以人血清为培养基的大鼠全胚胎培养方法研究
大鼠胚胎干细胞的培养和分化
大鼠胚胎干细胞的培养和分化胚胎干细胞是一种具有不同能力的多能性干细胞，其可以自我更新并分化为各种细胞类型。
这种特性使胚胎干细胞成为治疗许多难治性疾病的前沿工具。
然而，胚胎干细胞的获取和使用也存在其固有问题。
使用胚胎干细胞的过程需要对胚胎进行捐赠并且会导致胚胎的破坏，这是一个道义和法律上都有争议的问题。
因此，对于胚胎干细胞的研究已逐渐趋向于使用成体细胞干细胞的技术。
成体细胞干细胞一种非胚胎来源的多能性干细胞，其原理是通过基因转换修改特定的成体细胞，使其转化为干细胞。
这个领域较早的工作是通过反向编程中介的重编程技术将成体细胞转化为干细胞，这一发现奠定了成体细胞干细胞培养的重要基础。
而大鼠胚胎干细胞也成为印证这方面工作成果的经典样例。
大鼠胚胎干细胞的培养成体细胞干细胞的培养过程，首先需要提取成体细胞。
成体细胞分化成为不同的组织，其细胞类型、种属、来源、年龄等特性都会影响干细胞的特性。
对于大鼠胚胎干细胞的培养，通常需要从大鼠胚胎中提取内囊泡、体细胞等明显的细胞，经过荷瘤病毒、转录因子等特定的转化方法，使其转化为干细胞。
在大鼠胚胎干细胞的培养过程中，最常见的是将培养基添加到细胞中。
培养基中有各种生长因子，有助于细胞的分化和扩增。
这些培养基还包含适当的营养物质、生长因子和化学物质，以确保大鼠胚胎干细胞在培养基中保持稳定地生长。
此外，对于大鼠胚胎干细胞的培养过程，需要特别注意调整培养基的配方、周期和条件以实现最佳培养效果。
大鼠胚胎干细胞的分化在胚胎干细胞的培养过程中，细胞必须分化成为不同的细胞类型。
大鼠在胚胎发育期间，产生许多不同种类的细胞。
在类似的方式下，大鼠胚胎干细胞造出来的也能够分化成为不同的细胞类型。
这些细胞类型包括神经元、心肌细胞等。
通过调整培养条件，发现对细胞的影响方式，使大鼠胚胎干细胞失去其多能性，也就是走向其性命。
目前，大鼠胚胎干细胞的分化应用在医疗方面的作用还相对有限，但这个领域的不断发展为研究其实际意义提供了更多的机会和潜力。
大鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性
大鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性商爱民;吴靖芳;薛刚;张静;张耕【摘要】目的:探讨影响大鼠胚胎成纤维细胞(REF)分离和培养的一些因素,以建立稳定的REF培养体系.方法:取SD大鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对REF的生长形态、生长曲线进行观察,以探讨不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对REF分离及培养的影响,并对其进行免疫细胞化学鉴定.结果:13.5d 胎龄鼠胚的REF分离效果优于10.5d、18.5d 胎龄鼠胚;REF在体外为贴壁生长型细胞,第三代细胞增殖旺盛;并表达波形蛋白(vimentin)、层黏连蛋白(laminin,LN)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)蛋白.结论:13.5d 胎龄SD大鼠REF以H-DMEM做培养基,在第3代增殖旺盛,合成多种细胞外基质,最适宜作胚胎干细胞或其它悬浮培养细胞的饲养层.【期刊名称】《神经药理学报》【年(卷),期】2010(027)003【总页数】4页(P17-20)【关键词】大鼠;胚胎;成纤维细胞;层黏连蛋白;纤维连接蛋白【作者】商爱民;吴靖芳;薛刚;张静;张耕【作者单位】河北北方学院教务处,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000;河北北方学院附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000【正文语种】中文【中图分类】R329.2;Q256胚胎成纤维细胞饲养层是体外成功培养人胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)细胞的必要条件。
主要分泌某些细胞因子如成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子[1],以促进 ES细胞增殖以及抑制分化。
同时又能分泌细胞外基质,如纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、层黏连蛋白(laminin,LN)等。
LncRNA GAS5通过miR-21ADAMTS-1途径抑制大鼠肺纤维化
