酶工程思考题有答案

一、什么是生物工程？简述现代生物工程的体系组成。

生物工程（B i oe n g i n e e ri ng ）又称生物技术或生物工艺学，是20 世纪70 年代发展起来的一门新的综合性应用科学,是基于分子生物学和细胞生物学的新兴

技术领域。通常把生物技术分为发酵工程、酶工程、基因工程、细胞工程四个分科，它们相互依存，相互促进。其中，酶工程是生物工程的重要组成成分。

二、什么是酶工程？研究酶与酶工程的意义？

酶工程是随着酶学研究迅速发展，特别是酶的应用推广使酶学与工程学相互渗透结合，发展而成的新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术。它是从应用的目的出发研究酶，是在一定生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化为有用物质的技术。酶工程包括下列主要内容（酶的产生酶的制备酶和细胞固定化酶分子改造有机介质中的酶反应酶反应器抗体酶酶传

感器酶技术应用）

酶与酶工程研究的重要意义:1研究酶的理化性质及其作用机理，尤其是从酶分子水平去探讨酶与生命活动、代谢调节、疾病、生长发育的关系，具有重大科学意义。2酶是分子生物学研究的重要工具，限制性内切酶H in d Ⅱ的发现使核酸序列测定有了突破，促进了DN A 重组技术的诞生，推动了基因工程的发展3酶的高效率、专一性及不需要高温高压或强酸强碱的反应条件，对普通的化学催化反应产生了决定性的飞跃。它丰富充实了现代化学中的催化理论4酶在工、农、医各方面都应用已久。现在，从与人们生活休戚相关的衣食住行到各行各业的高技术革命，几乎都与酶有关。

三、酶作为生物催化剂的显著特点是什么？影响酶活性的因素有哪些？

催化效率高；高专一性；易失活；调节性。

（1．酶浓度的调节 2. 激素调节 3. 共价修饰调节 4. 限制性蛋白水解作用与酶活力调控 5. 抑制剂的调节 6. 反馈调节 7. 金属离子和其他小分子化合物的调节）？

除[E]、[S]外，外界因素：温度、pH、激活剂、抑制剂？

四、解释典型的（米氏）酶动力学曲线，K m、K s、V max和k cat的定义是什么？说明这些常数之间的关系？

K m：反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。

Ks：底物亲和常数(也称半饱和速度常数）,表示微生物对底物的亲和力。

Vmax:指酶的催化反应速率随底物浓度增加所能达到的最大的浓度；

kcat酶转换数（kcat)：一定条件下，1微摩尔酶分子所转化底物的微摩尔数。是表示酶催化效率的。

五、抑制剂如何影响酶催化反应速度？

1酶既可与底物结合又可与抑制剂结合，但不能同时与两者结合。可与底物结合的酶量减少使得催化反应速度降低。

2通过I与E或与ES的结合，改变酶结构和性质； Vmax减小、Km不变；抑制作用取决于 [ I ]。

3抑制剂只能与复合物ES结合形成三元复合物EIS,E与S结合非但不排斥I，反而促进E与I的结合，但EIS不能释放产物。Vmax、Km都减小，且随[I]增加而减小。

六、举出四种以上分离纯化酶的方法，分别说明其分离原理、特点和用途。

沉淀分离，是通过改变某些条件或添加某些物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出与其他溶质分离的技术过程。简单易行，适合酶的初步分离。

离心分离，离心分离是借助于离心机旋转时所产生的离心力，使不同大小，不同密度的物质分离。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。

过滤与膜分离，是借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离。

层析分离，利用混合液中个组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同的比例分布在两相（流动相和固定相）中，当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。层析分离设备简单、操作方便，在实验室和工业化生产中均广泛采用。

萃取分离，利用物质在两相中溶解度的不同而使其分离。

七、试论述如何利用所学的各种分析技术对特定的蛋白酶进行酶学性质（如分子质量、pI 、带电状态、亚基组成、溶解性等）研究。

荧光探针技术不但可以对原来不发荧光的物质进行极微量的测定，而且利用它的特异性结合对环境的敏感，可为生物大分子结构和功能的研究，提供很多有用的信息。 1. 蛋白质疏水区的探测使用共价结合的在水中一般不发光的染料与蛋白质的疏水区结合后，可以发出很强的荧光。利用其对环境的极其敏感性，根据它们在不同蛋白质分子中量子产率、峰位及谱带宽度的变化，就可以探测蛋白质分子的极性和疏水性的大小。2. 二硫键的检测，N-densyl-氮丙啶能选择性地和蛋白质的半胱氨酸的硫起反应，同时，由于含有二硫键的变形蛋白质分子的偏振达到最小值，也就可以测定变形蛋白

质分子中的二硫键。

3. 研究酶的变构效应荧光探针与生物大分子结合后，荧光光谱必然会随着生物大分

子的构象的变化而发生改变。蛋白质的圆二色光谱是它们所含各种立体结构组分的圆二色谱的代数加和曲线，因此利用某一波长范围的圆二色光谱可以研究蛋白质中各种立体结构的含量，从而为进一步测定生物大分子的空间结构奠定基础。

