV cpF /TMV cpR、CMV cpF /CMV cpR、 TEV cpF /TEVcpR、PVY cpF /PVY cpR 和TVBMV cpF /TVBMVcpR。由于多重RT-PCR 要求在同一退火温度下同 时扩增多个目的片断，因此对设计的大量引物进行筛选， 选择Tm 值较一致的各对引物，以保证在同一退火温度下同 时检测到TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 这5 种病毒
病毒混合侵染烟草的检测
2007 －2008 年对陕西泾阳、乾县等烟区进行采样调查，样 品检测结果显示: 烟草花叶病毒( TMV)、黄瓜花叶病毒 ( CMV) 、烟草蚀纹病毒( TEV) 、马铃薯Y 病毒( PVY)和烟 草脉带花叶病毒( TVBMV)都有发生，且多为复合侵染. 采集复合侵染的烟叶进行多重RT-PCR 检测，结果显示烟草 中2 种、3 种和4 种病毒复合侵染都存在。
植物化学保护：烟草花叶病毒病
烟草病毒病损失情况
• 山东省 1974-1977年的4年中， 有 3年烟草 病毒病流行发生， 其 中 1975年大流行， 重病田减产20%-50%，夏烟田感病品种减 产达70%以上。
• 目前，山东省烟 草病毒病每年发病面积达 40万亩，发病率在20%-80%，经济损失每 年达 2000余万元。
——烟草病毒病及其危害
烟草上胜红蓟黄脉病毒和广东番木瓜曲叶病毒
心叶烟 普通烟
苎麻花叶病毒(RaMoV)，导致普通烟矮化的病原；寄主范围广。
普通烟 珊西烟
本氏烟 三生烟
危险性检疫病毒——南芥菜花叶病毒病
TRV？
TEV
TEV
TLCV
TLCV
丛顶病
脚叶烘烤后效果
单叶
左图为烤房中脚叶，上 图为脚叶单叶。
第一炕下炕情形
➢This gives rise to the name mosaic
to refer to the pattern of light
green and
dark green tissue,
or dark green islands.
Tobacco Mosaic Virus Infected Plant
பைடு நூலகம்
烟草花叶病症状
• 自苗期至收获期均能发病 。病株呈现典型的花叶症 状。嫩叶发病，先是脉明 ，以后形成浅绿和深绿病 斑，叶缘有时向背面卷曲 。由于受害叶片部分细胞 增多或增大，致使叶片厚 薄不匀，皱缩扭曲，呈畸 形，并有不规则的缺刻， 严重时延长呈柳叶状，或 呈带状。早期发病烟株节 间缩短，植株矮化，生长 缓慢或不育。病重的烟株 花变形，蒴果小而皱缩， 所产生的种子，发芽力很 差。
➢ Green islands typically do not contain very much virus which explains
烟草花叶病毒简介
烟草花叶病毒简介目录•1拼音•2英文参考•3中文名称•4英文名称•5分类类型•6分类•7GeneBank编号•8烟草花叶病毒基本特性1拼音yān cǎo huā yè bìng dú2英文参考Tobacco mosaic virusTMV3中文名称烟草花叶病毒4英文名称Tobacco mosaic virus；TMV5分类类型种6分类帚状病毒科>烟草花叶病毒属>烟草花叶病毒7GeneBank编号[AF1 65190]8烟草花叶病毒基本特性烟草花叶病毒先后在我国山东、河北、山西、四川、北京、上海等地的烟草上发现。
病毒粒子呈长杆状，大小为18nm×300nm，核衣壳为螺旋状，核酸为ssRNA。
病毒感染普通烟、三生烟产生斑纹花叶，侵染心叶烟产生局部枯斑。
病毒感染辣椒产生坏死斑区，感染豌豆呈黄化、小叶。
TMV基因组的单链RNA由6395个堿基组成其5’端有m7GpppG的帽子结构，在5’端帽子结构之后有一段由69bp组成的5’端非翻译区，3’端的非翻译区可折叠成一个类似于tRNA的结构，能够接受组氨酸（His）。
病毒基因组共有4个ORFs相互重叠，靠近5’端的第一个ORF编码合成126kD蛋白，但经过终止密码子UAG 通读能够产生183kD蛋白。
