肿瘤药物敏感实验
体外肿瘤药敏试验方法研究进展
体外肿瘤药敏试验方法研究进展甘萍治疗肿瘤的方法主要有3种，包括肿瘤化疗、放疗、手术。
其中肿瘤化疗在消灭微小肿瘤转移灶和手术切除后的残留肿瘤细胞治疗中有着手术与放疗无法达到的显著优势，但肿瘤化疗中仍有许多问题：①肿瘤病人个体间对化疗药物敏感性差异大；②肿瘤对化疗药物有耐药性；③化疗药物对许多类型的肿瘤特别是实体瘤的有效率不高；④化疗药物的选择性差，毒性大，杀伤癌细胞的同时也杀伤正常细胞，给病人机体造成较大的损害。
对于上述出现各种问题在临床上经验的化疗用药是无法保证肿瘤患者的个体有效性，因此个体化化疗在临床肿瘤化疗中就显得尤为重要。
目前公认的较好的方法就是做肿瘤化疗药物敏感性试验(简称肿瘤药敏)，该方法的特点是直接从患者体内获取新鲜的肿瘤组织进行首次培养，由于肿瘤细胞刚刚离体，生物学性状尚未发生大的变化，能较真实地反映整个肿瘤细胞群体的特性及不同供体的个体差异，能够比较确切地代表体内状态，为不同的病人准确筛选敏感的化疗药物,并确定其剂量，真正实现临床的个体化用药，以提高化疗的靶向性，减少化疗药物的不良反应，降低细胞耐药性，成为肿瘤治疗中迫切需要解决的问题。
目前，预测肿瘤药敏的方法已发展为体内和体外两大系列20多种药敏试验，并不断地朝着简单、快速、敏感、筛选作用方式不同的药物与临床有良好的相关性的方向迈进。
而本文针对体外肿瘤药敏试验方法进行综述。
1 人体肿瘤细胞集落测定(HTCA)它是利用肿瘤细胞悬液，置于双层琼脂中培养，通过选择性加入化疗药物培养后，计数细胞繁殖形成的集落数目，再评估肿瘤细胞对该药的敏感性。
该法的优点：敏感、直接评价细胞增殖死亡。
缺点：用于临床标本检测率低、周期长、集落计数繁琐。
2 放射性标记代谢物前体掺入法(3H-Tdr assay)该法利用氚标记的胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶作为核酸代谢物前体，测定一定时间内放射性标记的代谢物前体掺入的多少来判断药物对细胞增殖活性的抑制作用。
该法的优点：操作简便、所需时间短、灵敏度高、重复性好，临床相关性与集落形成法相近，可适用于绝大多数恶性肿瘤。
细胞药物敏感实验报告
一、实验背景随着现代医学的不断发展，肿瘤已成为全球范围内主要的死亡原因之一。
肿瘤的治疗方法主要包括手术、放疗和化疗等。
其中，化疗作为治疗肿瘤的重要手段，其效果的好坏直接影响到患者的生存率和生活质量。
因此，如何筛选出对肿瘤细胞具有高敏感性的化疗药物，对于提高肿瘤治疗效果具有重要意义。
细胞药物敏感实验是一种评估肿瘤细胞对化疗药物敏感性的体外实验方法，可以为临床治疗提供依据。
二、实验目的本实验旨在通过细胞药物敏感实验，评估不同化疗药物对人癌细胞系A549的敏感性，为临床治疗提供参考。
三、实验材料1. 人癌细胞系A5492. 5-氟尿嘧啶（5-FU）、紫杉醇（PTX）、顺铂（DDP）、多西他赛（DTX）等化疗药物3. DMEM培养基、胎牛血清4. 细胞培养箱、显微镜、酶标仪等实验仪器5. 微量移液器、培养皿、细胞计数板等实验用品四、实验方法1. 细胞培养：将人癌细胞系A549接种于培养皿中，置于细胞培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期后，用于实验。
2. 细胞计数：采用细胞计数板法对细胞进行计数，以确定细胞浓度。
3. 实验分组：将细胞分为5组，分别加入不同浓度的化疗药物（5-FU、PTX、DDP、DTX）和阴性对照组。
4. 治疗时间：将细胞与药物共培养24小时。
5. 细胞活力检测：采用MTT法检测细胞活力，计算药物抑制率。
五、实验结果1. 不同化疗药物对人癌细胞系A549的抑制作用实验结果显示，5-FU、PTX、DDP、DTX等化疗药物对人癌细胞系A549均具有明显的抑制作用，且抑制作用随着药物浓度的增加而增强。
