链格孢属真菌分类研究进展
植物病原真菌毒素的分类、致病机制及应用前景
植物病原真菌毒素的分类、致病机制及应用前景摘要：研究植物病原真菌毒素及其致病机制，对于了解植物与病原互作具有重要意义。
从植物病原真菌毒素的分类、致病机制、分离纯化、应用前景等方面综述植物病原真菌毒素研究的最新进展，对今后植物病原真菌毒素的研究具有重要的参考价值。
关键词：植物病原菌;真菌毒素;分类;致病机制;分离纯化;应用前景;研究思路中图分类号：S182 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2019）03-0094-04病菌毒素是在植物病原菌代谢过程中产生的对植物有害的非酶类化合物，它能在很低的浓度范围内破坏植物的正常生理功能[1]。
自从菊池链格孢菌毒素被首次报道以来[2]，尤其在维多利亚毒素被报道以后，国内外植病学者开始对许多病原菌产生的毒素展开研究。
植物病原真菌毒素的作用机制复杂，它主要是作用于寄主植物的细胞质膜、线粒体和叶绿体等细胞结构，从而破坏和干扰寄主植物的代谢;此外，它还会抑制寄主植物蛋白质和核酸的合成，从而导致寄主植物生理失调、细胞死亡以至整个植株死亡。
研究病原真菌毒素及其致病机制，对于了解寄主与病原互作，以及利用病菌毒素进行植物抗病性鉴定、抗病突变体筛选和病害防治等都具有重要意义。
本文从植物病原真菌毒素的分类、致病机制、分离纯化及应用前景等方面进行综述，以期为今后病原真菌毒素致病机制的研究提供思路。
1 植物病原真菌毒素的分类真菌毒素可根据对寄主植物的特异性作用分为寄主专化性毒素（host-selective toxin，简称HST）和非寄主专化性毒素（non- host-selective toxin，简称NHST）。
1.1 寄主专化性毒素HST是由病原微生物产生的代谢产物，它对寄主植物具有特异性生理活性和高度专化性作用。
HST对寄主选择性强，例如草莓黑斑病病菌所产生的AF-毒素只对Morioka-16草莓和Nijisseiki梨具有致病作用;此外，北美燕麦疫病病菌产生的HV-毒素和玉米小斑病病菌产生的HMT-毒素也都属于寄主专化性毒素，它们不仅对寄主植物的致病性强，而且对寄主有专一性。
链格孢属真菌（Alternaria）属有丝分裂孢子真菌类群丝孢纲丝b...b-YNSTC
链格孢属真菌(Alternaria)属有丝分裂孢子真菌类群丝孢纲丝孢目，是半知菌暗色丝孢菌中一类非常常见的真菌。
链格孢属真菌是引起植物病害的重要真菌类群之一。
大部分链格孢属真菌寄生于不同种植物，特别是农作物，常引起包括玉米、小麦、马铃薯、苹果和番茄等几十种农作物的病害，而给农业造成重大经济损失。
有些链格孢属真菌是人和动物的条件致病菌，常引起多种疾病。
链格孢属真菌产生许多有毒代谢产物，包括腾毒素(tentoxin) ，链格孢毒素(altertoxins)，细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)，交链孢霉烯(altenuene)和交链孢酚(alternariol)等，其中有些毒素是其作用于植物的主要致病因子，通过毒素的作用不仅使植物产生症状，造成危害，而且人和动物摄入被污染的食品或饲料后可导致慢性或急性中毒。
有些毒素可用作除草剂和杀菌剂等，是有应用潜力的生物资源(Barkai-Golan, 2008)。
腾毒素是由一些链格孢属真菌产生的一个天然环四肽。
这个属的链格孢(A. alternata)，柑桔链格孢(A. citri) ，长柄链格孢(A. longipes) ，苹果链格孢(A. mali) ，葱链格孢(A. porri)和细链格孢(A. tenuis)的一些菌株已被报道产生腾毒素(Meyer, 1971; Liebermann, 1983; Kono, 1986; Suemitsu, 1990)。
从腐烂的西红柿和浓缩苹果汁中都检测到被链格孢属真菌污染而产生的腾毒素(Andersen, 2004; 何强，2010)。
腾毒素的化学结构是[cyclo-(L-MeAla-L-Leu-MePhe*(Z)∆+-Gly)] (Meyer, 1971)。
腾毒素的主要生物活性是选择性抑制一些高等植物叶绿体F1-ATP酶活性而导致植物萎黄病(Steele, 1976)。
其抑制机理是低浓度下抑制叶绿体F1-ATP酶中ATP水解和合成(Steele, 1976)，因此常用于研究F1-ATP酶的反应机制(Pavlova, 2004; Meiss, 2008)。
产苦马豆素的疯草内生真菌研究进展
第32卷 第2期V o l .32 No .2草 地 学 报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2024年 2月F e b . 2024d o i :10.11733/j.i s s n .1007-0435.2024.02.002引用格式:李 丹,卢 萍,袁 博,等.产苦马豆素的疯草内生真菌研究进展[J ].草地学报,2024,32(2):358-368L ID a n ,L U P i n g ,Y U A NB o ,e t a l .R e s e a r c hP r o g r e s so fE n d o p f y t eF u n g i f r o m L o c o w e e dP r o d u c i n g SW [J ].A c t a A gr e s t i aS i n i c a ,2024,32(2):358-368产苦马豆素的疯草内生真菌研究进展李 丹1,2,卢 萍1,2*,袁 博1,2,杜 玲1,2,李玉玲1,2,高 峰1,2,姜 凯1,2(1.内蒙古师范大学生命科学与技术学院,内蒙古呼和浩特010020;2.内蒙古自治区高等学校蒙古高原生物多样性保护与可持续利用重点实验室,内蒙古呼和浩特010020)摘要:含苦马豆素(S w a i n s o n i n e ,S W )的棘豆属(O x y t r o p i s D C .)和黄芪属(A s t r a g a l u s L .)植物称为疯草,其共生着一种疯草内生真菌(A l t e r n a r i a S e c t i o n U n d i f i l u mo x y t r o p i s )㊂疯草中的S W 由其内生真菌产生,而非由宿主植物产生㊂S W 是一种吲哚里西啶类生物碱,牲畜食用疯草后引起中毒,严重者死亡,对我国畜牧业危害巨大㊂本文对棘豆属疯草的分类与分布,疯草内生真菌的分类㊁分布㊁传播方式及形态学差异,不同真菌中S W 的合成相关酶及合成途径的研究进展进行综述,讨论了S W 合成途径及其关键酶的作用,旨在为疯草内生真菌的研究㊁利用及S W 合成途径的明晰提供参考㊂关键词:疯草内生真菌;苦马豆素;次级代谢产物;棘豆属植物;疯草中图分类号:S 812.8 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2024)02-0358-11R e s e a r c hP r o g r e s s o fE n d o p f y t eF u n g i f r o mL o c o w e e dP r o d u c i n g SW L ID a n 1,2,L U P i n g 1,2*,Y U A NB o 1,2,D U L i n g 1,2,L IY u -l i n g 1,2,G A OF e n g 1,2,J I A N G K a i 1,2(1.I n n e rM o n g o l i aN o r m a lU n i v e r s i t y ,C o l l e g e o fL i f eS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,H o h h o t ,I n n e rM o n go l i a 010020,C h i n a ;2.K e y L a b o r a t o r y o f B i o d i v e r s i t y c o n s e r v a t i o na n dS u s t a i n a b l e u t i l i z a t i o n i n M o n g o l i a nP l a t e a u f o rC o l l e g e a n dU n i v e r s i t yo f I n n e rM o n g o l i aA u t o n o m o u sR e g i o n ,H o h h o t ,I n n e rM o n go l i a 010020,C h i n a )A b s t r a c t :O x y t r o p i s D C .a n d A s t r a ga l u s L .p l a n t s ,a l s ok n o w n a s l o c o w e e d ,c o n t a i n s w a i n s o n i n e (S W ),a n i n d o l i z i d i n e a l k a l o i d .T h e S Wi s p r o d u c e db y a n e n d o p h y t ic f u n g i ,A l t e r n a r i a S e c t i o n U nd i f l u mo x y t r o pi s ,t h a t c o e x i s tw i t h t h e l o c o w e e d ,r a t h e r t h a nb y t h e h o s t p l a n t i t s e l f .C o n s u m i n g of l o c o w e e d c a n c a u s e p o i -s o n i ng i n l i v e s t o c k ,l e a d i n g t o d e a th ,p o s ei n g a s i g n i f i c a n t t h r e a t t oC h i n a 's a n i m a l h u s b a n d r y.T h i s a r t i c l e r e v i e w s t h e r e s e a r c h p r o g r e s s o n t h e c l a s s i f i c a t i o n a n dd i s t r i b u t i o no f t h e l o c o w e e d o f O x y t r o pi s g e n u s ,t h e c l a s s i f i c a t i o na n dd i s t r i b u t i o n ,a n d t r a n s m i s s i o no f e n d o p h y t i c f u n g i i n l o c o w e e d ,t h e r e l a t e ds yn t h e s i se n -z y m e s ,a n d t h es y n t h e s i s p a t h w a y so fS Wi nd i f f e r e n t f u n g i .B a s e do ne x i s t i n g e x pe r i m e n t a l r e s u l t s ,t h e s y n t h e s i s p a t h w a y s of S Wa n d t h e r o l e so f i t sk e y e n z y m e s a r e s u m m a r i z e da n dd i s c u s s e d .T h ea i mi s t o p r o v i d e a r e f e r e n c e f o r t h e r e s e a r c ha n du t i l i z a t i o no f l o c o w e e d e n d o p h y t i c f u ng i a n d t o c l a r i f y o f s y n th e si s p a t h w a ys o f S W.K e y w o r d s :E n d o p h y t i c f u n g i o f l o c o w e e d ;S w a i n s o n i n e ;S e c o n d a r y m e t a b o l i t e s ;O x y t r o p i s s p p ;L o c o w e e d 收稿日期:2023-10-23;修回日期:2023-11-28基金项目:国家自然科学基金项目(31460235㊁31960130);内蒙古自然科学基金项目(2022M S 03014);内蒙古师范大学基本科研业务费专项资金资助(2022J B T D 010)资助作者简介:李丹(1997-),女,汉族,内蒙古呼和浩特人,硕士研究生,主要从事内生真菌中次生代谢途径研究,E -m a i l :176********@163.c o m ;*通信作者A u t h o r f o r c o r r e s p o nde n c e ,E -m a i l :l u p i n g@i m n u .e d u .c n 疯草主要指含苦马豆素(S w a i n s o n i n e ,S W )的棘豆属(O x y t r o p i s D C .)和黄芪属(A s t r a g a l u s L .)有毒植物,在世界范围内对于草原畜牧业危害巨大[1-3]㊂S W 是一种吲哚里西啶类生物碱[4],化学名为吲哚里西啶三醇或(1S ,2S ,8R ,8a R )-三羟基八氢吲哚里西啶,最初由C o l e ga t e 等[5]在澳大利亚分布的灰苦马豆(S w a i n s o n a c a n e s c e n s )植物体分离得到,中国由曹光荣等[6]首次从黄花棘豆(O x yt r o -第2期李丹等:产苦马豆素的疯草内生真菌研究进展p i s.o c h r o c e p h a l a)中分离出,S W的化学结构与甘露糖相似,可与动物细胞中的溶酶体α-甘露糖苷酶I和高尔基体甘露糖苷酶I I的底物竞争性结合,从而抑制酶的活性㊁阻碍糖蛋白的合成与加工,并导致细胞空泡变性㊂牲畜持续食用一段时间的疯草会中毒,产生一系列症状,如肌肉震颤㊁呕吐㊁母畜流产㊁公畜不育及死亡[7]㊂后来发现S W具有抑制肿瘤生长和转移作用[8],是一种有前景的抗肿瘤药物㊂S W具有双杂环分子结构,有四个手性构型,化学合成过程中易形成手性异构体,难以分离,故化学合成的S W商品价格昂贵[8],从生物体中提取S W值得探索㊂疯草内生真菌与豆科棘豆属㊁黄芪属植物共生[9],属于链格孢属(A l t e n a r i a),最初被划在该属,后根据其I T S序列归在埃里格孢属(E m b e l l i s i a),又有学者提出将其归在U n d i f i l u m,后经分析比对其G A P D H,R P B2和T E F1等多个基因序列,将其归在波浪状芽管孢组(U n d i f i l u m)A l t e n a r i a属[10-11]㊂本文对棘豆属疯草的分类与分布㊁疯草内生真菌形态学㊁分类㊁分布㊁传播方式及不同真菌中S W 合成途径的进展进行综述,对于明晰疯草内生真菌S W合成分子机制和代谢途径,以及未来指导疯草中S W的控制和利用都有重要意义㊂1棘豆属疯草的分类与分布疯草包括含S W的豆科(L e g u m i n o s a e)㊁旋花科(C o n v o l v u l a c e a e)㊁锦葵科(M a l v a c e a e)等植物,以豆科的棘豆属㊁黄芪属植物为主㊂国外多分布于美国㊁澳大利亚㊁加拿大等地,在美国西部其危害最为严重[12];分布在中国的疯草多为棘豆属植物,全世界共有300余种棘豆属植物[13],美国主要有5种棘豆属的疯草(表1),中国的棘豆属植物有80余种,多分布于西北㊁华北㊁东北㊁西南等地,已报道的中国棘豆属疯草植物为23种[14],对草原危害最为严重的有小花棘豆(O x y t r o p i s.g l a b r a)㊁黄花棘豆(O. o c h r o c e p h a l a)㊁甘肃棘豆(O x y t r o p i s.k a n s u e n s i s)㊁冰川棘豆(O x y t r o p i s.g l a c i a l i s)㊁毛瓣棘豆(O x y t-r o p i s.s e r i c o p e t a t a),主要分布在内蒙古㊁宁夏㊁甘肃㊁陕西㊁青海㊁新疆㊁西藏㊁四川等省区的干旱和半干旱地区,具有抗旱耐寒㊁生命力强和繁殖率高等特点㊂对比其他杂草或毒草,疯草的分布与丰度占优势,认为疯草与内生真菌共生,从而有助于提高其抗逆性[15];昆虫病原真菌罗伯茨绿僵菌(M e t a r h i z i u m r o b e r t s i i)也产生S W,为宿主植物提供哌啶酸(P e p-o c o l i c a c i d,P A),可提升宿主植物对环境的适应能力以及抗胁迫能力[16-20]㊂表1美国棘豆属疯草的分布[21]T a b l e1 T h e d i s t r i b u t i o no fL o c o w e e do f O x y t r o p i s i nA m e r i c a n[21]序号S e r i a l n u m b e r种名S p e c i e s n a m e拉丁名L a t i nn a m e分布D i s t r i b u t i o n 1绢毛棘豆O x y t r o p i s.s e r i c e a U t a h,A r i z o n a,N e w M e x i c o,O k l a h o m a,K a n s a s 2蓝伯氏棘豆O x y t r o p i s l a m b e r t i i M o n t a n a,W y o m i n g,I d a h o,N o r t hD a k o t a,T e x a s,A l a s k a 3油菜棘豆O x y t r o p i s c a m p e s t r i s v a r.d i s p a r M o n t a n a,A l a s k a4鲑色贝氏棘豆O x y t r o p i s b e s s e y i v a r.s a l m o n e n s i s M o n t a n a,W y o m i n