中国药理学通报ChOese PhopncologicO Bulletin2424Dec；36(12):1737〜43-1737•网络出版时间：2420-12-312：10网络出版地址/ttys：//kps.cukh uemkcms/0e/il/34.1036.R.04201242.1317.234.htmlLncRNA GAS5通过miR-29/ADAMTSP途径抑制大鼠肺纤维化刘理静22,钱红5，王乐6，胡柯5,贺兼斌5,田玉梅2(1.湖南医药学院护理学院，湖南怀化411004；3,长沙民政职业技术学院医学院，湖南长沙410044；3.湖南医药学院医学院,4.湖南医药学院侗医药研究湖南省重点实验室，0.怀化市第一人民医院呼吸与危重症医学科，湖南怀化411004)Vol：14.C666/j.issn.1041-1278.2424.12.419文献标志码：A文章编号：1041-1978(2424)12-1737-47中国图书分类号：R-C36；R369.35；R349.9；R563.134.22摘要：目的探讨生长阻滞特异性转录本0(growth wrest-specifiv Uanscript0,GAS5)对肺纤维化的影响及分子机制。
方法采用生物信息学、荧光素酶报告基因分析GAS5、m/-21、ADAMTSN间的竞争性内源RNA(ceRNA)关系。
SD大鼠分为对照组、LV-GAS5组和LV-GAS5+mi/-71agomR组，经气管内注入博莱霉素A0建立肺纤维化模型后，分别给予尾静脉注射4.2mL的PBS、LV-GAS5、LV-GAS5+miR-21ag-omiy028,处死大鼠，收集血液，采用ELISA分析血清PICP 和PDINP水平，提取肺组织，HE染色和Masson染色观察病收稿日期：2929-97-29,修回日期：2929-97-07基金项目：湖南省自然科学基金资助项目(No2918JJ2077)作者简介:刘理静(1777-),男，硕士，副主任医师,研究方向：肺纤维化的防治,E-mail：wsfyz-709@；钱红(1777-)女，硕士，副教授,研究方向：肺纤维化的防治，共同第一作者，E-mail:Uae/2@；田玉梅(1777-),女，硕士，副教授,研究方向：肺纤维化的防治，通讯作者,E-mail:776256368@ 理改变，并用qRT-PCR检测GAS5、miRUl、ADAMTSN表达, Western blot检测ADAMTSU、Col I、Col川表达。
新生大鼠施万细胞体外培养的实验研究
新生大鼠施万细胞体外培养的实验研究引言：随着科学和技术的不断发展，体外细胞培养成为生物医学研究中的一项重要工具。
体外细胞培养是指将活体细胞从生物体内取出并在培养基中进行细胞生长和繁殖的过程。
新生大鼠施万细胞是一种常用的培养细胞系，具有较高的增殖能力和稳定的生长特性，被广泛应用于生物医学研究。
本文将对新生大鼠施万细胞体外培养的实验研究进行探讨。
实验方法：1.材料准备-成熟雌性新生大鼠-新鲜的完全有效的胎盘组织-PBS缓冲液-无菌培养基-无菌生长因子2.细胞分离与培养a.将新鲜胎盘组织放入含PBS的离心管中，并用显微镊子将组织块分解成细胞悬液。
b.将悬液过筛，去除残渣和大块组织碎片。
c.使用无菌培养基将细胞悬液转移到无菌培养皿中。
d.加入适量的无菌生长因子。
e.在37℃、5%CO2培养箱中培养细胞。
3.细胞生长曲线测定a.采用显微镜观察培养皿中的细胞形态和细胞数量。
b.在培养的不同时间点，取出细胞进行细胞计数，并绘制细胞生长曲线。
4.细胞增殖能力测定a.将细胞离心收集，用PBS冲洗。
b.用胶原酶或胰酶消化细胞，制备细胞悬液。
c.在新干净的无菌培养皿中播种一定浓度的细胞悬液。
d.在37℃、5%CO2培养箱中培养细胞，观察细胞增殖情况。
结果与讨论：1.细胞形态观察在培养的早期，细胞为椭圆形，贴附在培养皿上。
随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，并呈多角形或星形。
2.细胞数目统计经过一段时间的培养，细胞数量明显增加。
绘制的细胞生长曲线显示，细胞以指数方式增殖，呈现出快速增长的趋势。
3.细胞增殖能力测定对细胞进行连续传代培养，观察细胞的增殖情况。
结果发现，新生大鼠施万细胞经过多次传代后依然能够保持良好的增殖能力。
细胞体外培养的限制与进展：尽管细胞体外培养在生物医学研究中的应用非常广泛，但仍存在一些限制和挑战。
其中主要包括细胞外环境与体内环境的差异、细胞的无血清培养和三维培养等。
为了克服这些限制，科学家们正在不断努力开展相关研究，提高细胞体外培养的效果。
人教生物学选择性必修3单元检测卷 (3) 基因工程 生物技术的安全性与伦理问题(解析版)
人教生物学选择性必修3单元检测卷(三) 基因工程生物技术的安全性与伦理问题(本试卷满分：100分)一、选择题(本题共16小题，共40分。