2. 不同化疗药物的半数抑制浓度（IC50）根据MTT法检测结果，计算不同化疗药物的半数抑制浓度（IC50），结果如下：- 5-FU：20.0 µM- PTX：30.0 µM- DDP：40.0 µM- DTX：50.0 µM六、实验结论1. 5-FU、PTX、DDP、DTX等化疗药物对人癌细胞系A549具有明显的抑制作用，且抑制作用随着药物浓度的增加而增强。
抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则
抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则一、基本原则1. 抗肿瘤药物分类(1) 细胞毒类药物(cytotoxic agent)：包括干扰核酸和蛋白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等；(2) 生物反应调节剂(biological response modifier)；(3) 肿瘤耐药逆转剂(resistance reversal agent)；(4) 肿瘤治疗增敏剂(oncotherapy sensitizer)；(5) 肿瘤血管生成抑制剂(tumor angiogenesis inhibitor)；（6）分化诱导剂(differentiation inducing agent)；(7) 生长因子抑制剂(growth factor inhibitor)；（8）反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) 。
2. 抗肿瘤药物药效学需研究内容2.1 包括体外抗肿瘤试验，体内抗肿瘤试验。
2.2 评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。
2.3 I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制初步研究。
二、体外抗肿瘤活性试验1. 试验目的1.1 对候选化合物进行初步筛选；1.2 了解候选化合物的抗瘤谱；1.3 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等。
2. 试验方法选用10-15株人癌细胞株，根据试验目的选择相应细胞系及适量的细胞接种浓度，按常规细胞培养法进行培养；推荐使用四氮唑盐MTT还原法、XTT 还原法、磺酰罗丹明B(SR染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。
药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。
试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。
3. 评价标准以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线，然后采用Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)。
大补元煎通过MAPK通路增加食管癌细胞对铂类药物敏感性的实验研究
大补元煎通过MAPK通路增加食管癌细胞对铂类药物敏感性的实验研究1. 研究背景食管癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率逐年上升。
针对食管癌的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗等。
由于食管癌的发病机制复杂，肿瘤细胞对传统治疗方法的敏感性较低，导致治疗效果不佳。