g5贝氏棘豆(模式变种)O x y t r o p i s b e s s e y i v a r.b e s s e y M o n t a n a,W y o m i n g2疯草内生真菌的分类㊁分布㊁传播方式及形态学差异2.1疯草内生真菌的分类B r a u n等[9]最早在绢毛棘豆(O.s e r i c e a)㊁蓝伯氏棘豆(O.l a m b e r t i i)及密柔毛黄芪(A s t r a g a l u s. m o l l i s i m u s)等疯草中分离到产S W的A l t e r n a r i a 内生真菌,后又有学者在绢毛棘豆(O.s e r i c e a)[22-25]和蓝伯氏棘豆(O.l a m b e r t i i)[26-27]中分离到,中国学者也从毛瓣棘豆(O.s e r i c o p e t a t a)[28]㊁冰川棘豆(O.g l a c i a l i s)[28]㊁甘肃棘豆(O.k a n s u e n s i s)[29]㊁小花棘豆(O.g l a b r a)[30]㊁黄花棘豆(O.o c h r o c e p h a-l a)[31-32]中分离到㊂疯草内生真菌目前定义了4个种,分别是A l t e r n a r i a.o x y t r o p i s[33],A l t e r n a r i a.c i n e r e u m[34]和A l t e r n a r i a.f u l v u m[34],以及作为模式种的A l t e r n a r i a.b o r n m u e l l e r i i[11]㊂根据形态学㊁生理学及遗传学证据,2014年将A.f u l v u m改名为A l t e r n a r i a.f u l v a[35-36]㊂在中国境内从甘肃棘豆(O.k a n s u e n s i s)和小花棘豆(O.g l a b r a)中分离出疯草内生真菌A.o x y t r o p i s,在国外从绢毛棘豆(O.s e r i c e a)和蓝伯氏棘豆(O.l a m b e r t i i)中也分离到该内生真菌,目前在中国境内分离到的疯草内生真菌都属于A.o x y t r o p i s;在美国从密柔毛黄芪(A. m o l l i s i m u s)中分离出A.c i n e r e u m;从斑荚黄芪(A s t r a g a l u s.l e n t i g i n o s u s)中分离出A.f u l v u m;在澳大利亚的小冠花(S e c u r i g e r av a r i a)中分离出A.b o r n m u e l l e r i i㊂管慧锐等[21]对24株疯草内生真菌的I T S序列953草地学报第32卷进行比较分析,5种从中国境内分布的棘豆属植物(甘肃棘豆㊁黄花棘豆㊁镰形棘豆㊁毛瓣棘豆及小花棘豆)中分离的疯草内生真菌聚到一支,相邻的疯草内生真菌并不一定源于同种宿主植物,可能与其遗传距离与地理分布也有密切关系[37],从相近地理位置分布的棘豆宿主植物分离到的疯草内生真菌相似程度更高,而地理位置较远㊁但从同种棘豆宿主植物分离的疯草内生真菌的相似程度较前种小,更近的地理距离可能遗传距离更近㊂2.2疯草内生真菌的分布在棘豆属宿主植物生长过程中,其不同部位(如茎㊁叶㊁花等)都能分离出疯草内生真菌[32]㊂B r a u n 在美国3种疯草种群中分离到A l t e r n a r i a属内生真菌,花中的感染率为100%,种子中的感染率为93.1%,叶和茎的感染率为72.9%和97.2%[9]㊂内生真菌在种子中定殖于种皮内部的薄壁组织[38],故内生真菌只通过母体传递,而不在物种间传递㊂植株中菌丝体在细胞间隙间有发现,并且在分生组织中的菌丝体要比成熟组织中更丰富[39-40],可能是由于分生组织利用碳源的效率高[41]㊂同时,地上组织中的内生真菌水平要比地下组织中的高[42]㊂疯草内生真菌能直接吸收来自植物中氨基酸形式的营养供应,光合作用强的部分,其叶绿体产生的可被疯草内生真菌吸收利用的赖氨酸(L y s i n e, L y s)水平更高,更适于内生真菌的存活[43]㊂2.3疯草内生真菌的传播方式R o d r i g u e z等[44]根据内生真菌的传播方式将内生真菌分为四类:第一类是棒状子实体内生真菌(C l a v i-c i p i t a c e o u s e n d o p h y t e s),传播方式为垂直传播,且产生真菌毒素;第二㊁三和第四类均属于非棒状子实体内生真菌(N o n c l a v i c i p i t a c e o u se n d o p h y t e s)㊂第二类寄主范围较广,一般定植于根㊁茎和叶,能够在植物内形成广泛的感染,通常情况下通过种皮或根茎进行垂直传播,少数情况也可水平传播;第三类内生真菌仅出现在地上组织中,通过菌丝碎裂和/或在死亡或衰老组织上产生有性或无性孢子进行繁殖,孢子和菌丝碎片可以由食草动物或昆虫的携带进行传播,或通过风㊁雨的作用进行扩散与繁殖㊂第四类主要是子囊菌,在实验室条件下,菌丝碎裂和分生孢子是传播的主要途径,不仅能侵染植株地上部分,还能侵染根部[45]㊂疯草内生真菌通过种子携带内生真菌进行垂直传播[9,45-46],属于第一类㊂2.4疯草内生真菌A.o x y t r o p i s的形态学特点目前,疯草内生真菌定义到的4个种,A.c i n e r e-u m和A.f u l v u m从黄芪属疯草中分离出,A.o x y t-r o p i s从棘豆属分离出,A.b o r n m u e l l e r i i从S e c u r i g e r a v a r i a中分离出㊂从棘豆属和黄芪属分离出的疯草内生真菌形态略有不同,但从棘豆属和S e c u r i g e r a v a r i a 中分离的疯草内生真菌形态相似[11]㊂中国境内棘豆属疯草分离到的产S W疯草内生真菌均为A.o x y t r o p i s,但不同棘豆属植物中分离到的疯草内生真菌菌落形态大体相同㊂从几种棘豆属疯草中分离到疯草内生真菌[31,47-48]生长前期都呈圆形㊁隆起㊁边缘整齐的白色菌落,整体分布白色气生菌丝;生长中期菌体分泌黑褐色的色素物质,菌落背面呈黑色,颜色由白色渐变为浅灰,后灰色逐渐加深变成灰黑色;后期色素由黑色逐渐变为黑绿色㊂在整个生长过程中,菌落均呈辐射状生长,表面绒状较松散,菌体内部坚硬㊂其中,从甘肃棘豆中分离到的菌落与此有所差别,菌落逐渐由白色变为淡黄色㊁黄褐色,再变为黑褐色㊁黑色,其他形态并无显著差别㊂而A.b o r n m u e l l e r i i不仅在菌落形态与A. o x y t r o p i s相似,在以其I T S1㊁5.8S和I T S2序列构建的邻接串联进化树与A.o x y t r o p i s聚到了一支,且自展值为98%,形成了一个强支持的单系群,故A.b o r n m u e l l e r i i与A.o x y t r o p i s从基因型到表型都极为相似,可能为同种疯草内生真菌㊂从黄芪属疯草中分离到的菌株含有更多的气生菌丝体,随着菌落生长,少部分形成硬化的菌丝体,从密柔毛黄芪中分离到的A.c i n e r e u m通常是灰色到深灰色的,而从斑荚黄芪中分离到的A.f u l v u m 则是棕褐色到棕色㊂而在基于I T S和g p d基因序列构建的邻接串联进化树中,A.c i n e r e u m和A.f u l v u m聚到了一支,自展值为99%㊂分生孢子是菌种鉴定的重要依据㊂该类型疯草内生真菌的分生孢子大小一般为(14~70)ˑ(5~15)μm,个别物种可达(80~90)ˑ(5~15)μm,颜色为黄绿色至深棕色,形状为广椭圆形至长椭圆形,两端较尖细,表面较平滑,无显著突起,孢子壁较厚,两层,外壁较粗糙,有横隔与纵隔,大多数为3~7个横隔,0~ 3个纵隔,呈串珠状或分岔排列[9-11,49]㊂3真菌中S W合成相关酶及合成途径3.1酵母氨酸还原酶酵母氨酸还原酶(S a c c h r o p i n er e d u c t a s e,S a c)063第2期李丹等:产苦马豆素的疯草内生真菌研究进展(E C1.5.1.10)[50],也称酵母氨酸脱氢酶(S a c c h r o-p i n e d e h y d r o g e n a s e,S D H),可催化α-氨基己二酸半醛生成酵母氨酸(L-s a c c h a r o p i n e),反应过程为:谷氨酸+α-氨基己二酸半醛+N A D P H+H+⇌酵母氨酸+N A D P++H2O,反应中酵母氨酸还原酶为双向酶,催化正向反应和逆向反应所需p H不同[50],正向反应最适p H为7.0,逆向反应为9.75㊂在豆类丝核菌(R h i z o c t o n i a l e g u m i n i c o l a)㊁金龟子绿僵菌(M e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e)及A.o x y t r o p i s中都存在S a c酶,在R.l e g u m i n i c o l a里L y s合成哌啶-6-羧酸(d e l t a-1-p i p e r i d e i n e-6-c a r b o x y l a t e,P6C)时,由L y sң酵母氨酸ңα-氨基己二酸半醛的两步反应都由S a c酶催化[51],;在M.a n i s o p l i a e中,酵母氨酸氧化酶(s a c-c h a r o p i n e o x i d a s e,F A P2)可催化L y s合成酵母氨酸,后再由S a c酶催化合成P6C;在A.o x y t r o p i s中这两步是可逆反应,正向反应与R.l e g u m i n i c o l a相同,见图1㊂图1四种真菌中由L y s合成P A的过程F i g.1 T h e s y n t h e t i c p r o c e s s o fL y s t oP Ai n f o u r f u n g i注:A,豆类丝核菌;B,金龟子绿僵菌;C,罗伯茨绿僵菌;D,疯草内生真菌N o t e,A,R.L e g u m i n i c o l a;B,M.a n i s o p l i a e;C,M.r o b e r t s i i;D,A.o x y t r o p i sM u k h e r j e e等敲除A.s e c t.U n d i f i l u mo x y t-r o p i s中的s a c基因,敲除突变株中S W水平㊁P A水平及P6C水平均上升,而L y s水平和酵母氨酸水平下降,a-氨基己二酸水平未发生变化[52];卢萍等敲除A.o x y t r o p i s OW7.8的s a c基因,敲除突变株Δs a c中S W水平㊁酵母氨酸水平均下降,从培养第14天到第45天,Δs a c的S W水平始终低于OW7.8而L y s水平变化不大[53];此外在OW7.8和Δs a c的培养液中添加四种前体(酵母氨酸㊁α-氨基己二酸㊁L y s和P A)后,OW7.8和Δs a c的S W水平都上升,且OW7.8的S W水平始终高于Δs a c[54]㊂推测L y s是必需氨基酸,而酵母氨酸是合成L y s过程中的中间产物,在Δs a c中其合成受阻,为合成必需的L y s,可能发生由F A P2催化P6C合成酵母氨酸,进而合成L y s,故Δs a c中S W水平降低,L y s水平不变,说明S a c酶促进酵母氨酸和S W的合成[53]㊂该课题163草地学报第32卷组又对Δs a c和OW7.8进行无参转录组测序分析,筛选出41个与S W合成相关的差异表达基因,其中有5个注释到S a c酶,它们在Δs a c中表达均下调,也说明S a c酶促进S W的合成[55]㊂3.2吡咯啉-5-羧酸还原酶吡咯啉-5-羧酸还原酶(P y r r o l i n e-5-c a r b o x y l a t e r e d u c t a s e,P5C R)是脯氨酸(P r o l i n e,P r o)生物合成通路上的一个关键酶[56],在植物和微生物中主要催化吡咯啉-5-羧酸(P y r r o l i n e-5-c a r b o x y l a t e,P5C)合成P r o,也将N A D(P)H氧化为N A D(P)+㊂在A. o x y t r o p i s中P5C R酶催化P6C合成S W的重要前体物P A[57-58]㊂在A.o x y t r o p i s OW7.8中克隆P5C R基因,向培养基中添加P A的实验结果显示,添加组P5C R基因表达水平在23~26d下降,在29~32d 上升并高于对照组,推测可能由于添加组前期有冗余P A,发生负反馈抑制,经一段时间后冗余的P A 被消耗,负反馈抑制解除,S W水平下降,P5C R基因表达水平提高,而对照组中随S W合成,发生负反馈抑制时,P5C R基因表达水平降低,进而S W水平也下降㊂提出P5C R基因表达促进A.o x y t r o p i s OW7.8中S W的合成[59]㊂植物在干旱㊁高盐和低温等条件下启动脱落酸(A b s c i s i c a c i d,A B A)合成,可增强其抵抗逆境的能力,A B A水平与P r o水平正相关[60],故P5C R酶发挥作用可能与A B A调控也有关,对黄花棘豆中分离的疯草内生真菌(A.o x y t r o p i s)及其宿主黄花棘豆进行全基因组测序,发现真菌基因组中有2个编码P5C R酶的基因,推测其中一个P5C R基因是S WN基因簇中的一员,其功能可能与S w n R酶相似,但在其他产S W真菌中并无此推论[61]㊂3.3S W N基因簇成员的编码产物C o o k等[62]提出产S W真菌有一个共同的S WN基因簇,该基因簇共包括7个成员:s w n A, s w n N,s w n T,s w n H1,s w n H2,s w n K,s w n R,在M. r o b e r t s i i中负责催化由L y s到S W的生物化学反应,在其他产S W真菌中负责催化由P A到S W的生物化学反应,见表2㊂表2S W N基因簇成员及其功能[62-63]T a b l e2 m e m b e r s o f S WN g e n e c l u s t e r a n d t h e i r f u n c t i o n s基因名称G e n e n a m e编码酶E n c o d e d e n z y m e功能F u n c t i o n可能的反应P o s s i b l e r e a c t i o n s w n A氨基转移酶脱氨基作用催化L y s脱氨基合成P6Cs w n N脱氢酶或还原酶还原作用催化1-酮基吲哚里西啶合成1-羟基吲哚里西啶s w n T氨基酸转运体转运作用介导S W转运至细胞外s w n H1F eⅡ/α-酮戊二酸依赖氧化酶氧化反应1,2-二羟基吲哚里西啶转变为S Ws w n H2F eⅡ/α-酮戊二酸依赖氧化酶氧化反应1-羟基吲哚里西啶氧化生成1,2-二羟基吲哚里西啶s w n K非核糖肽-聚酮合酶(多功能)多重功能以P A为底物催化生成1-酮基吲哚里西啶(表4) s w n R R o s s m a n n-f o l d家族还原酶还原作用催化P6C合成P A产S W的不同类型真菌中的S WN基因簇成员的数量不同,M.r o b e r t s i i㊁树牵牛内生真菌(I C E)㊁太田结皮菌(A r t h r o d e r m a o t a e)和马毛癣菌(T r i c h o p h y t o n e q u i n u m)中含有S WN基因簇全部7个成员,疯草内生真菌(A.o x y t r o p i s)和假裸囊菌属内生真菌(P s e u d o g y m n o a s c u s s p.)中有5个成员,即s w n N,s w n H1,s w n H2,s w n K,s w n R基因,但无s w n A和s w n T基因㊂s w n K和s w n H2基因存在于在各种产S W真菌中[64]㊂s w n K基因编码一个多功能非核糖肽-聚酮合酶,有7个结构域,催化由P A到1-酮基吲哚里西啶的多步反应,见表3㊂表3S w n K各个结构域㊁功能及催化反应[62]T a b l e3 S w n Kd o m a i n s,f u n c t i o n s,a n d c a t a l y t i c r e a c t i o n s结构域S t r u c t u r a l d o m a i n功能F u n c t i o n催化反应C a t a l y t i c r e a c t i o n A腺苷酰(化)作用腺苷酰化P A,便于T结构域的锚定T磷酸泛醇作用磷酸泛醇结合锚定P AK Sβ-酮酰基合成酶催化T结合的哌啶酰基与乙酰基反应形成酮酰基A T脂肪酰转移酶催化丙二酰C o A与A C P结构域结合K Rβ-酮酰基还原酶将哌啶酰-乙酰-A C P化合物中哌啶酰中的酮基还原成羟基A C P酰基载体蛋白连接丙二酰-C o A,与经T结构域硫醇化后的P A缩合R还原酶催化醛基与氨基环化并脱水形成亚胺离子263第2期李丹等:产苦马豆素的疯草内生真菌研究进展孙璐等[65]敲除了M.a n i s o p l i a e中的s w n R基因,敲除突变株中的S W水平显著下降㊂C o o k 等[62]敲除M.r o b e r t s i i的s w n K的T结构域基因序列,并含部分K S结构域,敲除突变株Δs w n K未测到S W,在基因功能互补株又检测到S W;罗飞飞等[63]敲除M.r o b e r t s i i的S WN基因簇7个基因,在Δs w n K㊁Δs w n H1㊁Δs w n H2中均未测到S W,其他4个基因敲除突变株Δs w n A,Δs w n N㊁Δs w n R㊁Δs w n T的S W水平比野生型菌株下降,下降的水平依次是Δs w n A>Δs w n N>Δs w n R>Δs w n T㊂黄恩霞等[66]敲除了M.a n i s o p l i a e中的s w n K基因,敲除突变株中没有检测到S W㊂王维夫[67]敲除A. o x y t r o p i s OW7.8的s w n K基因A C P结构域,其敲除突变株Δs w n K-A C P中未测出S W,与M. r o b e r t s i i中敲除s w n K基因对S W合成的影响一致[63]㊂3.4真菌中S W合成途径对真菌S W合成途径的研究始于豆类丝核菌(R.L e g u m i n i c o l a)[51],发现合成了一种吲哚里西啶类生物碱 根霉菌胺(S l a f r a m