126kD蛋白包含甲基转移酶methyltransferase和解旋酶helicase的共有基序，183kD蛋白则有病毒RNA聚合酶活性。
病毒基因组的4个ORF是相互重叠的，183kD ORF除了与126kD ORF重叠外，在其3’端还有5个密码子与30kD ORF相重叠。
17.5kD ORF编码外壳蛋白，它与30kD蛋白是通过共同的3’末端亚基因组RNA翻译的。
烟草花叶病毒不是通过媒介昆虫进行传播，但通过人工或机械接种却极容易使健康植株感染病毒。
当病毒侵入到植物表皮细胞的细胞质后，开始脱壳，并在RNA5’端脱去外壳的部分结合上核糖体，，边脱壳边翻译合成蛋白，一旦126kD 蛋白和183kD蛋白合成，外壳蛋白便随之迅速脱去。
烟草花叶病毒
TMV的形态特征
TMV的形态特征
烟草花叶病毒具有杆状外观。它的衣壳由2130分子衣壳蛋白和一分子基因组单链正义RNA组成，长6400个碱基。外壳蛋白在RNA周围自组装成杆状螺旋结构（每螺旋圈16.3个蛋白质），形成发夹环结构。蛋白质单体由158个氨基酸组成，这些氨基酸被组装成四个主要的α-螺旋，这些螺旋通过近于病毒体轴的突出环连接在一起。病毒粒子的长度约为300nm，直径约为18nm。负染色的电子显微照片显示出半径为2nm的独特内部通道。RNA位于4nm的半径处，并被外壳蛋白保护免受细胞酶的作用。基于3.6Å(0.36纳米)分辨率的电子密度图，研究了完整病毒的X射线纤维衍射结构。衣壳螺旋内部的核心附近是卷曲的RNA分子，它由6395±10个核苷酸组成
TMV病毒基因组
TMV基因组由6.3–6.5 kb单链（ss）RNA组成。 3'末端具有类似tRNA的结构，而5'末端则具有甲基化的核苷酸帽——m7G5’pppG。基因组编码4个开放阅读框（ORF），其中两个由于泄漏的UAG终止密码子的核糖体通读而产生单一蛋白质。 这4个基因编码一个复制酶（具有甲基转移酶[MT]和RNA解旋酶[Hel]域）和RNA依赖性RNA聚合酶，所谓的运动蛋白（MP）和衣壳蛋白（CP）。
致谢
TMV的发现
TMV 的第一张电子品微镜图像是1939年由 Gustav Kausche , Edgar Pfankuch 和 HelmutRuska 制成的1955年， Heinz Fraenkel-Conrat 和 Robley Williams 表明纯化的TMV RNA 及其衣壳(外壳）蛋白自行组装成功能性病毒，表明这是最稳定的结构（自由能最低的结构）1958年，晶体学家罗莎琳德 • 富兰克林(Rosalind Franklin）设计并制造了 TMV 模型，她推测该病毒是空心的，而不是固体，并推断TMV 的 RNA 是单链的TMV是第一个被鉴定为病毒的病原体
烟草花叶病毒（TMV）基因编码蛋白研究进展
烟草花叶病毒（TMV）基因编码蛋白研究进展摘要：烟草花叶病毒属基因组编码四种蛋白，大小分别为126kD、183kD、30kD和17.5kD.本文综述了近年来有关这四个蛋白质的表达、功能和外壳蛋白合成抑制物等方面的一些研究结果，以期为这方面的研究提供理论依据。
关键词：TMV基因编码蛋白表达功能烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）属于烟草花叶病毒属。
该属基因组编码四种蛋白，大小分别为126kD、183kD、30kD和17.5kD.其中126kD和183kD蛋白参与病毒的复制，称为RNA依赖的RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase，RdRP）的亚基；183kD的蛋白是126kD 蛋白的阅读框终止子通读的产物；30kD蛋白参与病毒在寄主细胞间的移动，称为运动蛋白（Movementpro2tein，MP）；17.5kD的蛋白为病毒的外壳蛋白（Capsidprotein，CP）。
烟草花叶病毒（TMV）侵染后30～40小时感病叶内126KDa和183KDa蛋白质达到高水平；外壳蛋白在侵染后10小时才开始合成，30～40小时达到高峰；相比之下，体内30KDa蛋白质早就出现，在侵染后20小时达最高值，这很可能与30KDa涉及负责病毒在细胞与细胞间的转运有关。
