酶工程考试重点

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第一章绪论

1、什么是酶工程：

是一项利用酶、含酶细胞器或细胞(微生物、动物植物)作为生物催化剂来完成重要的化学反应，并将相应底物转化成有用物资的应用型生物高新技术。

2、酶对日常生活生产的影响：

①作为一种新的工业催化剂；②用于食品加工；③用作医药；④用作分析试剂；⑤用于筛选新的生理活性物质；⑥用作开发新能源；⑦用于污水处理。

3、固定化酶的优点：

①稳定性高；②酶可反复利用；③产物纯度高，副产物少，从而有利于提纯；

④生产可连续化，自动化；⑤设备小型化，节约能源等。

第二章和第三章

1、酶的生产方法：

①提取分离法；②生物合成法（发酵法）；③化学合成法。

2、产酶的微生物：

①细菌：无芽孢杆菌、芽孢杆菌、球菌；

②放线菌：链霉菌（主要产胞外酶和抗生素）；

③酵母菌：酿酒酵母（真核生物）；

④霉菌：根霉、毛霉和犁头霉；

⑤曲霉：青霉、木霉。

3、酶生物合成的模式：

①生长偶联型：酶的合成与细胞生长同步进行，所以又称同步合成型。当细胞进入生长期，酶即开始大量合成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随即停止。（根瘤生产脂肪酶和树状黄杆菌生产葡萄糖异构酶）

②非生长偶联型：只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累，所以又称滞后合成型。（黑曲霉产生的酸性蛋白酶）

③部分生长偶然联型：又称连续合成型，酶的合成与细胞生长同步开始在细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续合成。（黑曲霉中聚乳糖醛酸酶）

4、提高酶产量的策略：

⑴条件控制：

①添加诱导物：酶的作用底物、酶作用底物的前体、酶的反应产物、酶的底物类似物或底物修饰物等。

②降低阻遏物浓度：设法从培养基中除去其终产物，以消除反馈阻遏；向培养基中加入代谢途径的某个抑制因子，切断代谢途径通路，可限制细胞内末端产物的积累，便可达到缓解其反馈阻遏的目的；

③促进分泌；

④添加产酶促进剂。

⑵遗传控制：①改良菌种：使诱导型变为组成型；使阻遏型变成去阻遏型；

②基因工程育种。

5、用于产酶细胞需具备哪些条件：

①酶的产量高；②容易培养和管理；③产酶性能稳定；④利于酶产品的分离纯化；⑤安全可靠。

第四章酶的分离和纯化

1、细胞破碎方法：

①机械法：机械捣碎法、研磨破碎法、匀浆破碎法、改进高压法（X-press 法）、超声波破碎法；

②非机械法：酶溶法、外加酶法、自溶法、化学渗透法、物理法、干燥法；

2、酶分离纯化中离心分离的方法：

①差速离心：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法；

②密度梯度离心：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种正常分离方法；

③等密度梯度离心：也称沉降平衡离心，是根据颗粒的密度不同而进行分离的。

3、膜分离技术的超滤，微滤和反渗透的区别：

超滤：又称超过滤，是借助于超滤膜将不同大小的物质颗粒或分子分离的技术；

微滤：是以微滤膜（有时也可以用非膜材料）作为过滤介质的膜分离技术（操作压力一般在0.1Mpa以下）；

反渗透：反渗透膜的孔径小于2nm，被截留的物质相对分子质量小于1000，操作压力为0.7~13Mpa。

类别截留的颗粒大小截留的主要物质过滤介质

粗滤大于2μm 酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属

微滤0.2~2μm 细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷

超滤2nm~0.2μm 病毒、生物大分子等超滤膜

反渗透小于2nm 生物小分子、盐离子反渗透膜

4、胶束与反胶束的区别：

①胶束：将表面活性剂溶于水中，并使其浓度超过临界胶束浓度。表面活性剂就会在水溶剂中聚集在一起形成聚集体。

②如果将表面活性剂溶于非极性溶液中，并使浓度超过临界胶束浓度，在有机溶剂内形成聚集体。

类别溶剂极性基团非极性基团可溶性的物质

胶束水在外与水接触在内非极性物质

反胶束非极性溶液在内，形成极性核在外与非极性溶液接触极性物质

5、凝胶过滤的特点：设备简单、操作方便、重复性好，样品回收率高。

第五章酶的固定化

1、固定化酶：被局限在某一特定区域上的，并且保留了它们的催化活力，可以反复，连续使用的酶。

2、固定化细胞：利用物理、化学等因素将细胞约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力。

3、固定化酶的方法：

⑴载体结合法：利用各种吸附结合的手段，将酶固定于一不溶性载体上，以制备固定化酶的方法。

①物理吸附法：优点：利用此法进行固定，酶的活性中心不易被破坏，且酶的高级结构变化少，因而酶活力损失很少；缺点：固定的酶与载体相互作用力弱，酶容易从载体上脱落下来。