寻找新的抗肿瘤药物和治疗策略具有重要的临床意义。
参与调控细胞生长、分化、凋亡等多种生理过程。
近年来的研究发现，MAPK 信号通路在多种肿瘤中异常活化，并与肿瘤的发生发展密切相关。
通过调节MAPK信号通路，可能提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，从而为食管癌的治疗提供新的思路。
大补元煎是一种中药复方制剂，具有滋阴补肾、益气养血等功效。
前期研究表明，大补元煎可以调节多种肿瘤细胞的增殖、凋亡等生物学行为，同时还可以影响肿瘤细胞的耐药性。
本实验拟进一步探讨大补元煎是否可以通过调节MAPK信号通路，增加食管癌细胞对铂类药物的敏感性，为食管癌的治疗提供新的理论依据。
2. 实验材料和方法细胞株：食管鳞癌细胞株Eca109,由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。
铂类药物：顺铂(cisplatin,DDP),购自美国SigmaAldrich公司。
大补元煎提取物：从中药大补元中提取得到的有效成分，按照一定比例进行浓缩，制成实验用的大补元煎提取物。
试剂：RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS)、DMSO、CCK8试剂盒、Annexin VFITCPI双染试剂盒、PI(propidium iodide)和显微镜成像系统等。
细胞培养：将食管鳞癌细胞Eca109培养在含10FBS的RPMI1640培养基中，于37C、5CO2条件下培养至对数生长期，然后进行传代。
细胞增殖实验：取对数生长期的食管鳞癌细胞Eca109,接种到96孔板中，每孔100L,设置空白对照组和不同浓度的大补元煎提取物处理组。
分别加入10L DMSO溶解的大补元煎提取物，使终浓度分别为、molL。
抗肿瘤药物实验法
5、癌细胞分化诱导实验
【基本原理】癌症属于细胞分化异常的疾病。恶性肿 瘤存在着明显的细胞分化受阻。白血病、黑色素瘤、 肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤等可在体外被某些化合 物诱导分化为正常细胞或近似正常的细胞。这些发现 为抗肿瘤药物研究开辟了一条新的途径。因此，癌的 分化治疗已成为癌症研究的重要前沿方向之一。
第2节 肿瘤动物模型体内筛选方法
1.诱发肿瘤动物模型实验法 2.自发肿瘤动物模型实验法 3.移植性肿瘤动物模型实验法 4. 转基因动物肿瘤实验法
• 对诱发肿瘤的评价
• 诱发性肿瘤的病因与由环境因素所诱致人癌情况相似 。癌细胞增殖动力学在两者间亦接近，故动物诱发肿 瘤类似人体肿瘤。
• 但人癌原因十分复杂，诱癌剂不清，肿瘤的病理组织 学与动物不同，发生发展与动物诱发肿瘤不完全一致 。
断药物是否有明显的抑制肿瘤生长的作用，为 抗癌药物临床疗效提供有意义的依据。 • 动物移植性肿瘤是任何体外试验不能代替的。
• 一种药物未必对各种类型的移植性肿瘤有 效，选择某一瘤株供筛选都可能漏筛药物。
• 动物肿瘤的生物学特点与人类有较大的差 距，动物瘤株恶性程度高，生长迅速，对 药物的敏感性比人类自发的癌瘤高得多， 因此，对动物肿瘤生长有抑制的药物对人 癌不一定有效。本法的命中率低。
随着新型抗癌药的研究，诞生了许多抗肿瘤药物实
第1节 肿瘤细胞体外筛选方法
一、抗肿瘤药体外方法
动物模型在抗肿瘤药物的评价中起重要的 作用，但动物模型费用高，周期长使其不适 合大规模的抗肿瘤药物评价。因此抗肿瘤药 初步筛选首先应采用肿瘤细胞体外实验方法， 既节约成本又节省时间。
1.MTT法
【基本原理】活细胞线粒体中存在的脱氢酶能够 代谢还原黄色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2） -2，5-二苯基四氮唑（MTT）为蓝紫色的甲臜； 而死细胞此酶消失，MTT不被还原。