1 126kD/183kD蛋白1.11 26kD/183kD蛋白表达烟草花叶病毒通过机械伤口或者借助媒介昆虫进入细胞内，在病毒颗粒部分脱壳露出基因RNA的5′端时即侵染后1-10分钟内，翻译开始首先合成126KDa和183KDa的两种蛋白质。
183KDa 是由126KDa基通读而产生，Tyr插在这个琥珀型终止子上，有6个保守的核苷酸［1］。
1.21 26kD/183kD蛋白功能烟草花叶病毒复制所需依赖的RNA的聚合酶由两部分组成：一是由寄主提供的亚基，一是由病毒编码的特异的复制酶亚基组合成有专一性的全酶。
[2]183KDa有RNA依赖的RNA聚合酶的结构，126KDa的C端有类似于螺旋酶和甲基转移酶的基本结构［3，4］。
烟草花叶病毒（TMV）的结晶及其化学本质的发现
烟草花叶病毒（TMV）的结晶及其化学本质的发现烟草花叶病毒⼀、温德尔·斯坦利⽣平简介温德尔·斯坦利（1904-1971），美国⽣物化学家，1904年8⽉16⽇⽣于美国印第安纳州。
曾任洛克菲勒医学研究院院⼠，加利福尼亚⼤学教授。
斯坦利所研究的是可⾃我复制却有似⼀种简单的化学物质的⽣物——病毒。
他的发现使⼈类了解⽣命的本质⼜向前跨进了⼀⼤步。
斯坦利推测认为，病毒可能是地球⽣命的第⼀种形式。
1935年，他使烟草花叶病毒（TMV）结晶，并证实此病毒是蛋⽩质及核酸分⼦聚集体⽽称为杆状结构。
这⼀发现可以利⽤X射线衍射⽅法来确切地查明多种病毒精细的分⼦结构及繁衍⽅式。
斯坦利还研究了流感病毒并研制了⼀种流感疫苗。
1946年，他因提纯并结晶了病毒，⽽且阐明了其分⼦结构⽽与诺斯罗普及萨姆纳共同获得了1946年诺贝尔化学奖。
斯坦利于1971年6⽉15⽇在西班⽛萨拉曼卡去世，享年67岁。
⼆、主要研究贡献1935年，温德尔·斯坦利（Stanley）发现烟草花叶病毒的侵染性能被胃蛋⽩酶破坏，在这⼀现象的启⽰下，他⼏乎磨了上吨重的感染花叶病的烟叶，企图⽤提酶的⽅法把病毒提纯出来。
他得到了⼀⼩匙在显微镜下看来是针状结晶的东西，把结晶物放在少量⽔中，⽔就出现乳光了，⽤⼿指沾⼀点这溶液，在健康烟叶上磨擦⼏下，⼀星期以后这棵烟草也得了同样类型的花叶病。
可见提纯的东西的确是有侵染性的烟草花叶病毒。
今天在美国加州⼤学的原来斯坦利实验室⾥，仍然保留着⼀个标注着“Tob. Mos.”字样的瓶⼦，其中就盛着当年第⼀次提纯的烟草花叶病毒（简称TMV）。
根据各种试验结果，证明这种结晶物质是蛋⽩质，初步的渗透压和扩散测定表明，这种蛋⽩质的分⼦量⾼达⼏百万。
其结晶制品的侵染性依赖于蛋⽩质的完整性，侵染性被认为是病毒蛋⽩质的⼀种性质。
Stanley 的研究论⽂1953年发表在Science杂志上，他在论⽂中写道：“烟草花叶病毒是⼀种具有⾃我催化能⼒的蛋⽩质，它的增殖需要活体细胞的存在”。
烟草病毒病
烟草病毒病Tobacco Viral Diseases烟草病毒病是世界各烟草产区普遍发生的一类重要病害，种类很多，国外报道已从烟草上分离到的病毒有27种左右，国内已发现16种，其中发生普遍的有烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯Y病毒（PVY）和烟草蚀纹病毒（TEV）等。
各种病毒病在不同的地区间分布略有差异，TMV主要分布在东北、云南、贵州、广东、四川等烟区，CMV 主要发生在黄淮、西南、西北、福建等烟区，在很多地区还存在TMV和CMV的复合侵染。
马铃薯Y病毒90年代以前在大多数烟区发生较轻，90年代中后期在某些烟区如山东、安徽、云南及东北等省区危害加重，1996年皖北烟区马铃薯Y病毒的暴发流行，曾给烟叶生产造成巨大损失，山东的PVY与CMV复合侵染也是生产上亟待解决的问题。
症状TMV引起的烟草花叶病：苗期至大田期均可发生，烟株感病后一般5~7d表现症状。
发病初期，新叶叶脉颜色变浅，呈半透明状明脉，随后叶脉两侧叶肉组织褪绿，形成黄绿相间的斑驳或花叶。
田间症状因气候条件、病毒株系不同而异，大致可分为两种类型：一是轻型花叶，仅表现为叶片褪绿，形成黄绿相间的花叶或驳斑，植株高度及叶片形状、大小均无明显变化。