i n e),有另一条支路能合成S W,之后又在M.a n i s o p l i a e㊁M.r o b-e r t s i i和A.o x y t r o p i s中研究合成S W的通路㊂若人为将从L y s到S W的合成途径分为3个过程[21],可表示如下:①由L y s到P A;②由P A到1-羟基吲哚里西啶;③由1-羟基吲哚里西啶到S W㊂目前在M.a n i s o p l i a e中推测由L y s到P A的合成过程与在R.L e g u m i n i c o l a中的稍有不同[51,68](图1-A㊁1-B)㊂在M.a n i s o p l i a e中是由L y s酵母氨酸氧化酶ң酵母氨酸酵母氨酸还原酶ңP6CңP A,或由α-氨基己二酸ңα-氨基己二酸半醛ңP6CңP A;而在M.r o b e r t s i i中由L y s到P A的过程与上述两种真菌不同(图1-C),是由L y s L y s环化脱氢酶ңP A或由L y s S w n A酶ңP6C S w n R酶ңP A;而在A.o x y t r o p i s中,由L y s到P A的过程较复杂(图1-D),有两个分支,一是由L y s⇆酵母氨酸⇆α-氨基己二酸半醛ңP6C⇆P A,二是由L y s L-L y s-α-氧化酶ң6-氨基-2-氧己酸酯ңP2CңP A㊂在R.L e g u m i n i c o l a中,由P A合成1-羟基吲哚里西啶的过程可能是P A还原环化ң1-酮基吲哚里西啶1-酮基吲哚里西啶还原酶ң1-羟基吲哚里西啶;在M.r o b e r t s i i中由P A合成1-羟基吲哚里西啶的过程与A.o x y t r o p i s中的极为相似,但与R. L e g u m i n i c o l a不同(图2);而在M.a n i s o p l i a e中目前无功能实验证据验证,但鉴于其与M.r o b-e r t s i i同属绿僵菌真菌,宿主是2种金龟子物种,且含S WN基因簇,推测各基因编码的酶在合成S W的过程中发挥相同或相似作用,因此推测其中由P AңS W的过程与M.r o b e r t s i i和A.o x y t-r o p i s相似㊂M.r o b e r t s i i及A.o x y t r o p i s中由1-羟基吲哚里西啶合成S W的过程非常相似,均为1-羟基吲哚里西啶S w n H2酶ң1,2-二羟基吲哚里西啶S w n H1酶ңS W,此过程中合成的化合物同分异构结构变化目前仍在研究,推测各化合物的变化情况大致相似(图3-C㊁3-D)㊂在R.L e g u m i n i c o l a中该过程也与上述两种真菌相似,发生了两步氧化反应,在M.a n i s o p l i a e中无相关基因功能实验证据,但因其存在S w n H1和S w n H2两种酶,因此推测与M.r o b e r t s i i及A.o x y t r o p i s相似㊂因此,在不同产S W真菌中S W的合成途径不完全相同,目前在上述4种真菌中S W合成途径研究仍需深入,部分反应过程及所需关键酶需进一步确定㊂4展望牲畜过量食用疯草后引起S W中毒,严重者死亡,对畜牧业造成巨大损失[69],然而脱S W的黄芪属㊁棘豆属植物本身蛋白质含量高,具有很好的营养价值[70]㊂苦马豆素能抑制肿瘤的发生和转移,可筛选高产S W的疯草内生真菌进行发酵研究㊂疯草内生真菌的S W合成途径研究还需深入,包括各种关键酶㊁调控因子和调控机制㊂可继续深入挖掘疯草真菌基因组序列,联合多组学分析,寻找其他S W合成相关的基因及代谢产物,并进行功能分析,从而进一步细化和完善其S W合成途径㊂疯草内生真菌是大型丝状真菌,其外源D N A的原生质体转化难度大,同源重组率低,故可进行技术优化研究,或开发基因组编辑等新技术进行基因功能研究㊂363草地学报第32卷图2四种真菌中P A合成1-羟基吲哚里西啶过程F i g.2 T h e s y n t h e t i c p r o c e s s o fP At o1-h y d r o x y i n d o l i z i n e i n f o u r f u n g i 注:A,豆类丝核菌;B,金龟子绿僵菌;C,罗伯茨绿僵菌;D,疯草内生真菌N o t e:A,R.L e g u m i n i c o l a;B,M.a n i s o p l i a e;C,M.r o b e r t s i i;D,A.o x y t r o p i s本课题组目前正在进行小花棘豆内生真菌A. o x y t r o p i s OW7.8中S W合成途径及其合成相关基因的研究,克隆了所有的S WN基因簇成员和P5C R 基因,构建和筛选了这6个基因的敲除突变株,后续将检测敲除突变株和野生株的S W的水平,并结合基因组学㊁转录组学和代谢组学等多组学相关分析,深入研究相关基因功能,进而明晰在A.o x y t r o p i s OW7.8中S W的生物合成途径㊂463第2期李 丹等:产苦马豆素的疯草内生真菌研究进展图3 四种真菌中1-羟基吲哚里西啶到S W 过程F i g .3 T h e s y n t h e t i c p r o c e s s o f 1-h y d r o x y i n d o l i z i n e t oS Wi n f o u r f u n gi 注:A ,豆类丝核菌;B ,金龟子绿僵菌;C ,罗伯茨绿僵菌;D ,疯草内生真菌N o t e :A ,R .L e g u m i n i c o l a ;B ,M .a n i s o p l i a e ;C ,M .r o b e r t s i i ;D ,A .o x y t r o pi s 563草地学报第32卷参考文献[1]杨晨,沙日扣,苏日拉格,等.中国天然草原毒害草种类分布㊁毒性及防控与利用研究进展[J].家畜生态学报,2022,43(11):88-96[2]高新磊,韩冰,赵萌莉,等.疯草及毒性成分研究进展[J].草业学报,2011,20(3):279-286[3]王庆海,李翠,庞卓,等.中国草地主要有毒植物及其防控技术[J].草地学报,2013,21(5):831-841[4] D O R L I N GPR,HU X T A B L ECR,C O L E G A T ES M.I n h i b i-t i o no f l y s o s o m a l a l p h a-m a n n o s i d a s e b y s w a i n s o n i n e,a n i n d o l i-z i d i n ea l k a l o i di s o l a t e df r o m S w a i n s o n ac a n e s c e n s[J].B i o-c h e m i c a l J o u r n a l,1980,191(2):649-651[5] C O L E G A T ESM,D O R L I N GPR,HU X T A B L ECR.AS p e c-t r o s c o p i c I n v e s t i g a t i o no fS w a i n s o n i n e:A nα-M a n n o s i d a s eI n-h i b i t o rI s o l a t e d f r o m S w a i n s o n ac a n e s c e n s[J].A u s t r a l i a nJ o u r n a l o fC h e m i s t r y,1979,32:2257-2264[6]曹光荣,李绍君,段得贤,等.黄花棘豆有毒成分的分离与鉴定[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),1989,17(3):1-8 [7] T U L S I A N IDRP,B R O Q U I S T H P,J AM E SLF,e t a l.T h es i m i l a r e f f e c t so f s w a i n s o n i n ea n d l o c o w e e do nt i s s u e g l y c o s i-d a se s a n do l i g o s a c c h a r i d e s of t h e p ig i n d i c a t e th a t t h e a l k a l oi di s t h e p r i n c i p a l t o x i nr e s p o n s i b l e f o r t h e i n d u c t i o no f l o c o i s m[J].A r c h i v e s o fB i o c h e m i s t r y a n dB i o p h y s i c s,1984,232(1): 76-85[8] K I N O T,I N AMU R A N,N A K A H A R A K,e t a l.S t u d i e s o f a ni m m u n o m o d u l a t o r,s w a i n s o n i n e.I I.E f f e c to fs w a i n s o n i n eo nm o u s e i m m u n o d e f i c i e n t s y s t e ma n d e x p e r i m e n t a lm u r i n e t u m o r [J].J o u r n a l o fA n t i b i o t i c s,1985,38(7):936-940[9] B R A U N K,R OM E R O J,L I D D E L L C,e ta l.P r o d u c t i o no fs w a i n s o n i n e b y f u n g a l e n d o p h y t e so f l o c o w e e d[J].M y c o l o g i-c a lR e s e a r c h,2003,107(8):980-988[10]WO U D E N B E R GJH,G R O E N E WA L DJ Z,B I N D E R M,e t a l.A l t e r n a r i a r e d e f i n e d[J].S t u d i e s i n M y c o l o g y,2013,75(1):171-212[11]P R Y O RB M,C R E AM E R R,S H O E MA K E R R A,e t a l.U n-d i f i l u m,ane w g e n u sf o r e n d o p h y t i c E m b e l l i s i a o x y t r o p i s a n dp a r a s i t i c H e l m i n t h o s p o r i u m b o r n m u e l l e r i o n l e g u m e s[J].B o t-a n y,2009,87(2):178-194[12]C H E N X,P E N G L H,L IN,e t a l.T h eh e a l i n g a n da n t i-s c a re f f e c t s o f a s t r a g a l o s i d e I Vo n t h ew o u n dr e p a i r i nv i t r oa n d i nv i v o[J].J o u r n a lo fE t h n o p h a r m a c o l o g y,2012,139(3):721-727[13]E L I S E N S WJ,D E N F O R DKE.F l a v o n o i d s t u d i e s i n f o u r s p e-c i e s o f t h e O x y t r o p i s c a m p e s t r i s c o m p l e x(F a b a c e a e–G a l e g e a e)[J].C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y,1982,60(8):1431-1436[14]赵宝玉,童德文,葛鹏斌,等.我国西部草原疯草危害调查[J].中国草地,2003(4):66-69[15]J O HN S O NLJ,D EB O N T H AC M,B R I G G SLR,e t a l.T h ee x p l o i t a t i o nof e p i c h l o a e e n d o p h y t e sf o rag r i c u l t u r a lb e n e f i t[J].F u n g a lD i v e r s i t y,2013,60(1):171-188[16]X U X,R A O Z M,X UJZ,e ta l.E n h a n c e m e n to f l-P i p e c o l i cA c i dP r o d u c t i o nb y D y n a m i cC o n t r o l o f S u b s t r a t e s a n d M u l t i-p l eC o p i e so f t h e p i p A G e n e i nt h e E s c h e r i c h i a c o l i G e n o m e [J].A C SS y n t h e t i cB i o l o g y,2022,11(2):760-769 [17]M O HN I K E L,HU A N G W,WO R B S B,e ta l.N-H y d r o x yp i p e c o l i c a c i dm e t h y l e s t e r i s i n v o l v e d i n A r a b i d o p s i s i m m u n i t y [J].J o u r n a l o fE x p e r i m e n t a l B o t a n y,2023,74(1):458-471[18]B R AM B I L L A A,L E N K M,G H I R A R D O A,e ta l.P i p e c o l i ca c i d s y n t h e s i s i s r e q u i r e d f o r s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c ea n dp l a n t-t o-p l a n t-i n d u c e d i m m u n i t y i nb a r l e y[J].J o u r n a lo fE x-p e r i m e n t a l B o t a n y,2023,74(10):3033-3046[19]L I M G H.R e g u l a t i o n o f S a l i c y l i c A c i d a n d N-H y d r o x y-P i p e c o l i cA c i d i nS y s t e m i cA c q u i r e dR e s i s t a n c e[J].T h eP l a n t P a t h o l o g y J o u r n a l,2023,39(1):21-27[20]G U A N H R,L I U X,F U Y P,e t a l.T h e l o c o w e e de n d o p h y t eA l t e r n a r i a o x y t r o p i s a f f e c t s r o o td e v e l o p m e n t i n A r a b i d o p s i si nv i t r o t h r o u g ha u x i n s i g n a l i n g a n d p o l a r t r a n s p o r t[J].J o u r-n a l o fE x p e r i m e n t a l B o t a n y,2023,74(3):931-944 [21]G U A N H R,L I U X,MU R L A J,e ta l.R e t h i n k i n g o ft h eR o l e so fE n d o p h y t eS y m b i o s i sa n d M y c o t o x i ni n O x y t r o p i s P l a n t s[J].J o u r n a l o f F u n g i,2021,7(5):400[22]R OM E R OJM,C R E AM E RR,Z E P E D A H,e t a l.T h e t o x i c o-s i s o f E m b e l l i s i a f u n g i f r o ml o c o w e e d(O x y t r o p i s l a m b e r t i i)i s s i m i l a r t o l o c o w e e d t o x i c o s i s i n r a t s[J].J o u r n a l o fA n i m a l S c i-e n c e,2004,82(7):2169-2174[23]V A L D E ZBJR,MA R K W P,M I C H A E L H R,e ta l.W h i t el o c o w e e d t o x i c i t y i s f a c i l i t a t e d b y a f u n g a l e n d o p h y t e a n d n i t r o-g e n-f i x i n g b a c t e r i a[J].E c o l o g y,2007,88(7):1850-1856[24]C O O K D,G A R D N E R D R,W E L C H K D,e t a l.Q u a n t i t a t i v eP C R M e t h o dT oM e a s u r e t h eF u n g a l E n d o p h y t e i nL o c o w e e d s [J].J o u r n a lo f A g r