Cu2+对曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)幼体几种免疫因子的影响

Cu 2+对曼氏无针乌贼（Sepiella maindroni ）幼体几种免疫因子的影响徐佳晶1 吴常文2 常抗美2 吕镇明21宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 （315211）2浙江海洋学院海洋科学学院，浙江 舟山 （316004）Email ：cn_1982@摘要：在水温16±1℃的条件下探讨不同浓度的Cu 2+胁迫下对曼氏无针乌贼（Sepiella maindroni ）幼体非特异性免疫的影响。

取经过Cu 2+胁迫12h 和96h 曼氏无针乌贼幼体测定AcP 、AlP 、SOD 、CAT 活性，结果显示：Cu 2+在较低浓度情况下能对乌贼幼体的非特异性免疫系统进行刺激、触发免疫应答；在较高浓度时，Cu 2+对磷酸酶系统和SOD 的激活仍然存在，而CAT 的活性收到抑止，造成机体H 2O 2的积累，造成了H 2O 2对膜成分主要是脂类和蛋白的溶酶体膜的破坏，进而损坏了AcP 与AlP 系统，最终出现SOD 活性高，AcP 、AlP 、CAT 活性减低的现象，导致过量H 2O 2的积累、损害机体并伴有免疫活性的下降。

关键词：乌贼幼体 环境胁迫 酶活性曼氏无针乌贼（Sepiella maindroni ）曾是我国渔场的四大渔业之一，对温度的适应性较强，在我国沿海分布很广，是一种经济价值很高的传统渔业种类。

由于过度捕捞和生态恶化，自20 世纪70 年代以来，先后出现了衰退现象。

[1]上世纪八十年代有报道李星颉等[2,3]对曼氏无针乌贼资源及增殖的初步研究，而国外有对商乌贼（Sepiella officinalis ）的生物学及养殖方面的报道[4-6]。

近几年宁波、舟山等地开始对曼氏无针乌贼进行养殖并取得了一定成果。

近十年来，在免疫学领域，关于非特异性（先天性）免疫机制的研究逐渐得到重视，并且出现了一系列具有价值的研究成果[7]。

总结大量的研究成果，非特异性免疫因子主要有酚氧化酶（POs ），超氧化物歧化酶（SOD ），酸性磷酸酶（AcP ），碱性磷酸酶（AlP/AKP ），谷胱甘肽过氧化物酶（Se-GPx ）[9-13]等。

在机体抵抗异物入侵时，细胞通过吞噬感染的病毒、细菌或其它一些颗粒等进入细胞内，通过酸性磷酸酶（AcP ）、碱性磷酸酶（AlP ）、溶菌酶等水解，与此同时，NADPH 氧化酶被激活并不断分解氧气分子产生活性氧自由基：、、1和H •-2O OH i 2O 2O 2，即呼吸爆发。

大量的活性氧自由基会对脂类、蛋白质和核酸造成损害。

此类作用对大部分大分子均有一定损害，由于多不饱和脂肪酸含有共轭双键使之对氧化氧化损伤更加敏感。

[14]活性氧对双键的进攻使之转化成饱和脂肪酸，并经过脂肪酸途径分解。

一般而言由胺类催化的脱羧反应会由中间产物西福碱基产生（Schiff’s base ），最终形成不可分解的脂褐质沉积于生物体并随着年龄的增长而累积。

[15]生物体有抗氧化系统及相应的修复机制来防止环境的氧化损伤，同时作为贝类也是重要的非特异性免疫机制。

酶分解活性氧和H 2O 2是主要的抗氧化途径。

由线粒体等产生的通过SOD 转化为过氧化氢：；接着，CAT 将过氧化氢除去：。

因此机体中AcP 、AlP 、SOD 、CAT 的含量及活性就可以很好地反映其免疫活性的变化。

•-2O •-222O +2H O 2H O →222222H O 2H O+O →然而，以上这些研究主要局限于一些模式生物[16]，头足类对环境胁迫的非特异性免疫应答研究报道甚少。