肿瘤药物敏感性测试与个体化用药方案制定
肿瘤药物敏感性测试与个体化用药方案制定近年来，随着肿瘤治疗领域的快速发展，越来越多的研究表明，个体化用药方案对肿瘤患者的治疗效果起到了至关重要的作用。
肿瘤药物敏感性测试作为一种精准医疗技术，为制定个体化用药方案提供了有力的支持。
本文将对肿瘤药物敏感性测试和个体化用药方案的相关内容进行探讨。
一、肿瘤药物敏感性测试的原理和方法肿瘤药物敏感性测试旨在通过一系列实验室技术手段评估不同肿瘤细胞对药物的敏感性，从而为临床治疗提供参考。
通常，肿瘤组织或肿瘤细胞会被培养并暴露在不同药物浓度下，通过观察细胞的生长状态和细胞死亡率等指标，来评估药物的抗肿瘤效果。
目前，肿瘤药物敏感性测试主要包括细胞毒性试验、细胞增殖抑制试验和细胞凋亡检测等方法。
其中，细胞毒性试验通过检测药物对肿瘤细胞的杀伤效果来评估药物的敏感性；细胞增殖抑制试验则通过评估药物对细胞增殖的抑制效果来判断药物的抗肿瘤活性；细胞凋亡检测则是通过检测药物是否能够诱导肿瘤细胞的凋亡来评估药物的抗肿瘤效果。
这些方法可以根据具体需求进行选择，以实现对不同药物的敏感性评估。
二、肿瘤药物敏感性测试在个体化用药方案制定中的应用个体化用药方案的制定是根据患者的特定情况和药物的敏感性，为每位患者定制最佳的治疗方案。
肿瘤药物敏感性测试在制定个体化用药方案中发挥着重要作用。
首先，肿瘤药物敏感性测试能够帮助医生选择最适合患者的药物。
根据测试结果，医生可以了解不同药物对患者肿瘤细胞的杀伤效果，从而选择最有效的药物。
这样，患者不需要进行试验性的治疗，能够直接接受有效的个体化治疗，提高治疗效果。
其次，肿瘤药物敏感性测试还可以辅助医生确定药物的剂量和使用频率。
根据测试结果，医生可以调整药物的剂量，确保药物在治疗过程中的有效性和安全性。
此外，个体化用药方案还可以根据患者的情况进行调整，以适应不同患者的需求。
最后，肿瘤药物敏感性测试还能够为治疗后的疗效评估提供依据。
通过定期监测患者的治疗反应和肿瘤细胞的敏感性变化，可以根据实际情况对个体化用药方案进行调整，以提高治疗效果。
浅谈肿瘤化疗药敏试验方法
如何更有效地筛选应用抗肿瘤药物，预测个体肿瘤对药物的敏 性 的判断方法是 ， 利用 图像分析装置 ， 依据肿瘤细胞 和成纤维细胞 的 感Ｊ 生， 指导临床治疗 以提高疗效早已成为临床化疗界瞩 目的问题。近 增殖形态和中性红染色程度的差异计算出肿瘤细胞克隆的体积值， 进 年来 ， 肿瘤药敏试验指导 的个体化治疗的研究 ， 受到国内外肿瘤界的 而计算出抗肿瘤药物处理组（ Ｔ ） 和非处理组（ ｃ ） 之间的相对增殖率之 重视 。 国际上 ， 相继建立了一系列药物敏感Ｉ 生 试验技术。 应用人类新鲜 比（ 即 值） 。Ｔ ／ ｃ 值在 ５ ０ ％以下的被认为肿瘤对该试验药是敏感的。
【 技术原理 】 【 技术原理】 基于以整体细胞群杀灭概念为基础 ，同时检测分裂细胞和非分 Ａ Ｔ Ｐ生物荧光技术产生于 ２ ０世纪 ７ ０ 年代中期。 １ ９ ８ ３ 年， Ｍｏ ｙ ｅ ｉ 一 裂细胞 ， 从而维持肿瘤细胞群体的异质眭。因为肿瘤难治 的主要原因 等提出内源性三磷腺苷 的数量可以反映细胞的活性度。随后 ， Ｋ ａ ｒ ｃ ｍ 是其与肿瘤细胞群体 中有可逆 的非分裂细胞（ 即Ｇ ｏ 期细胞 ） 的杀灭
２ 四氮唑 （ ＭＴ Ｔ） 比 色法
பைடு நூலகம்