第1～12小题，每小题2分；第13～16小题，每小题4分。
每小题给出的四个选项中，只有一个选项是最符合题目要求的。
) 1．下列有关基因工程的说法，正确的是()A．基因工程常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体B．目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等C．基因工程运用基因突变的原理来培育新品种D．成功地将目的基因导入受体细胞便完成了基因工程的工作解析：选B载体不属于工具酶，A错误；目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等，载体需要含有限制酶切点、标记基因等，B正确；基因工程的原理是基因重组，C错误；将目的基因导入受体细胞，还需要对目的基因进行检测和鉴定，D错误。
2．有关基因工程中工具的说法，正确的是()A．限制酶只能识别6个核苷酸组成的序列B．限制酶与DNA聚合酶的作用部位一样C．病毒不能作为基因工程的载体D．DNA连接酶能把黏性末端的氢键连接起来解析：选B大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成，少数限制酶识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，A错误；限制酶、DNA连接酶和DNA聚合酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，B正确；在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等，C错误；DNA连接酶可使DNA片段的黏性末端通过磷酸二酯键连接起来，D错误。
3．如图是DNA分子结构的示意图，其中，基因工程中使用的限制酶的作用位点是()A．①B．②C．③D．④解析：选B限制酶的作用位点是磷酸二酯键，即图中的②。
4．某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶结构和功能很相似，只是热稳定性较差，进入人体后容易失效。
现要将此酶开发成一种片剂，临床治疗食物的消化不良，最佳方案是()A．减少此酶在片剂中的含量B．将此酶与人蛋白酶拼接，形成新的蛋白酶C．重新设计与创造一种全新的蛋白酶D．替换此酶中的少数氨基酸，改善其功能解析：选D减少此酶的含量会降低疗效，且剩余的酶仍然容易失效，A错误；蛋白质之间不能进行简单的拼接，B错误；只需将此酶进行改造后满足需求即可，不需重新设计与创造一种全新的蛋白酶，C错误；要提高该酶的热稳定性，可以采用蛋白质工程技术替换此酶中的少数氨基酸，以改善其功能，D正确。
胚胎大鼠背根神经节体外培养的实验研究
河北医科大学硕士学位论文胚胎大鼠背根神经节体外培养的实验研究姓名：王丽琴申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：王维平;李春岩2003.3.1中文摘要胚胎大鼠背根神经节体外培养的实验研究摘要目的：目前神经组织培养技术是神经科学一项很有价值研究手段和方法。
背根神经节（ｄｏｒｓａｌｒｏｏｔｇａｎｇｌｉｏｎｓＤＲＧｓ）是周围神经系统（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｎｅｒｖｅｓｙｓｔｅｍ，ＰＮＳ）的感觉神经元，ＤＲＧｓ的体外培养模型已广泛用于轴突的导向及再生、突触发育和可塑性、中枢神经系统和周围神经系统的髓鞘形成，神经营养因子作用及受体分布、神经细胞衰老机制、基因治疗、组织工程等神经科学的研究，成为遗传性、获得性神经病的一个新的研究途径。
格林一巴利综合征（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－ＢａｒｒｅｓｙｎｄｒｏｍｅＧＢＳ）是包括许多临床亚型的周围神经系统疾病。
目前认为是体液免疫和细胞免疫共同介导的神经系统自身免疫性疾病，但病因及发病机制并不十分明确。
本实验建立ＤＲＧｓ体外培养模型为进一步研究格林．巴利综合征提供一个崭新的研究工具。
本课题建立了体外胚胎大鼠背根神经节的分离培养及纯化体系，在光镜水平从细胞形态学角度观察了培养神经元细胞的生物学特性。
方法：（１）采取神经组织单层原代分离培养的方法建立ＤＲＧｓ的混合培养体系：无菌取孕１５天（Ｅ１５）Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）大鼠胚胎的ＤＲＧｓ，用胰蛋白酶消化２０分钟，再用机械吹打法将ＤＲＧｓ制成单细胞悬液，以１０６细胞密度种植在预先包被细胞基质成分多聚赖氨酸（ｐｏｌｙ．Ｌ．１ｙｓｉｎ，ＰＬＬ）和层粘蛋白（Ｌａｍｉｎｉｎ，ＬＮ）的培养板中，加入含胶质细胞源性神经营养因子（ｇｌｉａｌｃｅｌｌＩｉＩｌｅＩ中文摘要ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ，ＧＤＮＦ）的ＮＢｌ培养基，于Ｃ０２培养箱中培养。