②离子结合法：优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸不易被破坏，能得到酶活回收率高的固定化酶；缺点：载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或PH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落；

③共价结合法：优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，一般不会同底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落，这有利于连续使用；缺点：反应条件苛刻，操作复杂，而且由于采用了比较激烈的反应条件，可能会引起酶蛋白高级结构的变化，破坏部分活性中心，因此，往往不能得到比活力高的固定化酶，其酶活回收率一般为30％左右，有时甚至底物的专一性等酶的性质也会因固定化而发生变化。

⑵交联法：利用双功能或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法。优点：操作简便；缺点：交联反应的过程往往比较激烈，许多酶易在固定化过程中失效，酶回收率不高。

⑶包埋法：是指将聚合物的单体和酶溶液混合后，借助聚合促进剂（包括交联剂）的作用使单体进行聚合，从而将酶包埋在聚合物中的固定化方法。

①网格型包埋法：

②微囊型包埋法：

③脂质体包埋法：

4、酶的各种固定化方法的比较：

固定化方法载体结合法交联法包埋法

物理吸附法离子结合法共价结合法

制备难易易易难较难较难

结合程度弱中等强强强

酶活回收率高，但酶易流失高低中等高

对底物专一性不变不变可变可变不变

再生可能可能不可能不可能不可能

固定化费用低低高中等低

5、细胞的固定化方法：

⑴直接固定化法：是指不使用载体，而借助物理、化学方法将细胞直接固定。

⑵包埋法：优点：①操作简便，只需将菌体的生理盐水悬液和溶于相同溶液的角叉菜胶混合，冷却后即成，或在加入某些阳离子溶液后冷却即成；②包埋条

件温和，得到的固定化细胞有较高的活力，而且稳定；③形成的凝胶有一定的机械强度，扩散限制小，还可用丹宁、戊二醛等硬化剂进行处理来增加机械强度。

⑶吸附法：优点：条件温和，方法简便，可再生；缺点：载体和细胞间吸附力弱，操作时细胞易从载体脱落，特别是在底物相对分子质量高，介质的离子强度和PH变化的情况下更是如此，所以操作稳定性较差。