【 技术原理 】 活细胞特别是增殖期细胞线粒体 中琥珀酸脱氢酶将黄色的 Ｍ １ 代谢产物 ５ 一 氟一 ２ 一 脱氧尿苷＿ ５ — 磷酸和 Ｄ Ｎ Ａ合成形成牢 固立体 的共 代谢为 深蓝色 的甲躜 晶体 ， Ｆ Ｇ Ｆ二 甲基亚砜 Ｄ ＭＳ Ｏ溶解 晶体后 ， 价复合物 ， 而阻滞 Ｄ Ｎ Ａ合成 ； 另外 ， ５ ＿ Ｆ ｕ最终被 Ｄ Ｐ Ｄ等三种分解为 ５ ７ ０ ｎ ｍ波长测量 Ａ值并判断结果。 近年来 ， Ｍ ｒ Ｉ Ｔ Ｉ １ 法在几乎所有类型肿 氟一 Ｂ 一 丙氨酸而排泄 ， Ｄ Ｐ Ｄ活性和 ５ 一 Ｆ ｕ 抗肿瘤效果呈负相关。 瘤药敏试验中应用 ， 其可评率高、 简易快速 、 观察终点客观。Ｍｑ Ｔ法也 【 技术特点】 有多种改良， 如用软琼脂培养 ， 减少正常细胞生长 ； 于 ＭＴ ｒ 溶液 中加 通过检测肿瘤组织内 Ｔ Ｓ 、 Ｄ Ｐ Ｄ潘 陆可预测对 ５ － Ｆ ｕ的敏感性 ， 进 步以 Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ等分子生物学技术检测内镜下获得的微量组织标本 【 技术特点 】 中Ｔ Ｓ 、 Ｄ Ｐ Ｄ的 ｍ Ｒ Ｎ Ａ表达情况 ， 可由于肿瘤的恶性性质及 目 前肿瘤 Ｍ １ Ｔ ｒ 法有众多优点 ， 被认为是简便、 快捷 、 经济的药敏方法。 治疗 的 现状 ， 医师和患者均希望有能够准确预测化疗药物敏感 『 生 的方 ３ 胶原凝胶包埋培养药物敏感・ 眭实验 法， 能否与临床实际相符合是医师考虑的首要因素， 价格 、 操作难易程 【 技术原理 】 度、 需要的时间也在考虑范围之内。 随着人们对药敏试验的不断重视， 是先通过特定的酶消化９ 中 瘤细胞外基质 ， 单纯 回收细胞成分 ， 再 以及方法上的不断改 良， 或出现了新 的药敏测试方法 ， 从而能进一步 将这些细胞成分包埋于人工的细胞外基质 ， 即Ｉ 型胶原凝胶 中， 以此 提高肿瘤化疗效果， 改善患者的预后。 在这种 情况下， 开发对肿瘤敏感 构成—个与体内相似的微环境 ， 并将它们放置于近似于体 内的环境 中 药物的新筛选方法， 从不断增多的各种治疗方案 中 选择对患者最合适 进行三维立体培养 ， 然后进行药敏试验 。Ｃ Ｄ － Ｄ Ｓ Ｔ的药物抗肿瘤敏感 的抗肿瘤药越来越重要， 已成为临床化疗界瞩 目 的重要问题之一。
抗癌药物性敏感试验5-1
琼脂是生长基质层帮助细胞贴附生 长。适于病毒转化细胞和恶性转化细胞。
5.在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化
二.影响克隆形成率的因素
接种众多单个分散细胞，经培养后能 够增Байду номын сангаас形成克隆的百分数称克隆率或接种 率（cloning efficiency）。
影响因素：
接种细胞密度： 细胞悬液的细胞密度越 大,克隆形成率越低
3.生长曲线测定法
1）药物对细胞的杀伤率
将对照组及加药组生长曲线的线性部 分延伸至Y轴，可分别得到截距NO及NO’。 代表接种后具有增殖力的细胞数。
药物对增殖细胞的杀伤率＝ [（ NO－ NO’）/ NO]×100％
2）药物对倍增时间（TD)的影响
TD = t ㏒2
㏒Nt－ ㏒N0
t代表培养时间， N0 和Nt分别代 表接种后及培养1小时后的细胞数。 如倍增时间延长则表明药物使细胞增 殖能力减弱。
裸鼠特点: 先天性胸腺缺损 胸腺依赖性免疫功能缺乏，T细胞功能 接近于零，但B细胞功能基本正常 异种移植时无排斥反应
故可以进行人体 肿瘤异种移植。
2）小鼠肾包膜下肿瘤移植试验 1978年Bogden首先报道了将人肿瘤组织
移植于裸鼠肾包膜下的六天药敏试验方法。
细胞的克隆化技术
细胞克隆（cell cloning）：又 称单细胞克隆，即把单个细胞从群体 内分离出来单独培养，使之重新繁衍 成一个新的细胞群体的培养技术。
培养基：Ham F12K培养液是最好的克隆化 培养液。
血清：胎牛血清好于小牛血清。
饲养细胞：有利于克隆的形成。
激素和生长因子：胰岛素，地塞米松， 表皮生长因子等可以促进不同细胞生长。
CO2: 对绝大多数细胞克隆形成率有提 高作用，常用5％浓度。