（２）＿币ｔＪ用差速贴壁法建立ＤＲＧｓ的分离纯化体系：将胰蛋白酶消化后的单细胞悬液首先种植在未包被基质的３５ｍｍ的培养皿中，于Ｃ０２培养箱中孵育５０分钟，收集未贴壁的细胞悬液以１０６细胞密度种植在预先包被ＰＬＬ和ＬＮ的培养板中，在ＮＢｌ培养基中培养。
全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性
全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性【摘要】目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC) 的方法，研究MSC的生物学特性。
方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC，体外培养和连续传代, 在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化；利用四唑盐比色（MTT）法测定MSC的生长曲线；流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜抗原。
结果原代分离的MSC在接种后48 h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。
经传代扩增,细胞进一步纯化。
细胞传代后2天内处于潜伏期, 3天后进入生长期,7天后进入平台期。
论文百事通FCM检测CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。
结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。
【关键词】间充质干细胞;骨髓;贴壁法分离培养Abstract:Objective To establish a simple and effective method of isolation, purification and cultivation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) in vitro, and explore their biologicalcharacteristics.Methods MSC were isolated and purified for culture in vitro and serial passage by the attachment culture method. The morphological changes of the MSC were continuously observed under the inverted microscope. The cell growth curve was measured by MTT method, and membrane antigens were detected with flow cytometry (FCM).Results The MSC in primary culture which were adhered to plastic surface within 48 h after displacement took the oval, asteroid, short and fusiform shapes. 12 days after culture in DMEM-F12 medium containing 10% FBS, the cells reached 90% confluence in single layers, taking a long and fusiform shape. Further purification was achieved by expansion at serial passages. MSC were in latency for 2 days, converted into growth period on the 3rd day and entered the stationary phase on the 7 th day. FCM results indicated that the positive rate of CD45 and CD90 was 19.60% and 95.38%, respectively.Conclusion The