i c u l t u r a la n d F o o d C h e m i s t r y,2009,57(14):6050-6054[25]C O O K D,G A R D N E R D R,P F I S T E RJA.S w a i n s o n i n e-C o n-t a i n i n g P l a n t s a n dT h e i rR e l a t i o n s h i p t oE n d o p h y t i c F u n g i[J].J o u r n a l o f A g r i c u l t u r a la n d F o o d C h e m i s t r y,2014,62(30): 7326-7334[26]G A R D N E RDR,M C L A I NRJ,R A L P H SM H,e t a l.C o r r e l a-t i o no f a ne n d o p h y t i c f u n g u s(A l t e r n a r i a s p p.)w i t h t h e p r e s-e n c eo fs w a i n s o n i n ei n L a m b e r tl o c o w e e d(O x y t r o p i sl a m-b e r t i i)[J].P o i s o n o u s P l a n t s a n dR e l a t e dT o x i n s,2004(1):32-37[27]R A L P H S M H,C R E AM E R R,B A U C OM D,e t a l.R e l a t i o n-s h i p B e t w e e nt h eE n d o p h y t e E m b e l l i s i a s p p.a n dt h e T o x i cA l k a l o i dS w a i n s o n i n e i n M a j o rL o c o w e e dS p e c i e s(A s t r a g a l u sa n d O x y t r o p i s)[J].J o u r n a lo fC h e m i c a lE c o l o g y,2007,34(1):32-38[28]Y U Y T,Z HA O Q M,WA N GJN,e t a l.S w a i n s o n i n e-p r o d u-c i n g f u n g a l e nd o p h y te sf r o m m a j o r l o c o w e e ds p e c i e s i nC h i n a[J].T o x i c o n,2010,56(3):330-338[29]余永涛,王建华,赵清梅,等.甘肃棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离与鉴定[J].西北农林科技大学学报(自然科学版), 2009,37(2):40-46,51663第2期李丹等:产苦马豆素的疯草内生真菌研究进展[30]霍红雁,卢萍,牛艳芳,等.小花棘豆(O x y t r o p i s g l a b r a D C.)11株内生真菌的分离培养及鉴定[J].内蒙古大学学报(自然科学版),2010,41(2):206-211[31]张蕾蕾,何生虎,余永涛,等.宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离及鉴定[J].中国畜牧兽医,2013,40(12):165-172 [32]汪治刚,曹师,徐娜,等.我国3种疯草的内生真菌培养特性研究[J].草业学报,2017,26(10):158-169[33]L IY,C R E AM E RR,B A U C OM D,e t a l.P a t h o g e n i c E m b e l l i-s i a a s t r a g a l i o n A s t r a g a l u s a d s u r g e n s i s v e r y c l o s e l y r e l a t e d t o l o c o w e e de n d o p h y t e[C].P h y t o p a t h o l o g y,2011(101):S102-S103[34]B A U C OM D L,R OM E R O M,B E L F O N R,e ta l.T w on e ws p e c i e s o f U n d i f i l u m,f u n g a l e n d o p h y t e so f A s t r a g a l u s(l o c o-w e e d s)i n t h eU n i t e dS t a t e s[J].B o t a n y,2012,90(9):866-875[35]WO U D E N B E R GJH,S E I D L MF,G R O E N E WA L DJ Z,e t a l.A l t e r n a r i a s e c t i o n A l t e r n a r i a:S p e c i e s,f o r m a e s p e c i a l e s o rp a t h o t y p e s[J].S t u d i e s i n M y c o l o g y,2015,82:1-21[36]P O L A N DJA,B A L I N T KPJ.W I S S E R RJ,e t a l.S h a d e so fg r a y:t h ew o r l d o f q u a n t i t a t i v e d i s e a s e r e s i s t a n c e[J].T r e n d s i nP l a n t S c i e n c e,2009,14(1):21-29[37]H E W,G U OL,WA N GL,e t a l.H o s tG e n o t y p e a n dP r e c i p i t a-t i o n I n f l u e n c eo fF u n g a lE n d o p h y t eS y m b i o s i sa n d M y c o t o x i nA b u n d a n c e i naL o c o w e e d[J].I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o fM o l e c-u l a r S c i e n c e s,2019,20(21):5285[38]O L D R U PE,M C L A I NRJM,P A D I L L A A,e t a l.L o c a l i z a t i o no f e n d o p h y t i c U n d i f i l u m f u n g i i n l o c o w e e ds e e da n d i n f l u e n c e o fe n v i r o n m e n t a l p a r a m e t e r so nal o c o w e e di n v i t r oc u l t u r e s y s t e m[J].B o t a n y,2010,88(5):512-521[39]G A O XL,C O O KD,R A L P H SM H,e t a l.D e t e c t i o n o f s w a i n-s o n i n e a n d i s o l a t i o no f t h e e n d o p h y t e U n d i f i l u m f r o mt h em a-j o r l o c o w e e d s i nI n n e r M o n g o l i a[J].B i o c h e m i c a lS y s t e m a t i c sa n dE c o l o g y,2012,45:79-85[40]N O O R AI,N A V A A,C O O K E P,e ta l.E v i d e n c ef o rn o n-p a t h o g e n i cr e l a t i o n s h i p so f A l t e r n a r i a s e c t i o n U n d i f i l u m e n-d o p h y te sw i t h i n t h r e e h o s t l o c o w e e d p l a n t s p e c i e s[J].B o t a n y,2018,96(3):187-200[41]WH I T EJF,M O R G A NJG,MO R R OW A C.T a x o n o m y,l i f ec y c l e,r e p r od u c t i o na n dde t e c t i o nof A c r e m o n i u m e n d o p h y t e s[J].A g r i c u l t u r e,E c o s y s t e m s&E n v i r o n m e n t,1993,44(1): 13-37[42]C O O K D,G A R D N E RDR,R A L P H S M H,e t a l.S w a i n s o n i n-i n e C o n c e n t r a t i o n s a n d E n d o p h y t e A m o u n t s o f U n d i f i l u mo x y t r o p i s i n D i f f e r e n tP l a n tP a r t so f O x y t r o p i s s e r i c e a[J].J o u r n a l o fC h e m i c a l E c o l o g y,2009,35(10):1272-1278 [43]B A R I L L A SJR V,P A S C H K E M W,R A L P H S M H,e ta l.W h i t eL o c o w e e dT o x i c i t y I s F a c i l i t a t e d b y aF u n g a l E n d o p h y t ea n dN i t r o g e n-F i x i n g B a c t e r i a[J].E c o l o g y,2007,88(7):1850-1856[44]R O D R I G U E ZRJ,WH I T EJ J F,A R N O L DAE,e t a l.F u n g a le n d o p h y t e s:d i v e r s i t y a n df u n c t i o n a l r o l e s[J].N e w P h y t o l o-g i s t,2009,182(2):314-330[45]C R E AM E R R,B A U C OM D.F u n g a lE n d o p h y t e so fL o c o-w e e d s:A C o m m e n s a l R e l a t i o n s h i p?[J].J o u r n a lo f P l a n t P h y s i o l o g y&P a t h o l o g y,2013,1:2[46]A L AM B,L I JW,G E Q,e t a l.E n d o p h y t i cF u n g i:F r o mS y m-b i o s i s t o S ec o nd a r y Me t a b o l i t e C o m m u n i c a t i o n s o rV i c eV e r s a?[J].F r o n t i e r s i nP l a n t S c i e n c e,2021,12:791033[47]卢萍,D E N N I SC,赵萌莉,等.小花棘豆(O x y t r o p i s g l a b r aD C.)内生真菌的培养与鉴定[J].生态学报,2009,29(1):53-58[48]余永涛,王建华,王妍,等.西藏3种疯草中合成苦马豆素内生真菌的鉴定[J].中国农业科学,2009,42(10):3662-3671 [49]L AWR E N C EDP,G A N N I B A LPB,P E E V E RTL,e t a l.T h es e c t i o n s o f A l t e r n a r i a:f o r m a l i z i n g s p e c i e s-g r o u p c o n c e p t s[J].M y c o l o g i a,2013,105(3):530-546[50]S T O R T S D R,B H A T T A C H A R J E E J K.P u r i f i c a t i o na n dp r o p e r t i e s o f s a c c h a r o p i n e d e h y d r o g e n a s e(g l u t a m a t e f o r m i n g)i nt h eS a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a el y s i n eb i o s y n t h e t i c p a t h w a y[J].J o u r n a l o f B a c t e r i o l o g y,1987,169(1):416-418[51]H A R R I SC M,S C H N E I D E R M J,U N G E MA C H FS,e ta l.B i o s y n t h e s i so f t h e t o x i c i n d o l i z i d i n ea l k a l o i d ss l a f r a m i n ea n ds w a i n s o n i n ei n R h i z o c t o n i al e g u m i n i c o l a:m e t a b o l i s m o f1-h y d r o x y i n d o l i z i d i n e s[J].J o u r n a lo ft h e A m e r i c a n C h e m i c a lS o c i e t y,1988,110:940-949[52]MU K H E R J E ES,D AW E A L,C R E AM E R R.P o t e n t i a l r o l ef o r s a c c h a r o p i n e r e d u c t a s e i ns w a i n s o n i n em e t a b o l i s mi ne n d o-p h y t i cf u n g u s,U n d i f i l u m o x y t r o p i s[J].F u n g a l B i o l o g y, 2012,116(8):902-909[53]L U P,L IX,WA N GSY,e t a l.S a c c h a r o p i n e r e d u c t a s e i n f l u-e n c e s p r o d u c t i o no fS w a i n s o n i n e i n A l t e r n a r i ao x y t r o p i s[J].S Y D OW I A,2021,73:69-74[54]萨如拉,席领军,卢萍,等.不同添加物对小花棘豆内生真菌酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1合成苦马豆素的影响[J].生命科学研究,2018,22(4):298-304[55]L IX,L U P.T r a n s c r i p t o m eP r o f i l e so f A l t e r n a r i ao x y t r o p i sP r o v i d e s I n s i g h t s i n t oS w a i n s o n i n eB i o s y n t h e s i s[J].S c i e n t i f i c R e p o r t s,2019,9(1):6021[56]X U N,C HU YL,C H E N H L,e t a l.R i c e t r a n s c r i p t i o n f a c t o rO s MA D S25m o d u l a t e s r o o t g r o w t ha n dc o n f e r s s a l i n i t y t o l e r-a n c e v i a t h eA B A-m e d i a t e d r e g u l a t o r yp a t h w a y a n dR O S s c a v-e n g i n g[J].P l o sG e n e t i c s,2018,14(10):e1007662[57]A D AM S E,F R A N K L.M e t a b o l i s m o f p r o l i n e a n d t h eh y d r o x y p r o l i n e s[J].A n n u a lR e v i e w o fB i o c h e m i s t r y,1980,49:1005-1061[58]H A R E P D,C R E S S W A.T i s s u e-s p e c i f i ca c c u m u l a t i o n o ft r a n s c r i p te n c o d i n gΔ1-p y r r o l l i n e-5-c a r b o x y l a t e r e d u c t a s ei nA r a b i d o p s i s t h a l i a n a[J].P l a n tG r o w t h R e g u l a t i o n,1996,19(3):249-256[59]白璐,卢萍,王钰,等.棘豆链格孢P5C R基因的克隆及表达分析[J].中国兽医杂志,2023,59(4):33-40[60]吴楚,王政权.脱落酸及其类似物与植物抗寒性之间的关系[J].植物生理学通讯,2000,36(6):562-567[61]Z H A N G L,WU R,MU R L AJ,e ta l.A s s e m b l y o fh i g h‐q u a l i t yg e n o m e so f t h e l o c o w e e d O x y t r o p i s o c h r o c e p h a l a a n d763。