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谢 谢！Βιβλιοθήκη 染料排斥实验原理是细胞死亡后膜通透性增加，染 料通过细胞膜而使细胞着色，故通过 计数未着色细胞可计算出药物的杀伤 率。但由于某些受杀伤尚未死亡的细 胞也不易着色，故假阴性率较高。另 外在计数时主观的因素会出现较大的 误差，目前较少应用。
集落形成法
集落法(Human Tumor Cell Cloning Assay, HTCA）肿瘤组织由增殖和非增殖细胞组 成，其中仅有 1％具有旺盛的增殖能力， 是肿瘤浸润扩散和复发的根源。 这种细 胞具有形成细胞集落的能力,故又称为肿 瘤干细胞。 测定肿瘤干细胞对药物的敏 感性符合临床药物治疗的需要。
四唑蓝比色法（MTT法 四唑蓝比色法（MTT法）
原理： 原理：活细胞内线粒体脱氢酶能将四甲基偶氮唑 盐转化为蓝紫色结晶物(formazan)， 盐转化为蓝紫色结晶物(formazan)，用二甲亚砜 DMSO）溶解后，可在酶标仪上记录吸光度。 （DMSO）溶解后，可在酶标仪上记录吸光度。 优点: 操作简便，设备要求不高，时间短。 优点:1.操作简便，设备要求不高，时间短。 实验精确，重复性好， 2.实验精确，重复性好，而且无主观人为 因素影响，临床符合率85 85％ 因素影响，临床符合率85％。 成功率高，约为80 90％ 80－ 3.成功率高，约为80－90％
肿瘤药敏的方法学
肿 瘤 细 胞 药 敏
体内法 裸鼠皮下移植 裸鼠肾包膜下移植 裸鼠原位移植 染料排斥法 集落形成法 同位素法 四唑蓝比色法
体外法
裸鼠肾包膜下移植
裸鼠肾包膜下移植实验是肿瘤细 胞药敏体内实验最常用的方法， 但由于裸鼠需要在无菌条件下饲 养，而且肾包膜下移植实验操作 复杂，实验周期长，不易在临床 广泛开展。
放射同位素法
3H的β射线能量低，分辨率高，半衰期长达 射线能量低，分辨率高，
12年 标记胸腺嘧啶核苷( HTdR)为最常用 为最常用。 12年,3H标记胸腺嘧啶核苷(3HTdR)为最常用。 放射性同位素标记 的核苷酸容易掺入 DNA和RNA分子中 放射性同位素发灵 敏度高，重复性好。 时间短，可较快地 得到结果。 仪器设备要求高。 由于具有放射性，故 操作时需要一定的防 护措施。 废料需特别处理。
MTT法操作方法 MTT法操作方法
用培养液调整细胞浓度为1 ml后接 用培养液调整细胞浓度为 1 × 10 5 / ml 后接 种于微量培养板， 每孔100 100， 种于微量培养板 ， 每孔 100 ， 每组设三个平 行孔，加入100 100μl 含有化疗药的培养基, 行孔，加入100μl 含有化疗药的培养基,置 培养箱内培养68 小时， 加入20 68小时 20μl MTT后再 培养箱内培养 68 小时 ， 加入 20 μl MTT 后再 培养4小时,吸弃上清，每孔加二甲亚砜 200μl,用微量震荡器震荡, μl,用微量震荡器震荡 200μl,用微量震荡器震荡,使结晶产物充分 溶解，在自动酶标仪上比色，测出波长 570nm 处的吸光度， 最后计算细胞杀伤活性。 nm处的吸光度 570 nm 处的吸光度 ， 最后计算细胞杀伤活性 。
集落形成法的优点
抑制纤维母细胞的增殖，不受肿瘤细胞 以外的细胞的影响。 下层滋养层可加入各种辅助分子，更利 于肿瘤的生长。 直接测定药物对肿瘤细胞中最活跃的成 分肿瘤干细胞的影响。
集落形成法的缺点
高纯度单细胞悬液的制备困难。 所形成的细胞集落并非都是肿瘤 细胞集落。 成功率低，有一定的难度。 培养周期长，需10天左右。
MTT法注意事项 MTT法注意事项