attachment culture method can be effectively used to isolate and purify rat MSC. The cultured MSC are stable in growth with active proliferation and share the general biological characteristics of MSC, which will further make them ideal seed cells for tissue engineering.Key words: mesenchymal stem cells; bone marrow; attachment culture骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC) 是骨髓内除造血干细胞外另一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的条件下能分化为多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、成纤维细胞及神经星状细胞等，且具有极强的自我修复能力。
[细胞体,羊膜,干细胞]关于大鼠羊膜细胞体外培养及其干细胞标记物的表达
![[细胞体,羊膜,干细胞]关于大鼠羊膜细胞体外培养及其干细胞标记物的表达](https://img.taocdn.com/s3/m/1f16859233687e21ae45a92a.png)
关于大鼠羊膜细胞体外培养及其干细胞标记物的表达羊膜位于胎盘绒毛膜内侧，是一层无血管、神经、淋巴和肌肉的透明薄膜，可起到对胎儿的保护作用，与发育中的胎儿联系紧密。
人源羊膜细胞在受精后第8 天开始形成，具有多项分化的潜能，可向三个胚层细胞进行分化，近年来研究表明，羊膜上皮细胞能够分化为成熟的神经细胞，并合成释放多巴胺、乙酰胆碱、去甲肾上腺素等神经递质。
人羊膜细胞具有低免疫原性和有效的免疫抑制力，细胞移植后不会发生急性排斥反应。
本实验从大鼠羊膜分离获取羊膜细胞，建立稳定培养的条件，并对其生物学特性进行了探讨，为其将来在细胞移植治疗方面的应用提供实验依据。
1 材料和方法:1. 1 材料1. 1. 1 主要仪器:CO2培养箱、净化工作台、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、流式细胞仪。
1. 1. 2 主要试剂:DMEM 高糖培养基( Dulbeccosmodified Eagles medium，DMEM)、人表皮生长因子(EGF)、0.25%含EDTA 的胰蛋白酶(0. 25% trysin-EDTA)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、抗生素(penicillin，streptomycin)、PBS 缓冲液购自于 Gibco公司。
Oct-4、Sox-2、SSEA-4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90 购自与 Abcam 公司。
CD29、CD44 购自于 eBioscience 公司、CD45、CD11b 购自于 BD 公司。
1. 1. 3 实验动物:SPF 级孕 18 ～ 18. 5 d 的 SD 大鼠，购自中国军科院实验动物中心，许可证号:[SCXK-(军)2014-0004]，实验动物使用批准号:ILAS-PL-2014-001。
在无菌条件下进行实验操作分离羊膜组织。
1. 2 方法1. 2. 1 羊膜细胞分离及培养:SD 孕鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥钠(0. 01 mL /g)，麻醉后，无菌条件下开腹，机械性分离子宫层，剥离胎盘，分离羊膜组织置于含有500 U/mL 双抗的 PBS 溶液中冲洗。
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以人血清为培养基的大鼠全胚胎培养方法研究王秋枫1,赵树芬2,张秀池2,严虹英1(11包头医学院第二附属医院内科,内蒙古包头 014030;21北京医科大学公共卫生学院劳动卫生教研室,北京 100083) [摘要]目的:该方法可否作为一种检测药物胚胎发育毒性效应的手段;方法:取孕915d(头褶中期)的大鼠胚胎,分别在大鼠血清培养基和人血清培养基(90%的人血清,10%的大鼠血清,并补充葡萄糖到3mgΠml血清)中培养48h,K lug等人的评分系统对胚胎生长参数和形态进行评分;结果:915d的大鼠胚胎在人血清培养基中培养48h,全部胚胎均发育正常,与在大鼠血清培养基中培养48h的胚胎生长发育情况相近;除胚胎DNA含量以外,其他各项评价胚胎生长发育的指标与在纯大鼠血清中培养的胚胎比较均无显著性差异(P<0105);结论:在我们的实验条件下,以人血清为培养基培养大鼠胚胎的方法可用于胚胎早期生长发育的研究和评价。