⑷交联和共价偶联法：

6、固定化前后酶的性质的差别：

⑴稳定性：固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好；

①对热的稳定性高，可以耐受较高的温度；

②保存稳定性好，可以在一定的条件下保存较长时间；

③对蛋白酶的抵抗力增强，不易被蛋白酶水解；

④对变性剂的耐受性提高，在尿素，有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力；

⑵最适温度：可能受到固定化方法和固定化载体的影响，经过固定化的酶的最适温度有时降低，有时提高。

7、固定化前后酶的特征的变化：

⑴酶的活性：大多数情况下，固定化酶的活性低于天然酶，但也有不下降和升高的情况；

⑵酶的稳定性升高，表现在以下方面：

①固定化增加了酶的耐热性；

②固定化增大了酶对变性剂、抑制剂的抵抗能力；

③固定化减轻了蛋白酶的破坏作用；

④固定化可以增强贮存稳定性和操作稳定性。

⑶酶的最适温度：由于热稳定性增加，大多数酶的最适温度也随之增加，但也有不变和下降的；

⑷酶的最适PH：固定化后，对底物作用的最适PH和酶活力PH曲线常常会发生偏移；

⑸酶的动力学特征改变；

⑹酶的专一性改变。

第六章酶的反应器

1、酶反应器：以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置。

2、酶反应器的类型：

①搅拌罐型：分批反应器和连续流搅拌罐反应器；②固定床型；③流化床型；

④膜式反应器；⑤鼓泡塔型；⑥连续搅拌罐式超滤型；⑦循环床型；⑧其他酶反应器。喷射式反应器

3、酶反应器的选择：（底物或产物的理化性质）

①酶催化反应产物的相对分子质量较大时，由于产物难于透过超滤膜的膜孔，不能达到反应与分离同时进行的目的，所以一般不用膜反应器；

②酶催化反应的底物或产物的溶解度较低，黏度较高时，应当选择搅拌罐式反应器或者流化床式反应器，而不用填充床和膜反应器，以免造成阻塞现象；

③底物为气体时，通常选择鼓泡式反应器，可以同时达到提供底物和混合物均匀的目的；

④有些需要小分子物质作为辅酶（辅酶可以看作底物）的酶促反应，通常不采用膜反应器，以免辅酶流失而影响催化反应的进行。

第八章酶的化学修饰

1、酶分子的化学修饰方法：①酶分子的主链修饰；②酶分子的侧链基团修饰；

③酶的组成单位置换修饰；④金属离子置换修饰。

2、金属离子置换修饰的过程和意义：

过程：①分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。②除去原有的金属离子：加入金属螯合剂（EDTA等）与酶分子中的金属离子形成螯合物，通过透析，超滤，分子筛层析等方法，将螯合物除去，此时的酶是无活性状态。

③加入置换离子：在去离子的酶液中加入另一种金属离子，与酶蛋白结合，除去多余的置换离子，完成了修饰过程。

意义：①提高酶活力；②增强酶的稳定性；③改变酶的动力学特征。

第十章酶的非水相催化

1、必需水：在绝对无水条件下，酶分子表面含有大量带电基团和极性基团相互作用而形成“锁定”的失活构象，当加入适量水分子充当润滑剂会使酶的柔性增大，维持酶的活性构象，同此时酶的结构和催化活性至关重要的结合水。

2、结合水：生物反应体系中的水分成溶剂水和结合水两种，占98％的绝大多数的水是溶剂水，紧密地结合在酶分子的表面的少部分水就是结合水。

3、水活度（αw）：是指在一定温度和压力下，反应体系中水的摩尔分数Xw与水活度系数γw的乘积：αw=γw×Xw

水活度系数γ是溶剂活度系数，溶剂疏水性越大，γw越大，说明γw不依赖于组成。溶剂的极性越大，溶剂活度系数γw可以用溶剂-水混合物气液平衡进行计算。在低压（＜5bar时）条件下，水活度αw是气相中水的分压与同温度下纯水的蒸气压的比值：αw=（Ym×P）／Po，式中，Ym是气相中水的摩尔分数，P为总气压，Po为同温度下水的饱和蒸气压。

4、在催化反应中有机溶剂对酶的影响：

①溶剂的极性：有机溶剂剥夺酶分子周围必需水的能力，取决于溶剂的极性核水含量；

②有机溶剂对酶结构，活性中心的影响；

③有机溶剂对酶活性和选择性的调节。

5、非水相生物酶促反应的特点：

①从反应的热力学平衡来看，可以将加水分解反应转为其逆反应，如酶的合成，肽的合成或酶交换反应；

②酶的热稳定性比水中要高，这时酶促催化反应的应用十分重要；

③在非水系统内酶不溶于有机相，很容易回收和反复利用；

④改变酶对底物的专一性，同一种酶在不同的有机溶剂可以表现出不同的立体选择性；

⑤在非水相系统内绝大多数有机化合物溶解度很高，尤其是能提高非极性底物的溶解度；

⑥从低沸点的溶剂中可以容易地分离纯化产物；

⑦能抑制依赖于水的某些不利反应（如酸酐和卤化物的水解，醌的聚合等）和副产物；

⑧没有微生物的污染；

⑨固定化酶方法简单，在非水系统中酶不易脱离吸附的表面。

第十一章酶的模拟

1、模拟酶：又称人工酶或酶模型，一般说来，它的研究就是根据酶分子中那些起主导作用的因素，利用有机化学，生物化学等方法设计和合成一些较天然酶简单的非蛋白质分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。也就是说，模拟酶的研究就是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机制和立体化学等特征的一门科学。

2、抗体酶：具有催化能力的免疫球蛋白。具有酶的催化活性等基本特征的抗体，称抗体酶。

3、极端酶：指那些在非常规条件下作用的酶。

4、核酶：一类具有催化活性的RNA分子。