1株链格孢属真菌生物碱类代谢产物的研究
1株链格孢属真菌生物碱类代谢产物的研究链格孢属真菌是一类广泛存在于自然界中的真菌，包括了一系列不同种类的物种。
它们通常寄生于植物体表面，或生长在土壤中。
作为一种特殊的真菌，链格孢属真菌的代谢产物的研究一直备受关注。
这是因为它们产生的生物碱类代谢产物被认为具有很多生物活性和潜在的药用价值。
在过去的几十年里，很多链格孢属真菌的生物碱类代谢产物已经被发现，并进行了深入的研究。
其中一种非常有代表性的生物碱类代谢产物是链格孢碱(Alochalin)，它是由链格孢属真菌生产的一种含氮的生物碱化合物。
链格孢碱具有抗菌、抗炎和抗肿瘤等多种生物活性。
研究发现，链格孢碱具有与青霉素相似的结构，因此对克服青霉素耐药性菌株具有很好的效果。
此外，链格孢碱还能有效抑制癌细胞的生长和扩散，且对人体正常细胞的毒性较低。
除了链格孢碱，还有很多其他类型的生物碱类代谢产物在链格孢属真菌中被发现。
例如，链格孢二胺(Stemphylline)和链格孢酸(Spaoacidiol)等。
这些生物碱类代谢产物以其独特的化学结构和生物活性引起了广泛的关注。
在研究链格孢属真菌生物碱类代谢产物的过程中，学者们采取了多种方法。
其中一种常见的方法是通过分离链格孢属真菌中的代谢产物，然后使用光谱学等手段进行结构鉴定。
另外，还有人通过基因组学和转录组学等方法，深入研究链格孢属真菌的生物合成途径，进一步揭示其生物碱类代谢产物的合成机制。
除了了解链格孢属真菌生物碱类代谢产物的结构和生物活性，了解这些代谢产物的合成机制也是十分重要的。
这有助于人们深入了解链格孢属真菌的生物合成途径，进一步开发和应用这些生物碱类代谢产物。
未来的研究可以从以下几个方面入手：首先，可以继续发掘新的链格孢属真菌物种，寻找新的生物碱类代谢产物；其次，结合化学合成和微生物发酵等方法，开发新的链格孢碱类似物；最后，通过基因组学和转录组学的方法，进一步揭示链格孢属真菌生物合成途径的细节，为后续的合成工程提供基础。
链格孢属部分种的分类研究现状
链格孢属部分种的分类研究现状谢红辉【摘要】The 5.8SrDNA and ITS sequences of 41 species of Alternaria and 2 species of Stemphylium are analyzed, and the phylogenetic tree has been made. The analysis results indicated that the taxonomy among species of Alternaria is chaotic, the phylogenetic relationship of some species is very close to Stemphylium. The species those have great morphological differences can be distinguished according to sequence analysis, but sequence analysis can not distinguish the species those have little morlahological differences.%分析了41个链格孢属（Alternaria）种和2个匍柄霉属（Stemphylium）种的5．8SrD—NA及ITS序列，并构建了系统发育树。
对该系统发育树的分析表明，链格孢属种间分类比较混乱；某些种与匍柄霉属个别种的亲缘关系非常接近。
链格孢属种间形态差异大的，可以根据序列分析加以区分，而形态差异小的则不能区分。
【期刊名称】《农业研究与应用》【年(卷),期】2012(000)004【总页数】6页(P28-33)【关键词】链格孢属;匍柄霉属;系统发育树【作者】谢红辉【作者单位】广西壮族自治区亚热带作物研究所,南宁530001【正文语种】中文【中图分类】Q949.32链格孢属（Alternaria）真菌是极为常见的一类分生孢子菌，全世界已描述的500个链格孢菌种级分类单位中，95%以上寄生在植物上，引起多种植物病害，给农业生产和贮运中的农产品造成重大损失［1～4］。
甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(４):９４７￣９５５ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ刘志刚ꎬ余方伟ꎬ张㊀伟ꎬ等.甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(４):９４７￣９５５.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０４.００４甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性刘志刚１ꎬ㊀余方伟２ꎬ㊀张㊀伟２ꎬ㊀于㊀利２ꎬ㊀李建斌２ꎬ㊀王神云２ꎬ㊀宋江华１(１.安徽农业大学园艺学院ꎬ安徽合肥２３００３６ꎻ２.江苏省农业科学院蔬菜研究所ꎬ江苏南京２１００１４)收稿日期:２０２２￣０８￣１６基金项目:江苏省重点研发计划(现代农业)项目(ＢＥ２０２１３７６)ꎻ国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目(ＣＡＲＳ￣２３￣Ｇ４２)ꎻ国家自然科学基金项目(３２２７２７２８)作者简介:刘志刚(１９９８－)ꎬ男ꎬ安徽合肥人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事甘蓝病害鉴定及种质资源筛选利用研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｌｚｇａｎｇ＠ｓｔｕ.ａｈａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ通讯作者:宋江华ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｊｈｓｏｎｇ＠ａｈａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻ王神云ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗａｎｇｓｈｅｎｙｕｎ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀对江苏省甘蓝(Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａｖａｒ.ｃａｐｉｔａｔａＬ.)叶片上发生的黑斑病进行病原菌鉴定ꎬ并测试病原菌对杀菌剂的敏感性ꎮ经形态学观察ꎬ初步明确分离得到的病原菌(ＨＢ０㊁ＨＢ１㊁ＨＢ２㊁ＨＢ３㊁ＨＢ５㊁ＨＢ６)为链格孢属真菌ꎮ基于科赫氏法则测定病原菌致病性ꎬ发现ＨＢ１㊁ＨＢ３㊁ＨＢ６能在甘蓝叶片上致病ꎮ扩增上述３个致病菌株的核糖体ＤＮＡ内转录间隔区(ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ)㊁过敏原基因(Ａｌｔａ１)㊁３￣磷酸甘油醛脱氢酶基因(ＧＡＰＤＨ)ꎬ得到大小为５１１~５９６ｂｐ目的片段ꎮ多基因联合聚类分析结果显示ꎬ引起江苏省甘蓝黑斑病的病原菌为芸薹生链格孢(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ)ꎮ室内毒力试验发现ꎬ在测试的８种杀菌剂中ꎬ苯醚甲环唑㊁咯菌腈㊁己唑醇㊁氟硅唑㊁戊唑醇㊁丙环唑㊁异菌脲对病原菌菌丝生长的抑制效果较好ꎬ代森锰锌对病原菌菌丝生长的抑制作用较弱ꎮ关键词:㊀甘蓝ꎻ黑斑病ꎻ芸薹生链格孢菌ꎻ杀菌剂中图分类号:㊀Ｓ４３６.３５㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０４￣０９４７￣０９ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｃａｕｓｉｎｇｂｌａｃｋｓｐｏｔｏｎＢｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａｖａｒ.ｃａｐｉｔａｔａＬ.ＬＩＵＺｈｉ￣ｇａｎｇ１ꎬ㊀ＹＵＦａｎｇ￣ｗｅｉ２ꎬ㊀ＺＨＡＮＧＷｅｉ２ꎬ㊀ＹＵＬｉ２ꎬ㊀ＬＩＪｉａｎ￣ｂｉｎ２ꎬ㊀ＷＡＮＧＳｈｅｎ￣ｙｕｎ２ꎬ㊀ＳＯＮＧＪｉａｎｇ￣ｈｕａ１(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨｅｆｅｉ２３００３６ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅＣｒｏｐｓꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｃａｂｂａｇｅ(Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａｖａｒ.ｃａｐｉｔａｔａＬ.)ｌｅａｖｅｓｓｈｏｗｉｎｇｂｌａｃｋｓｐｏｔｓｙｍｐｔｏｍｉｎＪｉａｎｇｓｕｐｒｏｖｉｎｃｅꎬａｎｄｉｔｓｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｗａｓｔｅｓｔｅｄ.Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｕｎ￣ｇｉ(ＨＢ０ꎬＨＢ１ꎬＨＢ２ꎬＨＢ３ꎬＨＢ６ꎬＨＢ６)ｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏＡｌｔｅｒｎａｒｉａｓｐｐ.Ｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｐａｔｈｏｇｅｎｓｗａｓｄｅｔｅｒ￣ｍｉｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＫｏｃｈ ｓｐｏｓｔｕｌａｔｅｓ.ＨＢ１ꎬＨＢ３ａｎｄＨＢ６ｗｅｒｅａｂｌｅｔｏｃａｕｓｅｄｉｓｅａｓｅｏｎｃａｂｂａｇｅｌｅａｖｅｓ.ＴｈｅｎｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒｏｆｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ(ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ)ꎬａｌｌｅｒｇｅｎｇｅｎｅ(Ａｌｔａ１)ａｎｄｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ￣３￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｇｅｎｅ(ＧＡＰＤＨ)ｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍＨＢ１ꎬＨＢ３ａｎｄＨＢ６ꎬａｎｄｔｈｅｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｉｔｈａｌｅｎｇｔｈｏｆ５１１－５９６ｂｐｗｅｒｅｏｂ￣ｔａｉｎｅｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｍｕｌｔｉ￣ｇｅｎｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｃａｕｓｉｎｇｂｌａｃｋｓｐｏｔｏｎｃａｂｂａｇｅｉｎＪｉａｎｇｓｕｐｒｏｖｉｎｃｅｗａｓＡｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ.Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬａｍｏｎｇｅｉｇｈｔｔｅｓｔｅｄｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓꎬｄｉｆｅｎｏｃｏｎａｚｏｌｅꎬｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌꎬｈｅｘａｃｏｎａｚｏｌｅꎬｆｌｕｓｉｌａｚｏｌｅꎬｔｅｂｕｃｏｎａｚｏｌｅꎬｐｒｏｐｉｃｏｎａｚｏｌｅａｎｄｉｐｒｏｄｉｏｎｅｈａｄｓｔｒｏｎｇｅｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｔｈｅｍｙｃｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｏｆｐａｔｈｏｇｅｎꎬｗｈｉｌｅｍａｎｃｏｚｅｂｈａｄｗｅａｋｅｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａｖａｒ.ｃａｐｉｔａｔａＬ.ꎻｂｌａｃｋｓｐｏｔꎻＡｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａꎻｆｕｎｇｉｃｉｄｅ㊀㊀十字花科芸薹属植物(Ｂｒａｓｓｉｃａｓｐｐ.)包含甘蓝(Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａｖａｒ.ｃａｐｉｔａｔａＬ.)㊁白菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ)和油菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ)等多种蔬菜油料作物ꎬ在全球种植的农作物中占有重要地位ꎮ２０１９年ꎬ甘蓝及其他芸薹属作物的栽培面积位列中国蔬菜种植面积前十ꎬ７４９同时该类作物的出口量达９ ８５３ˑ１０４ｔꎬ在中国蔬菜主要出口种类中位列第２[１]ꎮ江苏省是甘蓝的重要种植区之一[２]ꎬ近年来ꎬ随着甘蓝栽培面积逐渐扩大ꎬ黑斑病频频发生ꎬ成为影响甘蓝可持续生产的重要病害ꎮ十字花科作物黑斑病由链格孢属真菌(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｐｐ.)引起ꎬ可危害植物的叶片㊁茎㊁叶柄㊁角果等组织ꎮ叶面发病时ꎬ侵染部位产生水渍状小点ꎬ并逐渐形成许多肉眼可见的小黑点ꎬ后期发展成同心轮纹病斑ꎬ病斑有时穿孔[３]ꎮ世界范围内ꎬ黑斑病导致印度十字花科油料作物产量损失１５％~７１％ꎬ在加拿大ꎬ因黑斑病导致的十字花科油料作物产量损失达２０％~３０％[４]ꎮ除了导致作物减产外ꎬ链格孢属真菌还会产生７０多种真菌毒素ꎬ其中交链孢酚单甲醚(Ａｌｔｅｒｎａｒｉｏｌ９￣ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｅ￣ｔｈｅｒ)具有基因毒性㊁交链孢毒素(Ａｌｔｅｒｔｏｘｉｎ)具有致突变性ꎬ是人类健康的潜在威胁[５￣６]ꎮ链格孢属真菌种类多且分类复杂ꎬ目前已有记录的就有３００多种[７]ꎮ为了明确甘蓝黑斑病病原菌的分类地位ꎬ王超等[８]通过核糖体ＤＮＡ内转录间隔区(ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ)序列分析发现ꎬ芸薹生链格孢(Ａｌｔｅｒ￣ｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ)是引起东北农业大学实习基地内甘蓝黑斑病的病原菌ꎮ另有研究结果表明ꎬ芸薹生链格孢㊁芸薹链格孢(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃａｅ)㊁萝卜链格孢(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｒａｐｈａｎｉ)㊁链格孢(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａｔａ)均能侵染甘蓝[３]ꎮ为了揭示江苏省甘蓝黑斑病的病原菌种类ꎬ从江苏省南京市和宜兴市采集疑似黑斑病的甘蓝病株ꎬ在明确分离菌株形态学特征和致病性的基础上ꎬ结合多基因分子系统学研究ꎬ鉴定甘蓝黑斑病致病菌ꎬ同时测试不同杀菌剂对病原菌的室内毒力ꎬ以期为甘蓝黑斑病病原菌的鉴别和防治提供科学依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀病样采集与病原菌分离在南京市江宁区和宜兴市周铁镇甘蓝种植区ꎬ选取具有黑斑病发病典型症状的甘蓝植株ꎬ拍照并采集病叶备用ꎮ按照方中达[９]的常规组织分离方法进行甘蓝黑斑病病原菌分离ꎬ从病变叶片边缘切下５ｍｍˑ５ｍｍ大小的叶片组织ꎬ７５％乙醇表面消毒９０ｓꎬ无菌水洗净后用灭菌滤纸吸干水分ꎬ接种于ＰＤＡ培养基(货号ＣＭ０１３９ꎬＯｘｏｉｄ公司产品)ꎬ置于２５ħ条件下培养ꎮ长出的菌落经过单孢纯化ꎬ保存于４ħ冰箱中备用ꎮ１.２㊀形态特征观察用打孔器在菌落边缘取直径为０ ５ｃｍ的菌丝块ꎬ接种到ＰＤＡ平板中央ꎬ置于２５ħ培养７ｄꎬ然后观察菌落形态ꎮ用无菌水洗脱分生孢子ꎬ在光学显微镜(货号ＯｌｙｍｐｕｓＣＸ３３ꎬＯｌｙｍｐｕｓ公司产品)下观察分生孢子形态特征ꎮ１.３㊀致病性测定用于病原菌致病性测试的甘蓝品种ＨＢＪＤ２８３由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供ꎮ将甘蓝种子播种在含基质的５０穴育苗盘中ꎬ于温室中培养约３０ｄ后备用ꎮ菌丝块接种法:供试菌株在２５ħ培养７ｄꎬ然后用打孔器在菌落边缘取直径为０ ５ｃｍ的菌丝块ꎬ将菌丝块接种于离体甘蓝叶片表面ꎬ以接种琼脂块的叶片作为对照ꎮ接种后的叶片置于托盘内ꎬ覆盖保鲜膜保湿ꎬ在２５ħ条件下培养３ｄꎬ然后观察发病情况ꎮ孢子喷雾法:将供试菌株接种至ＰＤＡ培养基中ꎬ置于２５ħ条件下培养７~１０ｄꎬ收集分生孢子ꎬ使用无菌水调整分生孢子悬浮液中分子孢子含量为１ｍｌ１ˑ１０５个ꎮ通过喷雾法将孢子悬浮液喷洒在离体甘蓝叶片上ꎬ以喷洒无菌水的叶片作为对照ꎮ接种后的叶片置于托盘内ꎬ覆盖保鲜膜保湿ꎬ在２５ħ条件下培养３ｄꎬ然后观察发病情况ꎮ１.