过氧化物酶体增殖体激活受体γ激动剂对炎症状态下人肾小球系膜细

中国医药导报２０１５年７月第１２卷第２０期　・论　著・　过氧化物酶体增殖体激活受体　激动剂对炎症　状态下人肾小球系膜细胞ＡＢＣＡ１表达的影响　

刘　华　首都医科大学宣武医院肾内科，北京１０００５３　

【摘要】目的研究过氧化物酶体增殖体激活受体￣（ＰＰＡＲ一　）激动剂１５一脱氧前列腺素Ｊ２（１５ｄ—ＰＧＪ２）对炎症状态　下人肾小球系膜细胞（ＨＭＣ）ＡＴＰ结合盒转运体Ａ１（ＡＢＣＡ１）表达的影响，探讨影响受体表达和延缓肾小球疾病　进展的可能干预措施。方法培养的ＨＭＣ随机分为５组继续培养２４　ｈ：空白组：普通培养的细胞；对照组：５　ｎｇ／ｍＬ　白细胞介素一１１３（ＩＬ－１１３）；实验组：５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ一１１３＋２．５￣ｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ—ＰＧＪ２，５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ一１１３＋５　ｔ￣ｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ—ＰＧＪ２。５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ一１１３＋１０　Ｉ．ＬｍｏＹＬ　１５ｄ—ＰＧＪ２，应用实时定量ＰＣＲ法测定不同剂量ＰＰＡＲ—　激动剂１５ｄ—ＰＧＪ２对ＩＬ一１ｐ作用下　ＨＭＣ　ＡＢＣＡ１　ｍＲＮＡ的影响。培养的ＨＭＣ随机分为４组继续培养２４　ｈ：空白组：普通培养的细胞；对照组：５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ一１１３；实验组：５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ一１１３＋５　Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ—ＰＧＪ２，５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ一１１３＋１０　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ—ＰＧＪ２，应用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹方法　测定不同剂量１５ｄ—ＰＧＪ２对ＩＬ一１ｐ诱导的ＡＢＣＡ１蛋白表达的影响。结果炎症因子ＩＬ一１ｐ能够抑制ＨＭＣ的　ＡＢＣＡ１表达，１５ｄ—ＰＧＪ２呈剂量依赖性地增加ＩＬ－１１３抑制的ＡＢＣＡ１　ｍＲＮＡ和蛋白表达。与对照组（５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ一１１３）　比较，２．５、５、１０　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ—ＰＧＪ２实验组ＡＢＣＡ１　ｍＲＮＡ表达分别升高１．３４、２．１５、２．８８倍，５、１０　ｗｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ—ＰＧＪ２　实验组ＡＢＣＡ１蛋白表达分别升高１．１６、１．５４倍。结论ＰＰＡＲ一　激动剂１５ｄ—ＰＧＪ２剂量依赖性改善ＩＬ一１ｐ对　ＡＢＣＡ１　ｍＲＮＡ和蛋白表达的抑制，对炎症导致的系膜细胞脂质失衡具有保护作用。　【关键词】过氧化物酶体增殖体激活受体　激动剂；系膜细胞；白细胞介素１ｐ；ＡＴＰ结合盒转运体Ａ１　［砗，图分类号】Ｒ６９２　ｆ文献标识码】Ａ　［文章编号】１６７３—７２１０（２０１５）０７ｆｂ）一０００７－０５　

Ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｖ　ａｇｏｎｉｓｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘ－　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　Ａ１　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｓａｎｇｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ—ｌ　ｐ　￡ｉｕＨｕａ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，Ｘｕａｎｗｕ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃａｐｉｔａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００５３，Ｃｈｉｎａ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ一　（ＰＰＡＲ一　）ａｇｏｎｉｓｔ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｓａｎｇｉａｌ　ｃｅｌｌ（ＨＭＣ）ｂｙ　ｔｈｅ　ｒｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　Ａ１（ＡＢＣＡ１）ｗｈｅｎ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１　１３　０Ｌ一１　１３）ｆｒｏｍ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｋｉｄｎｅｙ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＨＭＣ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　２４　ｈｏｕｒｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄ－　ｅｄ　ｉｎｔｏ　５　ｇｒｏｕｐｓ：ｂｌａｎｋ　ｇｒｏｕｐ：ｎｏｒｍａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ；ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ：ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　５　ｎｇ，ｍＬ　ＩＬ－　１１３；ｓｔｕｄｙ　ｇｒｏｕｐ：ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ　ｂｙ　５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－１１３＋２．５　Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ－ＰＧＪ２，５　ｎ　ｍＬ　ＩＬ－１１３＋５　￣ｍｏＹＬ　１５ｄ－ＰＧＪ２，５　ｎ咖Ｌ　ＩＬ－１３＋１０　ｍ０ｌ／Ｌ　１５ｄ－ＰＧＪ２，ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＡＢＣＡ１　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｕｓｉｎｇ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ．Ｓｉｍｉｌａｒｌｙ，ＨＭＣ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　２４　ｈｏｕｒｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　４　ｇｒｏｕｐｓ：ｂｌａｎｋ　ｇｒｏｕｐ：ｎｏｒｍａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｉｌｓ；　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ：ｃｕｈｕｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　５　ｎ　ｍＬ　ＩＬ－１１３；ｓｔｕｄｙ　ｇｒｏｕｐ：ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｉｌｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ　ｂｙ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－１１３＋５　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ－ＰＧＪ２，５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－１３＋１０￣ｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ－ＰＧＪ２，ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＡＢＣＡ１　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＡＢＣＡ１　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＨＭＣ　ｃａｎ　ｂｅ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＩＬ－－１１３　ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　１５ｄ－ＰＧＪ２　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．Ｗｈｅｎ　ｃｏ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　２．５，５，１０　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　１５ｄ—ＰＧＪ２，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＡＢＣＡ１　ｍＲＮＡ　ｏｆ　ＨＭＣ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　１－３４，２．