核磁共振可以测定蛋白质的结构，主要运用二维核磁和三维核磁波谱。核磁共振波谱的谱峰包括相当丰富的与蛋白质分子结构有关的波谱信息，它们有波谱参数表示。直接用于确定蛋白质分子溶液三维结构的主要波谱参数有化学位移、耦合常数和 nuclear overhauser effect（NOE）。可以通过这些参数正确的测定蛋白质的二级结构和三级折叠。

利用质谱或者各种质谱的连用可以获知蛋白质的相对分质量和氨基酸组成。

凝胶电泳可以对蛋白质的分子质量进行大致的测量

样品中蛋白质的含量可以有 Bradford 法、紫外分光光度法、福林-酚法等

等电点聚焦电泳可以高的分辨率对少量的样品的 pI 进行精确测量，有了关于酶的等电点的信息，只要测定酶水溶液 pH 并将它与等电点的进行比较可得出酶的带电状态

此外紫外分光光度法还可用于酶活性的测定，各种电镜技术也可以为酶的高级结构提供有效的信息。

八、举例说明什么是酶的生物合成过程中基因表达的诱导与阻遏，正调控与负调控模式？

酶合成的诱导：Jacob and Monod的工作——已知分解利用乳糖的酶有：β-半乳糖苷酶；β-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验中：1.大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；2.大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失；3.表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的诱导。

酶合成的阻遏：Jacob and Monod的工作——实验中：1大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；2.在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长的经济原则：不需要就不合成。某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的阻遏。

酶生物合成的负调控模式：如乳糖操纵子的诱导机制。如乳糖操纵子的负控诱导机制（乳糖与葡萄糖同时存在时，因为分解葡萄糖的酶类属于组成酶，能迅速地将葡萄糖降解成某种中间产物（X），X既会阻止ATP环化形成cAMP，同时又会促进cAMP分解成AMP，从而降低了cAMP的浓度，继而阻遏了与乳糖降解有关的诱导酶合成）

酶生物合成的正调控模式：如分解代谢物阻遏调控机制；降解物抑制作用是通过提高转

录强度来调节基因表达的，是一种积极的调节方式（葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸环化酶的活性，减少环腺苷酸的合成，与它结合的蛋白质即环腺苷酸受体蛋白又称分解代谢物激活蛋白因找不到配体而不能形成复合物。

九、制备固定化酶的基本原则是什么？举例说明固定化酶的研究现状和发展趋势。

基本原则：(1) 必须注意维持酶的催化活性及专一性，所以固定化时要采取尽量温和的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。 (2) 固定化时应该有利于生产的自动化、连续化。为此，用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。

(3) 固定化酶应该有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 (4)酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能够回收贮藏，利于反复利用 (5)固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。 (6)

固定化酶成本要低，以利于工业使用。

十、酶固定化方法有哪几类？酶固定化后其性质会发生什么变化，原因是什么？

化学方法、物理方法、物理与化学结合法三种。（共价键结合法离子结合法交联法物理吸附法包埋法）

1 酶活力的变化：固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变，，可能的原因是：1，酶分子在固定化的过程中，空间构象会有所改变，甚至影响了活性中心的氨基酸；2，固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的定位作用；3，内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；4，包埋是没被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近。

2 酶反应最适PH值的改变。酶固定化后，酶蛋白质的电子状态会发生改变，载体表面的电位要受影响，对底物作用的最适pH常发生偏移，偏移的原因是微环境表面电荷性质的影响，一般说来，用负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH较游离酶偏高，反之，使用带正电荷的载体其最适pH向酸性偏移。

3 动力学常数的改变。表观米氏常数和最大反应速度会随载体的带电性能变化。原因大致是电荷间相互作用导致引起酶与底物亲和力与产物在整个溶液中扩散不均一的，从而导致米氏常数和最大反应速率的变化。

4 酶最适反应温度的改变。原因：酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果，由于固定化后的，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高。

5增加酶的稳定性。对热、PH 值、有机溶媒、蛋白质变性剂、蛋白质分解酶的稳定性增加。连续化反应稳定性好。——固定化酶的最大好处。原因：1，固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形；2，酶活力的缓慢释放；3，抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子见相互作用的机会，从而抑制了降解。

十一、比较使用游离酶、固定化酶和固定化细胞作为催化剂的优缺点。

固定化酶：(1)固定化的酶可以再生和更高效的运用 (2)通过固定化可以增加酶的稳定性 (3)固定化酶比起游离酶可以提供更好的加工可能性 (4)固定化酶可以防止残余酶