４㊀分子生物学鉴定用灭菌牙签从２５ħ培养１０ｄ左右的ＰＤＡ平板上刮取菌丝ꎬ根据Ｃｅｎｉｓ[１０]报道的方法提取菌株基因组ＤＮＡꎮ利用目的基因引物对供试菌株的ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ㊁过敏原基因(Ａｌｔａ１)㊁３￣磷酸甘油醛脱氢酶基因(ＧＡＰＤＨ)进行ＰＣＲ扩增(表１)ꎮＰＣＲ扩增体系(５０μｌ):２５μｌ２ˑＱｕｉｃｋＴａｑ ＨＳＤｙｅＭｉｘ(ＤＴＭ￣１０１ꎬＴｏｙｏｂｏ)ꎬ１μｌ基因组ＤＮＡꎬ上下游引物各２μｌꎬ２０μｌｄｄＨ２Ｏꎮ扩增程序ꎬｒＤＮＡ￣ＩＴＳ:９５ħ预变性３ｍｉｎꎻ９４ħ３０ｓꎬ５４ħ３０ｓꎬ７２ħ４０ｓꎬ３０个循环ꎻ最后７２ħ７ｍｉｎꎮＡｌｔａ１基因:９５ħ预变性３ｍｉｎꎻ９４ħ３０ｍｉｎꎬ５７ħ３０ｓꎬ７２ħ４５ｓꎬ３０个循环ꎻ最后７２ħ１０ｍｉｎꎮＧＡＰＤＨ基因:９５ħ预变性３ｍｉｎꎻ９４ħ３０ｓꎬ５３ħ３０ｓꎬ７２ħ３０ｓꎬ３０个循环ꎻ最后７２ħ１０ｍｉｎꎮＰＣＲ扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测后ꎬ送通用生物(安徽)股份有限公司进行双向测序ꎮ获得的目的片段序列经校对后ꎬ在ＮＣＢＩ网站进行ＢＬＡＳＴ检索分析ꎮ下载芸薹生链格孢㊁其他链格孢属成员及番茄匍柄霉的目的基因序列ꎬ采用ＭＥＧＡ７.０软件构建多基因系统发育树ꎮ８４９江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期表１㊀扩增目的基因所用引物Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ引物名称㊀引物序列参考文献ＩＴＳ１５ᶄ￣ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ￣３ᶄ[１１]ＩＴＳ４５ᶄ￣ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３ᶄＡｌｔａ１￣Ｆ５ᶄ￣ＡＴＧＣＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣ￣３ᶄ[１２]Ａｌｔａ１￣Ｒ５ᶄ￣ＡＣＧＡＧＧＧＴＧＡＹＧＴＡＧＧＣＧＴＣ￣３ᶄＧＡＰＤＨ￣１５ᶄ￣ＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＧＴＣＧＣＡＴＴＧ￣３ᶄ[１３]ＧＡＰＤＨ￣２５ᶄ￣ＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＴＧＣ￣３ᶄ１.５㊀病原菌对杀菌剂敏感性测定采用菌丝生长抑制试验测定病原菌对不同化学药剂的敏感性ꎮ供试药剂如下:２５％苯醚甲环唑用乳油(ＥＣ)稀释(终质量浓度分别为１.００００μｇ/ｍｌ㊁０.５０００μｇ/ｍｌ㊁０.２５００μｇ/ｍｌ㊁０.１２５０μｇ/ｍｌ㊁０.０６２５μｇ/ｍｌ)ꎻ２５％丙环唑用乳油(ＥＣ)稀释(终质量浓度分别为１.００００μｇ/ｍｌ㊁０.５０００μｇ/ｍｌ㊁０.２５００μｇ/ｍｌ㊁０.１２５０μｇ/ｍｌ㊁０.０６２５μｇ/ｍｌ)ꎻ５０％异菌脲用可湿性粉剂(ＷＰ)稀释(终质量浓度分别为２ ０００μｇ/ｍｌ㊁１ ０００μｇ/ｍｌ㊁０ ５００μｇ/ｍｌ㊁０ ２５０μｇ/ｍｌ㊁０ １２５μｇ/ｍｌ)ꎻ８０％代森锰锌用可湿性粉剂(ＷＰ)稀释(终质量浓度分别为２００ ０μｇ/ｍｌ㊁１００ ０μｇ/ｍｌ㊁５０ ０μｇ/ｍｌ㊁２５ ０μｇ/ｍｌ㊁１２ ５μｇ/ｍｌ)ꎻ４０％氟硅唑用乳油(ＥＣ)稀释(终质量浓度分别为１.００００μｇ/ｍｌ㊁０.５０００μｇ/ｍｌ㊁０.２５００μｇ/ｍｌ㊁０.１２５０μｇ/ｍｌ㊁０.０６２５μｇ/ｍｌ)ꎻ５０％咯菌腈用可湿性粉剂(ＷＰ)稀释(终质量浓度分别为１.００００μｇ/ｍｌ㊁０.５０００μｇ/ｍｌ㊁０.２５００μｇ/ｍｌ㊁０.１２５０μｇ/ｍｌ㊁０.０６２５μｇ/ｍｌ)ꎻ４５％戊唑醇用悬浮剂(ＳＣ)稀释(终质量浓度分别为１.００００μｇ/ｍｌ㊁０.５０００μｇ/ｍｌ㊁０.２５００μｇ/ｍｌ㊁０.１２５０μｇ/ｍｌ㊁０.０６２５μｇ/ｍｌ)ꎻ４０％己唑醇用悬浮剂(ＳＣ)稀释(终质量浓度分别为１.００００μｇ/ｍｌ㊁０.５０００μｇ/ｍｌ㊁０.２５００μｇ/ｍｌ㊁０.１２５０μｇ/ｍｌ㊁０.０６２５μｇ/ｍｌ)ꎮ菌丝生长抑制测定:将直径为０.５ｃｍ的菌块分别接种到含杀菌剂ＰＤＡ平板和不含杀菌剂但含等量稀释溶剂的ＰＤＡ平板(对照)上ꎮ每个处理重复４次ꎮ接种后的ＰＤＡ平板置于２５ħ恒温培养箱中培养７ｄꎬ然后以十字交叉法测量各处理的菌落直径ꎬ求出菌落直径平均值ꎬ并计算抑制率ꎮ菌丝生长抑制率＝(对照菌丝生长直径－不同杀菌剂下的菌丝生长直径)/(对照菌丝生长直径－０.５ｃｍ)ˑ１００％ꎮ使用ＳＰＳＳＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ２０ꎬ对以１０为底数的杀菌剂质量浓度的对数值(ｘ)和对应的菌丝生长抑制率(Ｙ)进行回归分析ꎬ求出毒力回归方程(Ｙ＝ａｘ＋ｂ)和有效抑制中浓度(ＥＣ５０)ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀甘蓝黑斑病田间典型症状田间调查发现ꎬ甘蓝植株下部叶片发病最为频繁ꎬ同时叶球部分也有发病ꎮ发病初期形成圆形褪绿斑ꎬ随着病情进一步发展ꎬ病斑逐渐扩大变黑ꎬ四周伴有黄色晕圈ꎬ后期病斑转为淡褐色且带有同心轮纹ꎬ湿度高时可见黑褐色霉状菌丝ꎬ病斑部分有时破裂或穿孔ꎬ严重时病斑汇集成块ꎬ叶片大面积枯死ꎬ全株叶片由外向内干枯(图１)ꎮ图１㊀甘蓝黑斑病田间症状Ｆｉｇ.１㊀Ｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆｃａｂｂａｇｅｂｌａｃｋｓｐｏｔｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄ９４９刘志刚等:甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性２.２㊀病原菌分离采用组织分离法对甘蓝病叶进行病原分离和纯化ꎬ共得到６个菌株ꎬ利用显微镜观察菌丝产孢形态及孢子形态(图２)ꎮ６个菌株菌落形态和分生孢子形态的具体描述见表２ꎮＨＢ１㊁ＨＢ３㊁ＨＢ６菌落和分生孢子形态相似但孢子大小略有差异ꎬ其他３个菌株的菌落和分生孢子形态差异明显ꎮ表２㊀６个病原菌菌株的形态学比较Ｔａｂｌｅ２㊀Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｉｘｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｓｔｒａｉｎｓ菌株菌落形态分生孢子特征形态孢子直径(μｍ)隔膜数横隔膜纵隔膜ＨＢ０菌落呈不均匀黄褐色ꎬ具同心轮纹ꎬ气生菌丝发达ꎬ菌丝绵密倒棒状或卵形ꎬ喙长短不一(７~４３)ˑ(６~２５)１~８０~４ＨＢ１菌落呈黑褐色ꎬ气生菌丝少ꎬ分生孢子茂密倒棒状ꎬ无喙或短至不明显ꎬ部分孢子具有小疣突(１２~６８)ˑ(８~１６)１~５０ＨＢ２菌落呈灰绿色ꎬ气生菌丝发达卵形或近球形ꎬ无喙或短喙(１５~４８)ˑ(１２~３８)１~８０~５ＨＢ３菌落呈黑褐色ꎬ气生菌丝少ꎬ分生孢子茂密倒棒状ꎬ无喙或短至不明显ꎬ部分孢子具有小疣突(８~５０)ˑ(８~１５)１~５０ＨＢ５菌落呈灰黄色ꎬ具同心轮纹ꎬ气生菌丝发达卵形或近球形ꎬ喙长短不一(２０~６２)ˑ(１０~３７)１~７０~４ＨＢ６菌落呈黑褐色ꎬ气生菌丝少ꎬ且分生孢子茂密倒棒状ꎬ无喙或短至不明显ꎬ部分孢子具有小疣突(８~４５)ˑ(６~１５)１~４０２.３㊀病原菌的致病性参照科赫氏法则测试分离病原菌的致病性ꎮ通过菌丝块法及孢子喷雾法接种甘蓝离体叶片发现ꎬ在分离的菌株中ꎬ仅有ＨＢ１㊁ＨＢ３㊁ＨＢ６能在甘蓝叶片上致病(图３)ꎮ与对照相比ꎬ接种上述３个菌株菌丝块的叶片黄化严重ꎬ有时可见霉层ꎬ且病斑部分易破裂(图３)ꎻ通过喷雾法接种孢子３ｄ后ꎬ叶片表面密布水渍状小病斑ꎬ病斑周围黄化ꎬ与田间甘蓝黑斑病初期症状一致(图３)ꎮ２.４㊀分子生物学鉴定及序列分析在形态学初步鉴定的基础上ꎬ结合分子鉴定技术进一步明确分离得到的黑斑病病原菌的分类地位ꎮ基于形态学鉴定及致病性测定ꎬ确定ＨＢ１㊁ＨＢ３㊁ＨＢ６为病原菌ꎬ以ＨＢ１㊁ＨＢ３㊁ＨＢ６的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ分别扩增ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ㊁Ａｌｔａ１㊁ＧＡＰＤＨ基因ꎬ经测序获得ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ长度分别为５７８ｂｐ㊁５８７ｂｐ㊁５８７ｂｐꎬＡｌｔａ１长度分别为５１６ｂｐ㊁５１１ｂｐ㊁５１８ｂｐꎬＧＡＰＤＨ长度分别为５９５ｂｐ㊁５９５ｂｐ㊁５９６ｂｐ的目的片段ꎮ将３个菌株的目的片段序列在ＮＣＢＩ网站进行ＢＬＡＳＴ检索分析ꎬ结果显示供试菌株的目的片段与芸薹生链格孢菌株具有很高的序列相似性(９９.６３％~１００ ００％)ꎮ下载芸薹生链格孢及其他链格孢属成员的目的基因序列(表３)ꎬ按照首尾相连方法将上述序列拼接后进行分析ꎮ以番茄匍柄霉为外群ꎬ采用ＭＥＧＡ７.０软件中的最大似然法(Ｍａｘｉｍｕｍｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ)构建多基因系统发育树ꎬ以Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ进行１０００次重复检验ꎬ估算分支的自展支持率ꎬ分析供试菌株与其近缘种菌株的亲缘关系ꎬ确定其分类地位ꎮ如图４所示ꎬ本研究中获得的３个菌株与芸薹生链格孢的２个参考菌株紧密聚类在一起ꎬ自展支持率为１００％ꎮ综合致病性测定结果以及病原菌形态特征ꎬ结合多基因序列联合分析ꎬ最终确定分离得到的甘蓝黑斑病病原菌为芸薹生链格孢ꎮ２.５㊀病原菌对杀菌剂的敏感性采用菌丝生长抑制法测试８种杀菌剂对供试菌株ＨＢ１的毒力ꎮ结果显示ꎬ苯醚甲环唑㊁咯菌腈㊁己唑醇㊁氟硅唑㊁戊唑醇㊁丙环唑㊁异菌脲对供试菌株的抑制效果较好ꎬＥＣ５０分别为０ ０３７μｇ/ｍｌ㊁０ ０３９μｇ/ｍｌ㊁０ ０６４μｇ/ｍｌ㊁０ １３４μｇ/ｍｌ㊁０ １７５μｇ/ｍｌ㊁０ ２６３μｇ/ｍｌ㊁０ ６４１μｇ/ｍｌꎬ对供试菌株的抑制效果最弱的药剂为代森锰锌ꎬ其ＥＣ５０为２８０ １０１μｇ/ｍｌ(表４)ꎮ０５９江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期图２㊀分离获得的６个病原菌的形态学特征Ｆｉｇ.２㊀Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓｉｘｐａｔｈｏｇｅｎｓ图３㊀分离获得的甘蓝黑斑病病原菌的致病性Ｆｉｇ.３㊀Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｃａｕｓｉｎｇｃａｂｂａｇｅｂｌａｃｋｓｐｏｔ１５９刘志刚等:甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性表３㊀聚类分析所用的参考菌株及其目的基因和核糖体ＤＮＡ内转录间隔区(ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ)ＧｅｎＢａｎｋ登录号Ｔａｂｌｅ３㊀ＲｅｆｅｒｅｎｃｅｉｓｏｌａｔｅｓｕｓｅｄｉｎｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎｄｔｈｅｉｒｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓａｎｄｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒｏｆｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ(ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ)ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓ种名㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀菌株编号㊀㊀㊀目的基因和核糖体ＤＮＡ内转录间隔区(ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ)ＧｅｎＢａｎｋ登录号ｒＤＮＡ￣ＩＴＳＡｌｔａ１ＧＡＰＤＨＡｌｔｅｒｎａｒｉａａｇｅｒａｔｉＣＢＳ１１７２２１ＫＪ７１８０９８ＫＪ７１８６１８ＫＪ７１７９５３ＡｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａｔａＴＣＳ３００１ＭＮ３９４８７９ＭＮ４１０９１１ＭＮ４１０９１９Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ１００７￣１０￣２ＭＷ８９８６３１ＭＷ５４１７５７ＭＷ５４１６９８ＡｌｔｅｒｎａｒｉａａｒｇｙｒａｎｔｈｅｍｉＹＺＵ１７１０６７ＭＧ６４７６１８ＭＧ６４７６１６ＭＧ６７４１３９ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｂａｔａｔｉｃｏｌａＰＰＲＩ:１１９７２ＫＹ０９９６９０ＫＹ０９９６５２ＫＹ０９９６７１Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃａｅ４３３ＫＰ９９３５３３ＫＲ０５１３８４ＫＲ０５１３９２ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａＣＣＰＹ３ＭＧ２５０６０３ＭＧ２５０６３９ＭＧ２５０６１５Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ１０１/１ＭＮ１７３８２４ＭＮ１７５５０５ＭＮ１７５５１５ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｂｕｒｎｓｉｉＹＺＵ１９１００３ＭＮ６５６１３６ＭＮ６５６１４１ＭＮ７１８６６２ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｃａｒｏｔｉｉｎｃｕｌｔａｅＢＭＰ００６４ＥＵ１３６６４１ＥＵ１３９３２９ＥＵ１４１９８９ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｃａｒｔｈａｍｉＣＢＳ６３５.８０ＫＪ７１８１３１ＫＪ７１８６４９ＫＪ７１７９８１Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｃｈｅｉｒａｎｔｈｉ９０３/４ＭＷ４８７２２８ＭＷ４９６４２０ＭＷ４９６４２１ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｃｉｎｅｒａｒｉａｅＹＺＵ１７１９７１ＭＨ３５０３９５ＭＨ２８５９４６ＭＨ２８５９４８ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｃｒａｓｓａＣＢＳ１１６６４８ＫＪ７１８１５１ＫＪ７１８６６７ＫＪ７１７９９９ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｃｕｃｕｍｅｒｉｎａＣＢＳ１１７２２６ＫＪ７１８１５５ＫＪ７１８６７０ＫＪ７１８００２ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｄａｕｃｉＣＢＳ４７７.８３ＫＪ７１８１６１ＫＪ７１８６７６ＫＪ７１８００８ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｅｕｐｈｏｒｂｉｉｃｏｌａＣＢＳ１３３８７４ＫＪ７１８１７４ＫＪ７１８６８７ＫＪ７１８０１９Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｇａｉｓｅｎ０４０７￣５￣５ＭＷ８９８６３３ＭＷ５４１８１５ＭＷ５４１７００ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｇｏｓｓｙｐｉｎａＣＢＳ１０４.３２ＫＰ１２４４３０ＪＱ６４６３９５ＪＱ６４６３１２Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ２０７ＭＮ１７３８２６ＭＮ１７５５０７ＭＮ１７５５１７Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇｉｐｅｓ２０ＮＬ０２ＯＫ４２６３８８ＯＫ４６９３０４ＯＫ４６９３０２ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｍａｃｒｏｓｐｏｒａＣＢＳ１１７２２８ＫＣ５８４２０４ＫＪ７１８７０２ＫＣ５８４１２４ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｐａｎａｘＣＮＵ３１５９ＪＦ４１７５６０ＪＸ２１３２９６ＪＦ４１７６４１ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｐｏｒｒｉＣＮＵ１０３０１３ＪＦ３３１４５５ＪＦ３３１５４３ＪＦ３３１４８６ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｒａｄｉｃｉｎａＢＭＰ００４７ＥＵ１３６６６１ＥＵ１３９３４９ＥＵ１４２００９ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｓｅｓａｍｅＣＢＳ２４０.７３ＫＪ７１８２３１ＪＱ６４６４２７ＪＱ６４６３４３ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｓｏｌａｎｉＥｇｙ￣Ｐ１ＭＴ９９６２７６ＭＴ９９６２５５ＭＴ９９６２６２ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｓｔｅｖｉａｅＣＢＳ１１７３６２ＫＪ７１８２５２ＫＪ７１８７５８ＫＪ７１８０７９ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｔａｇｅｔｉｃａＣＢＳ４７９.