１５，２．８８　ｔｉｍｅｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＡＢＣＡ１　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　１．１６，１．５４　ｔｉｍｅｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｗｈｅｎ　ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　５，１０　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　１５ｄ－ＰＧＪ２，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＡＢＣＡ１　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ＩＬ－１１３　ｃａｎ　ｂｅ　ｏｆｆｓｅｔ　ｂｙ　１５ｄ＇ＰＧＪ２　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎ—　ｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ　ｗｈｉｃｈ　ｍｅａｎ　ｔｈａｔ　ＰＰＡＲ＇￣／ａｇｏｎｉｓｔ　ｈａｓ　ａ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＨＭＣ　ｆｏｒ　ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｂｙ　ｉｎｆｌａｍｍａ－　ｔｏｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｔ　ａｇｏｎｉｓｔ；Ｈｕｍａｎ　ｍｅｓａｎｇｉａｌ　ｃｅｌｌ；Ｉｎｔｅｄｅｕｋｉｎ－１１３；ＡＴＰ－ｂｉｎｄ—　ｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　Ａ１　【基金项目】北京市科委资助项目（ＳＣＷ２００９—０７）。　

ＣＨＩＮＡ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＨＥＲＡＬＤ　Ｖｏ１．１　２　Ｎｏ．２０　Ｊｕｌｙ　２０１　５　・论　著・　越来越多的证据表明。肾小球硬化与动脉粥样硬　化有相似的病理改变和病理生理机制，脂质负荷细胞　的表达是肾小球硬化和动脉粥样硬化的特征性的改　变。动脉粥样硬化的实质是血管壁的慢性炎症，因此　炎症因子与脂质共同作用是导致肾小球硬化发生发　展的主要致病因素。研究炎症如何在细胞水平影响胆　固醇稳态是明确其介导肾脏损害的关键。细胞内脂质　稳态涉及脂质的摄取和排出两方面的平衡。ＡＴＰ结合　盒转运体Ａ１（ＡＢＣＡ１）是ＡｒＩＰ结合盒转运体（ＡＢＣ）超　家族的成员之一，在胆固醇逆转运（ＲＣＴ）和高密度脂　蛋白胆固醇（ＨＤＬ—ｃ）生成的起始步骤中起重要作用，　具有抗早期动脉粥样硬化的功能【１］。过氧化物酶体增　殖体激活受体￣（ＰＰＡＲ一　）是核激素受体超家族成员　之一。在多种转录调控的细胞行为中都发挥重要作　用，但是否影响炎症状态下系膜细胞内胆固醇稳态的　相关研究较少。本实验旨在揭示ＰＰＡＲ一　激动剂在炎　症因子白细胞介素一Ｉ￣（ＩＬ—ｌｐ）存在情况下对ＡＢＣＡ１　表达的影响．探讨影响受体表达和延缓肾小球疾病进　展可能的干预措施。　１材料与方法　１．１材料　转染Ｔ—ＳＶ４０和Ｈ—ｒａｓ癌基因的人肾小球系膜　细胞株（ＨＭＣＬ）由英国Ｒｏｙａｌ　Ｆｒｅｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ肾脏病中　心ＲＵＡＮ　Ｘｉｏｎｇｚｈｏｎｇ教授惠赠。ＲＰＭＩ一１６４０培养液及　胎牛血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ）。ＩＬ－Ｉ￣（Ｒ＆Ｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），　Ｏｘ－ＬＤＬ（中国医学科学院基础所），ＡＢＣＡ１抗Ｉ体（Ｎｏｖｕｓ，　ｕ．ｓ－Ａ）溶于０．５　ｍＬ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ），分装一７０ｃＩ＝　保存。ＰＣＲ反应体系、逆转录酶（ＭＭＬＶ）缓冲液（Ｐｒｏｍｅｇｅ，　ｕ．ｓ．Ａ），ｄＮＴＰ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）、引物均由上海生工生物工　程公司合成，ＡＢＣＡ１引物序列：上游５＂－ＡＴＦＣＧＣＴＣＴ．　ＧＡＧＡＴＧＡＧＣＡＣＣＡ一３　：下游５　一　ｒＩＴＣＡＡＧＣＧＧＧＣＡＴ　ＡＧＡＡＣＣＡ一３　。ＧＡＰＤＨ引物序列：上游５＂－ＧＣＡＣ—　ＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ一３　下游５　一ＡＴＧＧＴＧＧＴ－　ＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴ一３　。