血供丰富的肿瘤组织在制取肿瘤单细胞悬 液时， 大量的红细胞影响测定， 液时 ， 大量的红细胞影响测定 ， 可用红细 胞裂解液裂解红细胞。 胞裂解液裂解红细胞。 有色的抗癌药物对吸光度有影响， 有色的抗癌药物对吸光度有影响 ， 可用同 浓度的药物作为本底，去除药物的影响。 浓度的药物作为本底，去除药物的影响。 吸弃上清时要注意不要吸掉结晶物， 吸弃上清时要注意不要吸掉结晶物 ， 一般 要先离心，板底留约30μl的培养基 30μl 要先离心，板底留约30μl的培养基
肿瘤药物敏感实验
化疗的重要性
自1946 Gillman Phillip 1946年Gillman Phillip报道氮芥类 1946 Gillman和Phillip 药物治疗造血系统肿瘤以来，化学治疗巳取 得很大的进步。目前化学治疗已使绒癌、恶 性淋巴瘤、睾丸精原细胞瘤、小细胞肺癌等 多种恶性肿瘤获得治愈的机会，大多数恶性 肿瘤能得到缓解，化疗在恶性肿瘤的治疗中 具有不可替代的地位。
集落形成法方法学
双层琼酯法：底层 加入0.5% 的琼脂培 养液, 上层加含肿 瘤细胞悬液的0.3 % 琼脂培养液。上层 培养液供肿瘤细胞 生长，下层防止细 胞贴壁及成纤维细 胞的过度生长。 玻璃毛细管法: 培养 基0.6ml，瘤细胞悬液 0.6ml 0.1ml 0.1ml,抗癌药0.1 ml, 1％琼脂糖0.2ml加在 一起混匀后向玻璃毛 细管内加入50μl，冷 50μl 却凝固后置37℃二氧 化碳培养箱内培养。
肿瘤化疗的局限性
肿瘤的化学治疗在半个世纪 以来，虽然取得显著进展，但临 床抗肿瘤药物治疗的总有效率并 不高，阻碍化学治疗取得更好疗 效的原因众多，主要包括：
1. 现行化疗的盲目性
抗肿瘤药物研究表明，即使是相同 组织学类型的肿瘤对同一抗肿瘤药物 的反应也并不尽一致，对不同脏器或 不同组织学类型的肿瘤采用相同的用 药方案，效果更是千差万别。目前大 多数化疗是采用的对某种脏器既定的 联合方案,仍有一定的盲目性。
2.化学治疗的抗药性 2.化学治疗的抗药性
有些肿瘤对某些药物存在先 天耐药,还有些肿瘤经化疗缓解， 肿瘤敏感株杀灭，耐药株成为 复发的根源，而且对以后的化 疗抵抗。
3. 抗癌药物的毒性
所有抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞 的同时，也杀伤正常的组织细胞，尤 其是增殖旺盛的骨髓造血细胞和胃肠 道细胞。期望通过增大剂量、增加用 药品种、缩短间隔时间的方法来提高 抗癌效果，则将进一步加重毒性作用。
肿瘤药敏的可行性
七十年代细胞培养技术的突破，新型培 养材料、培养基的问世。 1983年Mosmann Mosmann建立了MTT MTT法，方法简便， 1983 Mosmann MTT 设备要求不高，检测时间短，便于在临 床上广泛开展。 新的抗癌药不断问世，同一种肿瘤有多 种联合化疗方案可供选择。
如何解决这些问题？ 如何解决这些问题？
肿瘤化疗个体化: 肿瘤化疗个体化 : 研究发现，根据药敏
检测结果指导选药，有效率可在原来固定 化疗方案的基础上提高一倍以上，于是提 出了肿瘤化疗个体化的概念(即预见性化 疗)。根据个体肿瘤敏感性检测的结果，选 用敏感的药物的联合方案，无疑将会大大 提高肿瘤的治疗水平。
3HTdR掺入法 HTdR掺入法 用培养液调整细胞浓度为1 ml。 用培养液调整细胞浓度为1×105/ml。将 此浓度的细胞接种于微量培养板，每孔 100μl μl， 孔为一组，加入100μl含有化 100μl 100μl，每3孔为一组，加入100μl含有化 疗药的培养基， 培养52 小时， 加入20 52小时 20μl 疗药的培养基 ， 培养 52 小时 ， 加入 20 μl 3HTdR, 实验结束后 ， 吸弃上清 ， 加入 0 . 3 ％ HTdR,实验结束后 吸弃上清，加入0 实验结束后， 胰蛋白酶消化细胞， 胰蛋白酶消化细胞 ， 用多头细胞收集器收 集细胞。 集细胞 。 最后用液体闪烁计数仪测定每分 钟脉冲数（CPM） 钟脉冲数（CPM）值。