８１ＫＣ５８４２２１ＫＪ７１８７６１ＫＣ５８４１４３Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ０５１７￣１８￣９ＭＷ８９８６２９ＭＷ５４１７５５ＭＷ５４１６９６ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｔｏｍａｔｉｃｏｌａＣＮＵ１３１０６１ＫＪ６５１２７０ＫＪ８６２２５８ＫＪ６５１２７３ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｔｏｍａｔｏＭＸ￣３ＭＫ２２６３０８ＭＫ２２６３１２ＭＫ２２６３１０ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｚｉｎｎｉａＣＢＳ１１８.４４ＫＪ７１８２６４ＫＪ７１８７７１ＪＱ６４６３６１ＳｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉＣＮＵ０７００６７ＪＦ４１７６８３ＪＸ２１３３１１ＪＦ４１７６９３２５９江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期图４㊀基于ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ㊁Ａｌｔａ１㊁ＧＡＰＤＨ的多序列联合聚类分析Ｆｉｇ.４㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄｏｎｒＤＮＡ￣ＩＴＳꎬＡｌｔａ１ꎬＧＡＰＤＨ表４㊀不同化学药剂对芸薹生链格孢的抑制效果Ｔａｂｌｅ４㊀ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｏｎＡｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ杀菌剂名称㊀毒力回归方程㊀㊀有效抑制中质量浓度(μｇ/ｍｌ)杀菌剂质量浓度的９５％置信区间(μｇ/ｍｌ)相关系数(ｒ)苯醚甲环唑Ｙ＝０.４９１ｘ＋０.７０６０.０３７０.００３~０.０８１０.８４０咯菌腈Ｙ＝０.７２６ｘ＋１.０２００.０３９０.０１２~０.０７１０.９５６己唑醇Ｙ＝０.９００ｘ＋１.０７５０.０６４０.０３３~０.０９５０.９８８氟硅唑Ｙ＝１.１３２ｘ＋０.９８７０.１３４０.０９８~０.１７２０.９６２戊唑醇Ｙ＝０.７６１ｘ＋０.５７６０.１７５０.１１３~０.２４６０.９８９丙环唑Ｙ＝０.８４０ｘ＋０.４８７０.２６３０.１９１~０.３６７０.９６８异菌脲Ｙ＝０.９３６ｘ＋０.１８１０.６４１０.４８５~０.８８４０.９２４代森锰锌Ｙ＝０.６８８ｘ－１.６８３２８０.１０１１５７.５９９~９３７.８０００.９９２３５９刘志刚等:甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性３㊀讨论链格孢属真菌种类多且分类复杂[１４￣１７]ꎬ目前已有记录的就有３００多种[７]ꎬ随着高通量测序技术的快速发展ꎬ越来越多的真菌基因组相继被报道ꎬ这也为多序列联合分析提供了极大便利ꎮ基于１６８个链格孢属真菌菌株的Ａｌｔａ１㊁ＧＡＰＤＨ㊁内聚半乳糖醛酸酶基因(ｅｎｄｏＰＧ)㊁ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ㊁翻译延伸因子１￣ａｌｐｈａ基因(ＴＥＦ１)㊁ＲＮＡ聚合酶ＩＩ亚基基因(ＲＰＢ２)和一个匿名基因区域ＯＰＡ１０￣２的序列ꎬＷｏｕｄｅｎｂｅｒｇ等[１８]构建了链格孢属真菌系统发育树ꎮ在其他植物黑斑病的病原菌鉴定方面ꎬ研究人员在ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ的基础上ꎬ联用Ａｌｔａ１㊁三磷酸腺苷酶基因(ＡＴ￣Ｐａｓｅ)㊁钙调蛋白基因(ＣＡＬ)㊁ＧＡＰＤＨ㊁ＲＰＢ２㊁ＴＥＦ１中的部分基因ꎬ明确了大麻黑斑病[１９]㊁香蕉黑斑病[２０]㊁甜瓜黑斑病[２１]的病原菌ꎮ本研究通过ｒＤ￣ＮＡ￣ＩＴＳ㊁Ａｌｔａ１㊁ＧＡＰＤＨ序列联合分析发现ꎬ致病菌株ＨＢ１㊁ＨＢ３㊁ＨＢ６与２个芸薹生链格孢参考菌株紧密聚在一起ꎬ综合致病性测定结果以及病原菌形态特征ꎬ确定从甘蓝病叶中分离到的黑斑病病原菌为芸薹生链格孢ꎮ鉴于引起十字花科黑斑病的链格孢属真菌的种群组成复杂[２２]ꎬ后续将进一步对江苏省其他地区的甘蓝黑斑病病样进行病原菌分离鉴定ꎬ借以探明江苏省甘蓝黑斑病的致病菌组成ꎮ如何有效防治链格孢属真菌引起的黑斑病是当前蔬菜生产上面临的难题ꎬ目前十字花科芸薹属栽培种中缺乏高抗黑斑病的材料ꎬ只在亚麻荠(Ｃａｍ￣ｅｌｉｎａｓａｔｉｖａ)㊁荠菜(Ｃａｐｓｅｌｌａｂｕｒｓａ￣ｐａｓｔｏｒｉｓ)等其他十字花科植物中发现了一些抗性较好的种质资源[２３]ꎮ化学防治仍然是目前十字花科作物黑斑病防控的重要手段ꎮ本研究结果表明ꎬ苯醚甲环唑㊁咯菌腈㊁己唑醇㊁氟硅唑㊁戊唑醇㊁丙环唑㊁异菌脲对甘蓝黑斑病病原菌的抑制作用较强ꎮ前人研究结果表明ꎬ丙环唑㊁苯醚甲环唑㊁己唑醇对引起秋葵黑斑病的链格孢具有较好的抑制效果[２４]ꎻ咪鲜胺㊁异菌脲㊁戊唑醇对引起核桃黑斑病的链格孢有较好抑制作用[２５]ꎻ戊唑醇和苯醚甲环唑这两种三唑类药剂对白菜黑斑病的芸薹链格孢的抑制效果较好[２６]ꎻ苯醚甲环唑对三七黑斑病病原菌(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｐａｎａｘ)的菌丝生长抑制效果明显[２７]ꎻ丙环唑对导致芥菜黑斑病的芸薹链格孢的抑制效果较好[２８]ꎻ咯菌腈和异菌脲对引起月季黑斑病的链格孢的抑制作用较强[２９]ꎮ从以上研究结果可以看出ꎬ在测试的化学药剂中ꎬ苯醚甲环唑和戊唑醇为代表的三唑类㊁咯菌腈为代表的苯基吡咯类㊁异菌脲为代表的二甲酰亚胺类杀菌剂对黑斑病病原菌的菌丝生长抑制效果总体较好ꎮ但也有报道ꎬ异菌脲对三七黑斑病病原菌的菌丝生长抑制效果较差[２７]ꎻ戊唑醇和异菌脲对引起芍药黑斑病的链格孢的抑制作用较差[３０]ꎮ因此ꎬ针对链格孢属真菌引起的不同植物的黑斑病ꎬ需要筛选和匹配合适的杀菌剂ꎬ才能达到较好防治效果ꎮ由于本研究筛选的药剂主要来自室内毒力测定试验结果ꎬ后续需要室外试验来进一步检验ꎮ参考文献:[１]㊀辛竹琳ꎬ崔彦娟ꎬ杨小薇ꎬ等.全球蔬菜产业现状及中国蔬菜育种发展路径研究进展[Ｊ].分子植物育种ꎬ２０２２ꎬ２０(９):３１２２￣３１３２.[２]㊀陈永生ꎬ崔志超ꎬ杨雅婷ꎬ等.关于甘蓝类蔬菜种植模式规范化的建议[Ｊ].长江蔬菜ꎬ２０２１(８):２０￣２１.[３]㊀ＳＡＨＡＲＡＮＧＳꎬＭＥＨＴＡＮꎬＭＥＥＮＡＰＤꎬｅｔａｌ.Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｄｉｓｅａ￣ｓｅｓｏｆｃｒｕｃｉｆｅｒｓ:Ｂｉｏｌｏｇｙꎬｅｃｏｌｏｇｙａｎｄｄｉｓｅａｓｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔ[Ｍ].Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ:Ｓｐｒｉｎｇｅｒꎬ２０１６.[４]㊀ＤＨＡＲＭＥＮＤＲＡＫꎬＮＥＥＬＡＭＭꎬＹＡＳＨＷＡＮＴＫＢꎬｅｔａｌ.Ａｌｔｅｒｎａ￣ｒｉａｂｌｉｇｈｔｏｆｏｉｌｓｅｅｄＢｒａｓｓｉｃａｓ:Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].Ａｆｒｉ￣ｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１４ꎬ８(３０):２８１６￣２８２９. [５]㊀ＭＵＫＥＳＨＭꎬＳＷＡＲＮＭＡＬＡＳ.Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｈｏｓｔ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ(ＨＳＴｓ)ｔｏｘｉｎｓ:Ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎꎬｔａｒｇｅｔｓｉｔｅｓꎬｒｅｇｕ￣ｌａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｉｒｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｓ[Ｊ].ＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１９ꎬ６:７４５￣７５８.[６]㊀ＳＯＬＦＲＩＺＺＯＭ.ＲｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｏｎＡｌｔｅｒｎａｒｉａｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ[Ｊ].Ｃｕｒ￣ｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１７ꎬ１７:５７￣６１.[７]㊀ＳＩＭＭＯＮＳＥＧ.Ａｌｔｅｒｎａｒｉａꎬａｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍａｎｕａｌ[Ｍ].Ｗａｓｈ￣ｉｎｇｔｏｎ:ＡＳＭＰｒｅｓｓꎬ２００７.[８]㊀王㊀超ꎬ张晓烜ꎬ王宁宁.甘蓝黑斑病病原菌鉴定[Ｃ]//中国园艺学会.中国园艺学会十字花科蔬菜分会第十届学术研讨会论文集.天津:中国园艺学会ꎬ２０１２:１６６￣１７０. [９]㊀方中达.植病研究方法[Ｍ].北京:中国农业出版社ꎬ１９９８. [１０]ＣＥＮＩＳＪＬ.ＲａｐｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｆｕｎｇａｌＤＮＡｆｏｒＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ１９９２ꎬ２０(９):２３８０.[１１]ＷＨＩＴＥＴＪꎬＢＲＵＮＳＴꎬＬＥＥＳꎬｅｔａｌ.Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｄｉｒｅｃｔｓｅ￣ｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｆｕｎｇａｌｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡｇｅｎｅｓｆｏｒｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ[Ｊ].ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ:ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓꎬ１９９０ꎬ１８(１):３１５￣３２２.[１２]ＨＯＮＧＳＧꎬＣＲＡＭＥＲＲＡꎬＬＡＷＲＥＮＣＥＣＢꎬｅｔａｌ.Ａｌｔａ１ａｌｌｅｒ￣ｇｅｎｈｏｍｏｌｏｇｓｆｒｏｍＡｌｔｅｒｎａｒｉａａｎｄｒｅｌａｔｅｄｔａｘａ:ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｈｙｌｏｇｅ￣ｎｅｔｉｃｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ[Ｊ].ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ２００５ꎬ４２(２):１１９￣１２９.[１３]ＢＥＲＢＥＥＭＬꎬＰＩＲＳＥＹＥＤＩＭꎬＨＵＢＢＡＲＤＳ.Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓｐｈｙｌｏ￣４５９江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期ｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｔｈｅｏｒｉｇｉｎｏｆｋｎｏｗｎꎬｈｉｇｈｌｙｖｉｒｕｌｅｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓꎬｉｎｆｅｒｒｅｄｆｒｏｍＩＴＳａｎｄｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ￣３￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｇｅｎｅｓｅ￣ｑｕｅｎｃｅｓ[Ｊ].Ｍｙｃｏｌｏｇｉａꎬ１９９９ꎬ９１(６):９６４￣９７７.[１４]蔡永占ꎬ白㊀涛ꎬ刘冬梅ꎬ等.烟草赤星病高效生防内生细菌的分离筛选及发酵培养条件优化[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０２２ꎬ５０(１３):１２９￣１３５.[１５]朱㊀杰ꎬ程㊀亮ꎬ张㊀纲ꎬ等.樱桃叶斑病生防菌株萎缩芽孢杆菌菌株ＱＨ￣５８８的筛选鉴定[Ｊ].南方农业学报ꎬ２０２１ꎬ５２(１１):３０２２￣３０３３.[１６]娄喜艳ꎬ郭洋洋ꎬ裴冬丽.河南商丘月季黑斑病病原菌鉴定及生物学特性[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０２１ꎬ４９(１９):１３８￣１４３. [１７]何㊀洁ꎬ梁㊀霜ꎬ张国俊ꎬ等.太子参叶斑病病原鉴定及室内药剂筛选[Ｊ].南方农业学报ꎬ２０２１ꎬ５２(８):２１２４￣２１３２. [１８]ＷＯＵＤＥＮＢＥＲＧＪＨＣꎬＳＥＩＤＬＭＦꎬＧＥＯＥＮＥＷＡＬＤＪＺꎬｅｔａｌ.ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｓｅｃｔｉｏｎＡｌｔｅｒｎａｒｉａ:Ｓｐｅｃｉｅｓꎬｆｏｒｍａｅｓｐｅｃｉａｌｅｓｏｒｐａｔｈｏ￣ｔｙｐｅｓ?[Ｊ].ＳｔｕｄｉｅｓｉｎＭｙｃｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ８２:１￣２１.[１９]ＣＨＥＮＧＨꎬＺＨＡＯＬꎬＷＥＩＸꎬｅｔａｌ.Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｐｅｃｉｅｓｃａｕｓｉｎｇｌｅａｆｓｐｏｔｏｎｈｅｍｐ(Ｃａｎｎａｂｉｓｓａｔｉｖａ)ｉｎＮｏｒｔｈｅｒｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２０２２ꎬ１６２:９５７￣９７０.[２０]ＷＡＮＧＢꎬＺＨＡＮＧＹＹꎬＬＩＵＪＰꎬｅｔａｌ.ＡｎｅｗｌｅａｆｂｌｉｇｈｔｄｉｓｅａｓｅｃａｕｓｅｄｂｙＡｌｔｅｒｎａｒｉａｊａｃｉｎｔｈｉｃｏｌａｏｎｂａｎａｎａｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].Ｈｏｒｔｉｃｕｌ￣ｔｕｒａｅꎬ２０２１ꎬ８(１):１２.[２１]施兆荣ꎬ张广荣ꎬ孙述俊ꎬ等.甘肃省甜瓜黑斑病菌(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ)的分离鉴定[Ｊ].园艺学报ꎬ２０２２ꎬ４９(２):４２７￣４３６.[２２]刘焕然ꎬ柯桂兰.十字花科蔬菜黑斑病原种群组成及季节变化[Ｊ].西北农业学报ꎬ１９９２ꎬ１(４):６￣１０.[２３]沈钰森ꎬ王建升ꎬ盛小光ꎬ等.十字花科植物黑斑病的研究进展[Ｊ].核农学报ꎬ２０２１ꎬ３５(３):６２３￣６３４.[２４]ＰＨＡＰＡＬＥＡＤꎬＳＯＬＡＮＫＹＫＵꎬＴＡＹＡＤＥＳＣꎬｅｔａｌ.Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓａｇａｉｎｓｔｏｋｒａｌｅａｆｓｐｏｔｕｎｄｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙｃｏｎｄｉｔｉｏｎ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ２０１０ꎬ３(２):２８２￣２８４. [２５]刘㊀霞ꎬ杨克强ꎬ姜兴印ꎬ等.危害核桃的链格孢(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌ￣ｔｅｒｎａｔａ)对４种杀菌剂的敏感性[Ｊ].农药ꎬ２０１３ꎬ５２(１):６７￣７０ꎬ７７.[２６]李亚婷ꎬ孙彤彤ꎬ罗㊀强ꎬ等.４种杀菌剂防治白菜黑斑病的毒力测定研究[Ｊ].河北农业大学学报ꎬ２０１８ꎬ４１(４):９６￣１００. [２７]包媛媛ꎬ赵娟秀ꎬ杨加艳ꎬ等.不同杀菌剂对三七黑斑病菌的毒力测定[Ｊ].中国农学通报ꎬ２０１８ꎬ３４(２):７４￣７８.[２８]ＪＡＣＫＳＯＮꎬＫＡＢＥＡＢＡＭꎬＫＵＭＡＲꎬｅｔａｌ.ＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆＡｌｔｅｒｎａｒｉａｌｅａｆｓｐｏｔｏｆｍｕｓｔａｒｄｔｈｒｏｕｇｈｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｇｅｎｔｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ２０(３):１６２￣１７８.[２９]冯宝珍ꎬ李培谦.月季黑斑病病原菌鉴定及室内药剂初步筛选[Ｊ].植物保护学报ꎬ２０１９ꎬ４６(５):１１４７￣１１５４.[３０]陶㊀航ꎬ扎依娜 玛合巴提ꎬ张㊀烨ꎬ等.芍药黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂敏感性分析[Ｊ].园艺学报ꎬ２０２１ꎬ４８(１):１７３￣１８２.(责任编辑:成纾寒)５５９刘志刚等:甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性。
链格孢属一新种——沙棘链格孢
链格孢属一新种——沙棘链格孢沈瑞清;商鸿生;查仙芳【摘要】【Objective】The study was to find a new species of Alternaria,which was helpful for the study of biodiversity and plant disease control.【Method】The sample was collected,isolated and identified,and compared with other species of Alternaria which were found before.【Result】This fungus can be distinguished from its closely related species by having dark brown,long club or down-column conidia body.【Conclusion】This new fungus can be determined as a new species,and the specimen has been deposited in Herbarium of Phytopathological Section,Ningxia Academy of Agriculture Forestry Sciences（PSNXAAFS 19785）.%【目的】发现链格孢属新种资源,以丰富生物多样性研究,为植物病害的防治提供依据。