１５ｄ－ＰＧＪ２：１５－ｄｅｏｘｙ－Ａ１２，１４－　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｊ２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ｕｓａ），化学分子式Ｃ２ｏＨ２８０３，　溶于二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），贮液浓度为１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　分装，一２０℃冻存备用。工作液ＤＭＳＯ终浓度为０．１％　（ｖ／ｖ）。　１．２　ＨＭＣ细胞的培养和鉴定　用１０％ＦＣＳ的ＲＰＭＩ１６４０细胞培养液在３７℃。　５％Ｃ０：培养箱中孵育培养ＨＭＣＬ细胞，以０．０１　ｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ冲洗细胞．０．２５％胰蛋白酶／０．０２５％乙二胺四乙酸　（ＥＤＴＡ）消化，１０％ＦＣＳ的ＲＰＭＩ１６４０培养液悬浮细胞　传代培养。间接免疫荧光法检测：胞浆Ａｃｔｉｎ、Ｃｏｌｌａ．　ｇｅｎ　１Ｖ、Ｆｉｂｒｏｎｎｅｃｔｉｎ及Ｖｉｍｅｎｔｉｎ染色阳性，Ｃｙｔｏｋｅｒ－　翻ＣＨＩＮＡ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＨＥＲＡＬＤ　Ｖｏ１．１２　Ｎｏ．　２Ｏ　Ｊｕｌｙ　２０１５　中国医药导报２０１５年７月第１２卷第２０期　ａｔｉｎ、Ｖｉ因子染色阴性。　１．３　１５ｄ－ＰＧＪ２的细胞毒性试验细胞形态学观察　①细胞形态学观察。静止细胞后分别换用含终浓　度为０、２．５、５、１０、１５、２０￣ｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ—ＰＧＪ２的０．２％　ＦＣＳ　ＲＰＭＩ１６４０培养基培养２４　ｈ，４０倍相差显微镜下　观察ＨＭＣ细胞形态的改变。②锥虫蓝排斥试验。分组　方法同上，培养２４　ｈ收集各组细胞，ＰＢＳ轻洗，胰酶　消化后离心，细胞沉淀用Ｎｓ制成悬液，锥虫蓝染色，　随机计数５个视野所有细胞。死亡细胞百分数以核蓝　染的细胞数占总细胞数的百分比表示。③ＬＤＨ释放　试验。分组同上，培养２４　ｈ收集各组细胞。不含药物　的６孔细胞设为低水平对照组。高水平对照组于实验　前加入２００　１％Ｔｆｉｔｏｎ破坏细胞。各孔取１００　ＩｘＬ上　清加入１００　Ｌ反应混合物，室温避光３０　ｍｉｎ，不含细　胞的培养液校零。酶标仪４９０　ｎｍ波长检测。细胞毒性　指数＝（实验组ＯＤ值一低水平对照组ＯＤ值）／（高水平　对照组ＯＤ值一低水平对照组ＯＤ值）ｘ１００％，即为细　胞死亡百分数。　１．４实时ＰＣＲ检测ＡＢＣＡ１　ｍＲＮＡ表达　１５ｄ—ＰＧＪ２对ＩＬ一１Ｂ诱导的ＡＢＣＡ１　ｍＲＮＡ表达　的影响：培养细胞静止后，４０　ｗｇ／ｍＬ　Ｏｘ—ＬＤＬ预先孵　育２４　ｈ，随机分为５组，每组３皿，空白组：普通培养　的细胞、对照组：５　ｎｇ，ｍＬ　ＩＩ，＿ｌＢ及３个实验组：５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＩ，－１Ｂ＋２．５／ｘｍｏＦＬ　１５ｄ—ＰＧＪ２，５　ｒｉｇ／ｍＥ　ＩＬ－１ｐ＋５／￣ｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ—ＰＧＪ２，５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－１　１３＋１０　ｐＬｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ—ＰＧＪ２。３７℃　培养２４　ｈ收获细胞，提取总ＲＮＡ，合成ｃＤＮＡ，２５　ｗＬ　ＰＣＲ　曾：ＤＥＰＣ水１５　Ｌ，弓Ｉ物（ＰＩ＋Ｐ２）Ｉ　ｉｚＬ，　ＲＴ产物２　ｉｚＬ，ＳＹＢＥＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ染料１２５　ｗＬ，９５℃１０　Ｓ，　９５℃１５　Ｓ，６０ｏＣ　３０　Ｓ，共扩增４０～５Ｏ个循环。　１．５　Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测ＡＢＣＡ１蛋白表达　１５ｄ—ＰＧＪ２对ＩＬ—ｌｐ诱导的ＡＢＣＡ１蛋白表达的　影响：培养细胞静止后。４０　ｗｇ／ｍＬ　Ｏｘ—ＬＤＬ预先孵育　２４　ｈ，随机分为４组，每组３皿，空白组：普通培养的　细胞，对照组：５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ＿１ｐ，实验组：５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ一１ｐ＋　５　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ—ＰＧＪ２．５　ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－ｌ［３＋ｌＯ　Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ　１５ｄ－　ＰＧＪ２，３７。【＝培养２４　ｈ收获细胞，提取总蛋白。上样蛋　白质２５０　ｇ，电泳、转膜５　ｈ，封闭缓冲液过夜，１：６００