一般成株期感病，易表现此类症状；另一种为重型花叶，叶片上部分叶肉组织增大或增多，叶片厚薄不匀，形成很多泡状突起，叶片皱缩，扭曲畸形，叶尖细长有时叶缘背卷。
若苗期感病，则发病更重。
整个植株节间缩短，严重矮化，生长缓慢，几乎无经济价值。
后期不能正常开花结实，或结出的蒴果小而皱缩，种子量少，多数不能发芽。
CMV引起的烟草花叶病：与TMV在田间症状相似，有时不容易区别。
发病初也表现明脉，然后形成花叶，重病叶也会表现扭曲，形成泡状突起等症状。
但随病毒株系、品种不同而症状有较大变化。
除表现花叶外，有时伴有叶片狭窄，叶基呈拉紧状，叶片上茸毛稀少，叶色发暗，无光泽。
病叶有时粗糙，发脆呈革质，叶基部伸长，侧翼变窄变薄，叶尖细长。
烟草花叶病毒
烟草花叶病毒烟草花叶病毒tobacco mosaic virus 缩写TMV，为RNA病毒，是烟草花叶病等的病原体，属于Tobamovirus群，是烟草生产上分布最广、发生最为普遍的一类病害，对烟草的危害极大。
烟草花叶病和番茄花叶病早为一般所了解。
叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形。
烟草本是生长在墨西哥的一种植物十五世纪到十六世纪，哥伦布、麦哲伦等发现“新大陆”时见到当地人有抽烟的的习惯，便把烟草带回欧洲。
之后，烟草很快便繁殖开了。
这种病毒通常作用于植物。
烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus；TMV），又译为烟草花叶病毒，是一种单链RNA病毒，专门感染植物，尤其是烟草及其他茄科植物，能使这些受感染的叶片看来斑驳污损，因此得名（mosaic为马赛克，也就是拼贴之意）。
19世纪末期人们已知有某种威胁烟草作物生存的疾病，但直到1930年才确知此病毒的存在。
是烟草花叶病等的病原体，属于Tobamovirus群。
烟草花叶病和番茄花叶病早为一般所了解。
叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形。
1883年，德国科学家Adolf Mayer发现可以通过提取染病叶片的汁液涂抹到健康叶片上的方法将烟草花叶病转移。
在汁液中寻找可染病的微生物失败后，Mayer认为引起病症的微生物是一种极小的在显微镜下不可见的细菌；伊凡诺夫斯基（D．I．Iwanowski）于1892年首次证明了这个病害是由滤过性病原体所引起的，但是伊凡诺夫斯基坚持认为是可过滤性的细菌或其分泌的毒素导致了烟草花叶病；1897年，荷兰植物学家贝叶林克（Martinus Beijerinck ）通过一系列经典的实验证实过滤液中的染病源是可以复制的，实际上，病原体只在它感染的宿主中复制。
在更深入的实验中，贝叶林克发现这种病原体并不像细菌一样可以在有营养物的试管或培养皿中培育，他假象这是一种比细菌更小更简单的可复制颗粒，贝叶林克也因此被公认为第一个提出病毒概念的科学家；1935年，贝叶克林的猜测被斯坦利（W．M．Stanley）证实，他认为病原体是蛋白质并于1935年首先从病叶榨汁中分离到病毒状结晶，其以了解到这个蛋白质还含有核酸，并肯定病原就是这个病毒。
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检测步骤
• 1.4 多重RT-PCR
优C1板∶.M4P化的VV∶后比Y∶1∶的例T∶ET为5•VV1对TB∶∶M引M多 P， 重 时VP1V物V重反R加V∶∶=Y比YT1C1:R转入例.-和．TM5PTV为，录一V-CT4BPT5∶∶MVR合个M种CVB1TVR∶反模成反E=M∶V应反应cVD5应的管N种A体模进，病系板行将毒:，P取RC的将TRT混各M产反合V病物应、病毒随。C株特机M提异混V取、性合总T引作ER物V为N、同多A 1∶ 1∶ 1．• 6。退。火结温果 度分别选择42℃、45℃、48℃、51℃、 显示，退火温度54在℃48和℃和575℃1℃;所延伸时间分别为40、50、60、70、 获得的目的条带80相和对较90好。s;延循伸环次数选择20、25、30、35、40 时间在60 和90和s4能5获个得循理想环的进结行多重RT-PCR体系优化
谢 谢!