[关键词]人血清;胚胎;发育;全胚胎培养[中图分类号]Q95414-33,Q492-33[文献标识码]A[论文编号]100420951(2000)022*******The use of human serum for studying growth and development of9.5day rat embryos in whole embryo culturesWAN G Qiu2feng1,ZHAO Shu2fen2,ZHAN G Xiu2chi2,YAN Hong2ying1(11Department of Internal Medicine,the2nd A f f ilated Hospitalof Baoto Medical U niversity,Inner Mongolia,Baoto014030China;21Department of Occupational Health,Beijing medical U niversity,Beijing100083China) [Abstract]Objective:To study the growth and development of9.5day rat embryos in whole embryo cultures,and if also may be used as a methed for testing the effects of exposure to drugs on embryos development;Methods:Growth of head fold stage(9.5day)rat embryos cultured for48 hours in human serum by supplemented with glucose(3mgΠml serum),and10%rat serum.The comparison of the embryo development in rat serum,and evaluated48hours later for alterations in growth and specific moropholagical parameters,using a modifiod K lug scoring system;Results:The embryos growth and development in human serum is as good as that in rat serum,there are not growth retardation or abnormal development,except DNA contents of embryos cultured with rat se2 rum,there were no statistically significant differences between data the two groups;Conclusion:The head-fold-stage(9.5day)rat embryos cultured in human serum may be used for assessment of growth and development of embryos,it also may be used as a methed for testing the effects of expo2 sure to drugs on embryos development.[K ey w ords]Human serum;Embryos;Development;whole embryo cultures[收稿日期]1998212214 [修订日期]2000201210[作者简介]王秋枫(1963-),男,内蒙古包头人。
内蒙古包头医学院第二附属医院内科副主任医师,医学硕士。
主要从事内科医疗,药物毒理及其预防的研究。
以人血清为培养基的大鼠全胚胎培养方法是国外近年来发展起来的新的实验方法,已用于检测疾病、药物、化学物质、营养等因素的发育毒性的研究,并逐渐开始探索应用该方法预测人体接触某些化学毒物后的潜在发育毒性,但在国内尚未见到相关的报道。
1 材料与方法 动物:Wister种大鼠,雌鼠体重在250～350g,雄鼠体重在300～400g。
均由北京医科大学实验动物部提供。
动物交配:取未孕的雌性及雄性大鼠在下午6:00点1:1合笼,第2d晨检查阴栓,以发现阴栓之日的中午12:00点定为妊娠015d。