[17]。

在养殖过程中硫酸铜经常用于除去丝藻(Filamentous Algae)并常用做消毒剂。

作为一种微量元素，铜对生物体的生长、新陈代谢和酶活性具有重要的意义。

有研究表明，铜是抗氧化酶系统（如SOD）和电子传递链的重要影响因子[18]。

但是，过量的铜已经被证明会妨碍多种生理功能[19]。

过量的铜会影响酶的功能，减少蛋白的合成、降低糖、核酸、脂类的代谢[20]。

在自然界的水体中，铜以众多形式存在，其中普遍认为处于离子状态的Cu2+在对水生动物的毒害中起着主要作用[21]。

本研究测定了AcP、AlP、SOD及CAT活性在Cu2+胁迫下的变化，以期了解Cu2+对曼氏无针乌贼幼体的免疫系统的影响，为曼氏无针乌贼海水健康养殖和海水污染治理提供理论依据。

1材料和方法1.1试剂及仪器CuSO4为分析纯，主要实验仪器有UV-2102C紫外可见分光光度计、722S分光光度计、Millipore Synergy纯水系统、GL-16G-II高速冷冻离心机、FA2004分析天平。

AcP、AlP、SOD、CAT、考马斯亮蓝蛋白试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2材料曼氏无针乌贼幼体取自浙江大海洋科技有限公司秀山育苗场，选取秋季育苗阶段体质健康、活力强的同一批刚出膜的个体。

放入玻璃缸暂养，暂养盐度17，水温16℃，暂养期间不投饵。

实验期间每天投喂强化轮虫2次、换水一次。

实验容器为6L黄色半透明塑料盆。

1.3方法1.3.1环境胁迫在上述暂养条件下加入逆境胁迫条件，具体操作如下：将CuSO4配制成5个浓度梯度：0.02、0.08 ppm（以Cu2+计）。

设置对照组，即不加入CuSO4。

各浓度及对照组均设3个平行。

共计9盆。

每个盆中放入经暂养24h的乌贼幼体各20个。

每日分别于8：00 和20：00 投饵，早晨6：3 0 更换新鲜的等胁迫条件的海水。

1.3.2酶活测定从各组存活的个体中分别在12h和96h随机抽取5个乌贼幼体，去除内脏团后，分别置于冰浴中，加入3ml预冷生理盐水匀浆，再以冷冻离心机4℃、4500r/min离心15分钟，上清液立即做酶活力测定。

采用南京建成生物研究所生产的试剂盒，测定AcP、AlP、SOD、CAT 活性。

按照磷酸苯二钠法测定AcP、AlP活性，定义为每克组织蛋白在37 ℃与基质作用30 min 产生1 mg 酚的酶量为一活力单位（U/g）。

按黄嘌呤氧化酶法测定SOD 活性，定义为每毫克组织蛋白在1 ml 反应液中SOD 抑制率达50%时反应的SOD 量为一个活力单位（U/mg）。

CAT（过氧化氢酶）定义为：每毫克组织蛋白酶分解1 μmol 的H2O2的量为一个活性单位（u）。

1.4数据处理使用 SPSS13.0对实验数据进行处理。

各浓度梯度的实验数据使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行处理，用t检验完成各组间的均值比较（Tukey），用以说明实验的组间差异（P<0.05）。

经过96h 试验，在实验组出现个别死亡现象。

图1 所示， Cu 2+(0.02ppm)实验组与对照组无显著差异（P<0.05）,而Cu 2+(0.08ppm)实验组与对照组存在显著差异（P<0.05）。

实验所测得的在不同浓度剃度Cu 2+下AcP 、AlP 、SOD 、CAT 活性（U/mg prot ），结果如图2所示。

对所测得酶活结果用SPSS 进行处理，使用单因素方差分析对各组实验平行进行均值比较。

各实验平行与对照组数据使用Tukey 过程处理所得的组间差异性如图1中所示，其中字母表示差异显著性（P<0.05）。

实验结果表明，两种浓度的Cu 2+在12h 实验中，对AcP 均具有明显的激活，且高浓度（0.08ppm ）实验组AcP 活性增强较低浓度（0.02ppm ）组明显。