【方法】采用实地考察、分离培养和鉴定的方法,与我国和世界已经发现的链格孢属的种特征进行了比较分析。
【结果】得到的链格孢属新种沙棘链格孢不同于已发现链格孢属种之处主要在于,其孢子深褐色,长倒棒形,一些孢子近圆柱形,只在孢身与喙处才收缩。
【结论】沙棘链格孢与已报道的种在孢子颜色、形状等方面均不同,是一链格孢属新种。
链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸的研究进展
链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸的研究进展吴春生;马良;江涛;蒋黎艳;戴芳芳;张宇昊【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2014(035)019【摘要】链格孢霉(Alternaria)是污染食品和饲料最普遍的真菌之一.细交链格孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)是链格孢霉毒素中最为重要的一种,可广泛污染蔬菜、水果及谷物.本文综述TeA毒素的来源及污染情况、理化性质及其毒性、检测方法等,并就未来研究方向进行展望.【总页数】7页(P295-301)【作者】吴春生;马良;江涛;蒋黎艳;戴芳芳;张宇昊【作者单位】西南大学食品科学学院,重庆400715;西南大学食品科学学院,重庆400715;农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(重庆),重庆400715;重庆市特色食品工程技术研究中心,重庆400715;西南大学食品科学学院,重庆400715;西南大学食品科学学院,重庆400715;西南大学食品科学学院,重庆400715;西南大学食品科学学院,重庆400715;农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(重庆),重庆400715;重庆市特色食品工程技术研究中心,重庆400715【正文语种】中文【中图分类】R155.3【相关文献】1.狭卵链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸诱导稗草叶片氧化胁迫和抗氧化酶变化的研究[J], 姜述君;于涵;张国庆;范文艳;马凤鸣2.狭卵链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸诱导稗草叶片氧化胁迫和抗氧化酶变化的研究[J], 姜述君;刘朝;于涵;张国庆;范文艳3.链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸对空心莲子草叶片生理生化特性的影响 [J], 周兵;闫小红;郭年梅;蒋平;钟娟;强胜4.链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸对空心莲子草的致病性 [J], 周兵;闫小红;钟娟;蒋平;强胜5.链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸在土壤中的降解研究 [J], 周兵;强胜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
链格孢属真菌分类研究进展唐岚;江厚利;王义勋;陈京元;郑京津【摘要】本文综述了链格孢属分类地位及特征,链格孢菌种间培养性状,介绍了链格孢菌属真菌在形态学、数值分类学和分子生物学方面的分类研究进展,对链格孢属真菌系统发育的认知和相应的应用开发提供科学的理论基础.【期刊名称】《湖北林业科技》【年(卷),期】2013(042)004【总页数】4页(P47-49,83)【关键词】链格孢菌;形态分类;数值分类;分子生物学分类【作者】唐岚;江厚利;王义勋;陈京元;郑京津【作者单位】湖北省林业科学研究院武汉430075;湖北省林业科学研究院武汉430075;湖北省林业科学研究院武汉430075;湖北省林业科学研究院武汉430075;湖北省林业科学研究院武汉430075【正文语种】中文【中图分类】Q939.5链格孢菌Alternaria是一种常见半只菌类真菌，分布广泛，能够危害农林作物并造成经济损失，有些链格孢菌甚至能够侵染人体和动物。
该属形态特征鲜明，易于辨认，但种间变异性大，种级分类鉴定存在一定困难。
链格孢菌虽然能够危害农林作物甚至威胁人、畜健康，但也可作为被利用的真菌资源，如长柄链格孢A.longies可控制烟草赤星病，防效高达90%以上；百日草链格孢菌A.zinniae毒素可防除加拿大一支黄花［1，2］。
随着分子生物学技术的飞速发展，链格孢菌分类从传统形态特征分类深入到分子生物学系统发育分类。
本文对链格孢菌属真菌在形态学、数值分类学以及分子生物学方面的分类研究进展进行综述。
1 链格孢属分类地位及特征链格孢属是以细链格孢A.tenuissima为模式种建立起来的真菌属。
截止目前，全世界已经发表的链格孢菌种约500个，且仍不断有新种发表［3］。
分生孢子梗颜色深，简单或有分支，直或弯曲，单生或簇生，基部有时膨大，呈褐色；产孢细胞以内壁芽生孔生式产孢，孢痕清晰，边缘色深，中间色浅。
分生孢子卵形、倒棒状、倒梨形、卵圆形或椭圆形，脐部明显，淡褐至深褐色，砖格状，表面光滑或具疣、刺，或具有横隔及纵、斜的真隔膜，分隔处不缢缩或缢缩。
多数情况下，孢身至顶端渐窄，顶端无喙或具喙，喙分隔或不分隔，色泽较孢身淡。
喙有时变为次生分生孢子梗（假喙），产生次生分生孢子，形成短的或长的、不分支的或分支的孢子链［4，5］。
2 链格孢菌种间培养性状的分类研究分生孢子的形状、大小、颜色、分隔状况、孢子表面的纹饰，分生孢子着生方式，喙的有无等培养性状为种间分类的主要依据；菌丝和菌落形态特征、分生孢子梗形态、寄主范围等特征为种间分类的次要依据。
张敬泽等［6］对PCA上所培养的A.alternata，A.brassicae，A.brassicicola 等15个菌系的性状观察，发现菌落直径、孢子宽、孢子纵格数、喙长、链分支数和分链长等性状存在显著种间差异。
链格孢菌分生孢子具有多型现象，幅度变化大；培养基质、温度和光照等培养条件对其形态也存在影响，并且不同菌系在相同人工培养条件下具有趋同性。
这给传统形态分类鉴定带来很大困难，尤其对小孢子种的鉴定更加困难［4，7］。
因此，研究者尽量选用自然基质（标本）上的分生孢子制片，或采用PCA、V－8汁琼脂或自来水琼脂－麦秆培养基在光、暗交替等近自然条件培养进行形态分类鉴定［3］。
Masangkay 等［8］对 A.alternata f.sp.sphenocleae的孢子形成特性进行研究，发现1/2PDA、V－8汁琼脂基质对不同的光照有明显影响；在28℃和V－8汁琼脂培养，连续近紫外光照射下产孢量有明显提高，黑暗条件下产孢量显著降低；以20g·L－1的碳酸钙和2mL无菌水含量对产孢量为最佳。
张敬泽等［9］对适合于A.solani分类的培养条件进行研究，结果表明：在日光灯和近紫外线下诱发产孢效能和产孢量最好，分生孢子形态特征接近自然寄主。
总之，链格孢菌传统培养的形态特征具有可塑性和可变性，难以找到相对稳定性状，有必要探求更加简捷、快速、有效的其他分类方法，从多方面、深层次上加以改进。
3 数值分类法在链格孢菌分类中的应用数值分类法是根据尽可能多的性状、状态信息，借助于数学方法和计算机技术进行比较分析，具有客观性、明确性和可重复性。
李多川等［10］对链格孢属Alternaria、细基格孢属Ulocladium和匐柄霉属Stemphylium的40个分离系在PCA上培养，按照独立性、稳定性和同源性的标准确定出22个分类性状，然后计算出运算分类单位间的距离矩阵，用类平均法进行聚类分析，结果明显分为3个表观群，A表观群属于匐柄属，B表观群为细基格孢属，C表观群为链格孢属。
同时，C表观群被区分为假喙组、无喙组、真喙组和锥形真喙组4个亚表观群，这与依据分生孢子喙部特征划分的组相吻合。
4 分子生物学技术在链格孢菌分类上的应用4.1 同工酶和可溶性蛋白质凝胶电泳技术同工酶和蛋白质具有保守性，能够反映出生物系统发育。
可溶性蛋白及同工酶的酶谱差异间接表现了生物基因的不同，可为分类鉴定提供依据。
陈伟群等［11，12］对 A.brassicae，A.brassicicola，A.tenuissima的21个菌株的可溶性蛋白质和同工酶分析，结果表明：在较高的相似水平上明确区分A.brassicae，A.brassicicola，A.tenuissima，且每一类群所包括的菌株与其形态学鉴定结果完全一致。
董金皋等［13］对链格孢不同种和芸苔链格孢A.brassicae10个菌株的酯酶同工酶分析，发现链格孢菌种间酯酶同工酶比种内菌株间大。
此外Petrunak等［14］对 A.solani和A.alternata 的同工酶分析，结果表明：A.alternata中存在23个酶谱类型，A.solani中有12个酶谱类型。
以上实验表明同工酶和蛋白质凝胶电泳技术适合于链格孢菌种间分类鉴定。
4.2 核糖体DNA（rDNA）序列分析真菌核糖体基因及间隔区有不同的进化速率，一般编码区序列比较保守，而内部转录间隔区（ITS）序列进化较快，在同一个属内不同种间变异较大，因此根据真菌核糖体序列信息所表现出基因型差异可将真菌菌株鉴定到属、种、亚种、变种［15］。
Kusada等［16］对24个链格孢菌株的ITS1和ITS2序列分析，形态差异明显的种，其序列差异也大，而7个链格孢小孢子种ITS序列和非致病菌A.alternata没有明显差别。
Jasalavich等［17］对A.brassicae、A.brassicicola、A.raphani、A.alternata和Pleospora herbarum 的18S rRNA，5.8S rRNA和ITS1，ITS2序列分析，发现链格孢菌5.8S rRNA 序列完全相同，与 P.herbarum 仅一个碱基差异；而ITS1在碱基组成和长度上存在差异，18S rRNA 序列高度保守。
王洪凯等［5］对A.mali、A.abutilonis、pacta、A.pomicola、A.alternata、A.tenuissima、A.longipes、A.citri、A.gaisen和A.leucanthemi、A.solani、A.sesamicola共20个链格孢菌株5.8SrRNA、ITS1、ITS2序列分析，结果表明形态差异大的链格孢种的5.8S rDNA及ITS1、ITS2序列存在较大差异；大孢子种间及大孢子与小孢子间，形态差异明显，9个小孢子种间差异小而其所选的区段序列难以区分。
上述结果表明rDNA序列分析可以作为研究链格孢分类鉴定的一种有效辅助手段。
4.3 限制性片段长度多态性（RFLP）分析限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）分析是根据生物体基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基突变，或酶切位点碱基插入、缺失，导致酶切片段大小不同，得到不同的酶切图谱，表现出RFLP的特征。
该技术不需要标记、灵敏度高、成本低、可重复性强及不受环境影响等特点被广泛应用。
Kusaba等［18］以梨链格孢rDNA探针对链格孢菌11个种99个分离系进行RFLP分析，结果显示了丰富的多态性，可以将供试菌株分为17个不同的组；形态学上相差较大的A.alternaria、和A.solani等6个种被明确区分。
Adachi等［19］以rDNA为探针对日本梨链格孢A.gaisen进行了RFLP分析，将其分为至少8个变异群体，并与地理分布有很大相关性。
4.4 随机扩增多态性DNA（RAPD）分析随机扩增多态性 DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）技术可以无需模板DNA序列信息扩增出足够多态性谱带，所需DNA量小且质量要求不高，敏感性高，操作简便迅速及费用低等优点［20－21］。
Tiffany等［22］采用5个随机引物对 A.solani和A.alternaria共65个菌株进行RAPD分析，可以被明确区分两个种且种内和种间都存在丰富多态性。
Sharma等［23］用5个随机引物对链格孢菌3个种29个菌株进行RAPD分析，可以明确区分这3个种。
王洪凯等［24］对链格孢菌13个小孢子种和3个大孢子种共55个分离系进行RDPA分析，大孢子种A.solani和A.porri及形态独特的A.leucanthemi被明确区分开来；所有供试小孢子种被聚在一起。
刘开启等［25］对杏果实黑斑病菌及近似链格孢种的28个菌株进行RAPD分析，结果表明9个杏果实黑斑病菌菌株亲缘关系极为相近且独立于其它供试种群的遗传群体。
5 展望链格孢属真菌具有广泛的分布和丰富多样性，因此，系统学分类研究越来越受到真菌分类学者的青睐，但是研究还不够深入，还需要大量工作去探索，不断补充和完善。
随着研究的深入，链格孢属真菌系统发育必将被人们所认知，并可为相应的应用开发提供科学的理论基础。
参考文献【相关文献】［1］董汉松.植物诱导抗病性原理和研究［M］.北京：科学出版社，1995：1－456.［2］李荣金，强胜.百日草链格孢菌毒素对加拿大一枝黄花叶片伤害的生理生化研究［J］.西北植物学报，2006，26（5）：995－1000.［3］张天宇.中国真菌志（第十六卷）链格孢属［M］.北京：科学出版社，2003：27－31.［4］许志刚.普通植物病理学（第二版）［M］.北京：中国农业出版社，1997：97.［5］王洪凯，张天宇，张猛.应用5.8rRNA及ITS区序列分析链格孢种级分类［J］.菌物系统，2001，20（2）：168－173.［6］张敬泽，张天宇，王瑾.链格孢属种间培养性状的分类研究［J］.浙江农业大学学报，1997，23（5）：511－514.［7］沈瑞清，张天宇.培养基对链格孢属（Alternaria Nees）真菌种级形态分类特征影响的研究［J］.宁夏农学院学报，2003，24（3）：1－5.［8］Rhomela F.Masangkay et al.Characterization of Sporulation of Alternaria alternataf.sp.Sphenocleae［J］.Biocontrol Science and Technology，2000，10（4）：385－397. ［9］张敬泽，张天宇.适合Alternaria solani的分类培养条件研究［J］.浙江大学学报（农业与生命科学版），2000，26（1）：67－68.［10］李多川，张天宇，吴竞爽.链格孢（丝孢纲）数值分类研究初探［J］.真菌学报，1993，12（3）：232－239.［11］陈伟群，张天宇.十字花科上的链格孢属真菌同工酶凝胶电泳分析［J］.真菌学报，1994，13（4）：295－302.［12］陈伟群，张天宇.十字花科植物上链格孢菌可溶性蛋白凝胶电泳分析［J］.西北农业大学学报，1993，2（4）：53－58.［13］董金皋，樊慕贞，杨英茹等.芸苔链格孢菌种内和链格胞菌种间的同工酶比较［J］.植物病理学报，1997，27（2）：167－173.［14］Petrunak D D M，Christ B J.Isozyme variabahty in Alternariaalternata.Phytopathology，1992，82：1343－1347.［15］高强，吴品珊，戴良英等.分子生物学技术在腥黑粉种间分类鉴定上的应用［J］.植物检疫，2004，18（6）：355－359.［16］Kusaba M，Tsuge T.Nuclear ribosomal DNA variation and pathogenic specializationin Alternaria fungi known to produce host－specific toxins［J］.Applied and Environmental Microbiology，1994，60：3055－3062.［17］Jasalavich parison of nuclear ribosomal DNA sequences from Alternaria species pathogenic to crucifers［J］.Mycologia Research，1995，99（5）：604－614. ［18］Kusaba M，Tsuge T.Coinfection by fiffent isolates of Alternaria alternata in single blank spot lesions of Japanese pear leaves［J］.Phytophthology，1994，84（5）：447－451.［19］Adachi Y H et al.Nuclear ribosomal DNA as a probe forgenetic variability in the Japanese pear pathotype Alternaria alternata. Appl.Environm. Microbiol，1993，59：3197－3205.［20］曾大兴，戚佩坤，姜子德.弯孢类炭疽菌菌株的RAPD分析及分类研究［J］.菌物学报，2004，23（2）：188－191.［21］Jose A，Andrew P H，Richard P O.The use of RAPD markers in thegenetic analysisof the plant pathogenic fungus Cladosporium fulvum［J］.Current Genetics，1994，25：438－444.［22］Tiffany L W，David R H，Barbara J C，et al.RAPD－PCR analysis ofgenetic of Alternaria solani and Alternaria alternata from potato and tomato［J］.Mycologia，1998，90（5）：813－821.［23］Sharma T R，Tewari J P.RAPD Analysis of three Alternaria species pathogentic to Crucifers［J］.Mycologia Research，1998，102（7）：807－814.［24］王洪凯，张天宇.链格孢属小孢子种的RAPD分析［J］.菌物系统，2003，22（1）：35－41.［25］刘开启，杨炜华，郭泺.杏果实黑斑病菌及近似链格孢种的RAPD分析［J］.仲凯农业技术学院学报，2004，17（1）：1－6.。