试剂:Hank’s平衡盐溶液;牛血清白蛋白;Folin &Ciocalteuis Phenal试剂;小牛胸腺DNA;二苯并咪唑(H33258);4%Na2CO3溶液;012N NaOH溶液;1% CuSO4・5H2O溶液;2%酒石酸钾钠溶液;磷酸缓冲液:0105M Na2HPO4,210M NaCl,p H=7.4;012M EDTA;血糖标准液;葡萄糖氧化酶单一试剂;链霉素和青霉素钠盐。
实验仪器:隔水式电热恒温胚养箱;实体解剖显微镜-Olympus;超净工作台;旋转培养器;转速20Πmin;72-G型分光光度计;CPS-1A超声波粉碎机;M-850型荧光分光度计;PQ-01型配气装置;离心机。
培养基,大鼠血清培养基的制备:大鼠经2%的戊巴比妥钠麻醉后,用75%的乙醇在腹部皮肤常规消毒,剖腹经腹主动脉取血,即刻离心(3000转Πmin)30min,吸取血清,56℃灭活30min,-20℃储存备用。
人血清培养基的制作:选取健康无毒物接触史的成年男、女性30名(男15名,女15名,年龄20～40岁)。
取清晨肘静脉血10ml,即刻离心(3000转Πmin)30min,吸取血清移入培养瓶中, 56℃30min灭活(用滤器过滤),配成90%的人血清+10%的大鼠血清,56℃灭活30min,加青霉素钠010006mgΠml,链霉素0166mgΠml,-20℃储存备用。
每个血样均测葡萄糖含量,于培养前将培养基葡萄糖含量补充到3mgΠml。
胚胎的分离与培养[1]:取孕915d的大鼠经2%的戊巴比妥钠麻醉后,用75%的乙醇在腹部皮肤常规消毒,剖腹,取出两侧子宫角,移入装有Hank’s液的无菌平皿内,打开子宫角,在实体解剖显微镜下顺次剥去每只胚胎外边包绕的蜕膜,打开Reichert’s膜,壁层卵黄囊,将胚胎连同卵黄囊脏层、羊膜、外胎盘圆锥一起移置到装有培养基的培养瓶中,每瓶3只胚胎,培养瓶放于旋转培养器上,于37℃转动培养48h。
培养瓶充气[1]:放入胚胎前以及培养12h时,向培养瓶内充入5%O2、5%CO2、90%N2;在24h充入20%O2、5%CO2、75N2;在36h充入40%O2、5%CO2、55%N2。
培养结果的观察和评价[2,3]:依据K lug等人制定的形态学计分方法,并结合Brow和Fabro的胚胎形态学评价方法,对卵黄囊血循环、胚胎的形状、鳃弓、神经管、头、眼、耳、心、前肢芽、尾等形态发育指标逐项进行评价,同时测定卵黄囊直径、颅臀长、头长及胚胎蛋白和DNA的含量,胚胎蛋白质测定用Lowory氏法[4]。
数据以( x±s)表示。
资料统计分析方法:用两均数比较的t检验。
2 研究结果211 大鼠胚胎在人血清培养基中生长发育与在纯大鼠血清中生长发育的比较915d的大鼠胚胎分别在人血清培养基中和大鼠血清培养基中培养48h后,胚胎形态发育正常,体节及鳃弓发育、胚胎大小及各项形态发育指标极为接近,仅胚胎DNA含量低于纯大鼠血清培养的胚胎,其余各项生长参数及形态学计分均无差异(P>0105)。
见表1、2。
表1 915d的大鼠胚胎在人血清培养基与在大鼠血清中培养48h生长参数计分和蛋白质测定值组 别胚胎数CY(mm)CR(mm)HD(mm)SOM BRBPRO T(μgΠembryo)DNA(μgΠembryo)大鼠血清315187±01414121±01451185±011426110±11143100±010*******±6611322188±5172 人血清935198±01534109±01461190±011926111±11292191±0128282127±5312920130±31213 注:CY-胚胎卵黄囊直径;CR-胚胎顶臀长度;HD-胚胎头长;SOM-胚胎体节数目;PRO T-胚胎蛋白质含量;DNA-胚胎DNA含量;3人血清组与大鼠血清组比较:P<0105;BRB:胚胎出现的腮弓数目。
表2 915d的大鼠胚胎在人血清培养基与在大鼠血清中培养48h后形态学计分测定值组别胚胎数SHAPE NP EYE EAR HEAD HEART FLB TAIL BLOOD TM大鼠314194±01254197±01185100±01004100±0100 2.97±01182194±01253100±01004100±01004100±010038184±0145人934198±01155100±01004199±01113199±01112197±01173100±01153101±0118 3.99±01113199±011138185±0159 注:SHAPE-胚胎形状;NP-胚胎神经管发育;ETE-胚胎眼部发育;EAR-胚胎耳发育;HEAD-胚胎头发育;HEART-胚胎心脏发育;FLB-胚胎肢芽发育;TALL -胚胎尾部发育;BLOOD-胚胎血液循环;TM-胚胎形态学总计分。