Байду номын сангаас
小结
• 一直以来多重RT-PCR 灵敏度没有单重RT-PCR 高。本研究针 对影响多重RT-PCR 的引物浓度、Mg2 + 浓度和退火温度等 方面进行优化。研究发现，引物设计是多重RT-PCR 中非常 关键的一步。引物的选择对实验的成败起着关键作用，既要 使引物具有特异性，又要避免引物之间的相互影响，同时要 尽量使各对引物的退火温度相一致。通过Blast 在线序列比 对调整引物，使各条引物之间尽量不存在互补，有效减少了 引物二聚体的存在。设计引物时使各对引物的Tm 值较一致， 保证在同一退火温度下同时扩TMV、CMV、TEV、PVY 和 TVBMV 5种病毒
病毒混合侵染烟草的检测
• 2007 －2008 年对陕西泾阳、乾县等烟区进行采样调查，样 品检测结果显示: 烟草花叶病毒( TMV)、黄瓜花叶病毒( CMV) 、烟草蚀纹病毒( TEV) 、马铃薯Y 病毒( PVY)和烟草 脉带花叶病毒( TVBMV)都有发生，且多为复合侵染.
• 采集复合侵染的烟叶进行多重RT-PCR 检测，结果显示烟草 中2 种、3 种和4 种病毒复合侵染都存在。
果，而且40、50、70 和80 s 之 间没有明显 的差别(
检测步骤
• 1. 6 PCR产物的克隆和测序
多重RT-PCR 扩增DNA 靶片段采用H.Q.＆.Q.凝胶回收试 剂盒回收纯化后，纯化的PCR 产物与pMD18-T simple vector 4℃ 过夜连接，采用CaCl2 法制备大肠杆菌JM109 感受态细胞，连接产物转化大肠杆菌JM109，用Amp 抗性 和半乳糖苷酶的底物X-gal 进行蓝白斑筛选。阳性克隆经 菌落PCR 和限制性酶酶切分析进一步筛选后，提取质粒委 托金思特科技( 南京) 有限公司测序。
• DNA 扩增片段的大小是影响多重RT-PCR 的另一个重要因素， 若片段大小差别过大会影响到片段延伸时间的设定，因此本 研究扩增5 个片段大小选择在200 ～ 500 bp 之间。由于多重 RT-PCR 需要在同一体系中同时扩增出多条片段，扩增片段 的大小存在差异，再加上不同引物的特异性程度不尽相同， 因此引物浓度和模板的量是影响多重RTPCR的一个至关重要 的因素，在建立多重RT-PCR体系的过程中需要对引物浓度和 模板的量进行反复摸索，以获得一个最适量
检测步骤
• 1.3 单重RT-PCR
单果重RT-P••CR用2P电5CMμR泳-LMb检PuLC测VffeR反结r 标［转准7录5反0酶m应反m体转o系l录/L:合1T4成r．is各-H3病Cμl毒L( pdcHdDH8N．2AO第8，) 一，2．链2050μmLm1o0l×/L 以TMV、CM(，VN2、HμT4LE)dV2N、STOP4(，各02．．15%mTmwoel e/Ln)2，0］1 ，μL2上μL游2和5 下mm游o引l /物L M混g合C物l2 PVY 和TVBM( 各V 150种μm病ol /L) ，0． 2 μL Taq DNA 聚合酶( 5 U /μL) 和2 μL 毒的反转录产cD物N作A为模P板C。RPCR 反应循环参数: 94℃预变性3 min; 94℃变性 反应的模板，30经sP，C4R8℃扩退火30 s，72℃延伸1 min，循环30 次; 72℃延伸 增分别得到大10小m为in2。37取、5 μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较 273、347、456 和547 bp 的5 条特异性条带