经96h 后，0.02ppm 实验组的AcP 活性持续升高，而0.08ppm 试验组AcP 活性明显下降。

AlP 活性测试结果表明，低浓度Cu 组AlP 活性在12h 和96h 均明显低于对照组，高浓度Cu 组AlP 活性则在96h 时显著升高。

而Cu 2+对SOD 的影响，在趋势上略同与AcP ，只是在96h 处，高浓度的Cu 胁迫下实验组的SOD 活性与对照组无显著差异（P<0.05）。

Cu 2+对CAT 在12h 没有表现出明显的影响，在96h 的结果表明高浓度Cu 对CAT 的抑制和低浓度Cu 的激活。

图1 乌贼幼体Cu 2+组96h 存活率图2 Cu离子对曼氏无针乌贼幼体AcP、AlP、SOD、CAT活性影响3讨论研究表明由于软体动物缺乏免疫球蛋白，因此除了细胞免疫外，依靠凝集素的凝集和调理作用，溶血素及溶酶体酶等各种非特异性的酶和免疫因子的共同作用的体液性免疫也起到了重要的作用。

这些酶活力的高低表明了机体的免疫状态[22]。

现有研究成果表明，铜对双壳类具有急性和亚致死毒性。

[23]由于我们主要关注在养殖过程中的投饵或换水时出现铜的短期过量，故本研究取96h为观察时间，以期了解铜对乌贼幼体短期的免疫应答。

实验对曼氏无针乌贼幼体若干的非特异性的酶做一些初步的研究，并希望能从侧面反应乌贼幼体的免疫状态。

本研究对AcP的测试，表明在较低浓度的Cu2+能有效地刺激曼氏无针乌贼的磷酸酶系统，而随着浓度的升高下对其活性表现出的抑制作用，这一结果与在对扇贝和贻贝的类似实验所得的结果相似[24,25]。

酸性磷酸酶（AcP）是由溶酶体产生的，有研究表明较高的AcP活性会伴随溶酶体膜的损坏[10; 11].试验中高浓度Cu2+对AcP所表现出的先激活后抑制的现象，很有可能缘自溶酶体膜的损坏，从而影响AcP的活性。

碱性磷酸酶（AlP）几乎存在于高等动物的各个组织中，在肠上皮、肝脏、白细胞、成骨细胞等部位尤其丰富，血清中的AlP主要来源于肝脏和骨骼。

AlP的结果差异性比较大。

蓝伟光等[26]报道,适量的铜能激活真鲷肝脏碱性磷酸酶的活性,过量时真鲷肝脏碱性磷酸酶的活性又会受到明显的抑制。

刘存歧等[27]对对虾幼体所做的研究也得到类似的结果。

Jing G等[28]报道珠母贝(Pinctada fucata)消化腺中低浓度Cu2+对AlP无激活，而高浓度时能激活AlP。

我们的结果与Jing G一致，与蓝伟光等的结果不同，表现出乌贼与真鲷具有一定差异性。

Jing G等还认为AlP由复杂因子影响，Cu2+只是其中的一个影响因素，其具体机制还尚待进一步研究。

贝类缺乏特异性免疫机制，其对外界异物入侵的防御是以血细胞为基础。

这些血细胞在逆境下能够释放一些毒性物质来杀灭和消灭病原微生物，其中活性氧自由基就是重要的一类。

众多研究结果表明Cu2+能高效的催生氧自由基毒害生物体[19]，Kidwai[30]利用9种海岸的典型生物对Cu2+的毒性做过研究，其中8种对Cu2+敏感。

在本实验中，发现Cu2+对SOD较强的激活，而较活跃的SOD必定能产生更多的H2O2，在正常情况下，应该有相应更多的CAT参与分解H2O2以保护机体。

然而，实验结果表明CAT的活性在高浓度组96h测试结果表明出明显的抑制作用。

理论上可以推断，有富余H2O2积累。