活对产物的污染。

固定化细胞优点：不需提制酶，可保持酶的活性。反复使用，本低——与固定化酶比较

十二、酶的选择性化学修饰的优点是什么？化学修饰的基本原理是什么？

一．热稳定性增加。二．抗原性部分可消除。三．体内半衰期延长。四、最适pH发生变化。五．酶学性质的改变，最大反应速度没有改变，米氏常数会增大。

基本原理：影响蛋白质化学修饰反应进程的因素主要有两个：一是蛋白质功能基的反应性；二是修饰剂的反应性。影响酶蛋白功能基反应性的因素包括微区的极性，氢键效应，静电效应和位阻效应，而影响修饰剂反应性的因素则包括选择吸附，经典相互作用，位阻因素，催化反应性和局部环境的极性等方面。要想获得理想的化学修饰结果，则必须要：对酶性质的了解：活性部位，稳定条件，反应条件等；对修饰剂的要求：分子量，水溶性，活性团等；对反应条件的选择：分子比例，条件，反应温度及时间等。十三、维持蛋白质稳定性的分子原因是什么？

* 金属离子、底物、辅因子和其他相对分子质量配体的结合作用 * 蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 * 盐桥和氢键 * 二硫键 * 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低

* 氨基酸残基的坚实装配 * 疏水相互作用

十四、酶在有机溶剂中发挥催化作用的必要条件是什么？可用于酶催化的非水介质包括哪些类型？

必要条件：1．保证必需水含量。 2．选择合适的酶及酶形式。 3．选择合适的溶剂及反应体系。 4．选择最佳pH值。

非水介质：有机介质，气相介质，超临界流体介质。

十五、什么是核酶? 试述核酶的类型、结构与功能？

核酶是一类结构简单、分子量小、具有核酸内切酶活性的 RNA 分子.

核酸酶是唯一的非蛋白酶。它能特异性结合及切割相关的靶分子RNA的磷酸酯键导致RNA的裂解,且裂解完毕后,能够自行脱离,再和其他靶分子 RNA 结合,并且不影响宿主细RNA.

剪切型核酶；剪接型核酶。

锤头核酶发夹核酶

十六、试比较核酶/脱氧核酶与普通蛋白质酶的异同？核酶/脱氧核酶有那些应用？前景如何？

核酶作用的特点：＊化学本质为RNA；＊底物为RNA ，肽键，a-葡聚糖分支酶; ＊反应特异性(专一性）：碱基，＊催化效率低

基因治疗（1、肿瘤治疗2、遗传病治疗）

核酶抗病毒的研究（1.抗肝炎病毒 2.防治动植物病虫侵害3.抗人类免疫病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)核酶）

在其他领域的应用应用于水果保鲜；应用于基因组研究等分子生物学实验；核酶可作为生物传感器分子等。

十七、简述酶分子定向进化的基本原理与策略。简述定向进化在酶性质改造上的应用？

基本策略：策略一：第一轮随机突变中所选择的突变体再重复进行随机突变和选择, 以积累更多的有益突变。策略二：应用DNA 改组或其它方法改进突变体的重组, 可使有益突变组合并消除有害突变。策略三：前两种方法都是利用单一基因突变体的随机突变和重组,与之相反，当同源基因重组产生嵌合体时, 可以出现新功能。

酶性质改造上的应用：1提高酶分子的催化活力 2提高酶分子稳定性的定向进化 3

适应人工环境中提高酶活力或稳定性的进化 4提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化 5对映体选择性的定向进化 6变换催化反应专一性

十八、构建杂合酶的方法有哪些，各有什么优缺点？

1.点突变及二级结构互换 * 随机的点突变可以保持因同源序列互换而会导致降低的

酶活力 * 通过二级结构的互换可以导致底物专一性的改变

2.功能域替换 * 把功能域看做是构成酶的组件，可以通过互换来构建能催化特定反应的酶。 * 转移活性部位至同系蛋白改变底物专一性改变辅酶专一性改变结合活性 * 转移功能序列到呈现骨架蛋白上 * 转移活性部位到一个新的结构上β转角

β发夹催化基团转移

3.融合蛋白 * 转移的是整个蛋白质则得到融合蛋白；*设计具有专一性标签的双功能或多功能蛋白质；* 天然酶系统与人工酶系统；* 在人工组合的结构域间创造别构作用。十九、抗体和酶有何异同？什么是抗体酶？

抗体酶（Abzyme) 概念：抗体酶或催化抗体（Catalytic antibody)是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力

巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活性的免疫球蛋白。

异同：酶和抗体都能与底物特异性的结合，酶和抗体的本质区别在于，酶是能与反应过渡态选择结合的催化性物质，而抗体是和基态分子紧密结合的物质。酶的催化效率高，而抗体底物的专一性高。

2抗体酶和非催化性抗体作用的比较

更高的反应特异性，反应的可逆性，反应的量效性，反应过程

二十、酶的应用主要涉及哪些领域，举例说明酶在医药领域的应用（至少2例）。

1.酶在医药方面的应用

2. 酶在食品方面的应用3、酶在轻工、化工方面的应用4、酶在环境保护中的应用5、酶在生物技术方面的应用

一．疾病诊断（1. 通过酶活力变化进行疾病诊断2. 用酶测定物质的量的变化进行疾病诊断）

二. 疾病治疗：药用酶具有疗效显著，不良反应小的特点，其应用越来越广泛。

三. 制造药物：利用酶的催化作用将前体物质转变成药物，许多氨基酸或核苷酸等生产需要关键酶的催化作用。