纯化水中需氧菌总数检测方法
纯化水质量标准、检查项目表及验证检测周期2018.10.29
2015版《中华人民共和国药典》纯化水纯化水为饮用水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的制药用水,不含任何添加剂。
性状：为无色的澄清液体；无臭.检查：酸碱度：取纯化水10ml,加甲基红指示液2滴，不得显红色；另取10ml，加溴麝香草酚蓝指示液5滴，不得显蓝色。
硝酸盐：取纯化水5ml置试管中,于冰浴中冷却，加10％氯化钾溶液0.4ml与0。
1％二苯胺硫酸溶液0.1ml,摇匀，缓缓滴加硫酸5ml，摇匀，将试管于50℃水浴中放置15分钟，溶液产生的蓝色与标准硝酸盐溶液[取硝酸钾0。
163g,加水溶解并稀释至100ml，摇匀,精密量取1ml，加水稀释成100ml,再精密量取10ml,加水稀释成100ml，摇匀，即得(每1ml相当于1μgNO3)]0。
3ml,加无硝酸盐的水4.7ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0。
000 006％).亚硝酸盐：取纯化水10ml，置纳氏管中,加对氨基苯磺酰胺的稀盐酸溶液（1→100）1ml及盐酸萘乙二胺溶液（0。
1→100)1ml，产生的粉红色，与标准亚硝酸盐溶液[取亚硝酸钠0。
750g(按干燥品计算），加水溶解，稀释至100ml,摇匀，精密量取1ml，加水稀释成100ml，摇匀，再精密量取1ml，加水稀释成50ml，摇匀,即得（每1ml相当于1μgNO2））0.2ml，加无亚硝酸盐的水9.8ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0。
000002％)。
氨：取纯化水50ml，加碱性碘化汞钾试液2ml,放置15分钟;如显色，与氯化铵溶液(取氯化铵31。
5mg，加无氨水适量使溶解并稀释成1000ml)1.5ml,加无氨水48ml与碱性碘化汞钾试液2ml 制成的对照液比较,不得更深(0。
00003％）。
电导率：（应符合通则0681)，见下表1测定的温度所对应的电导率值即为限度值;如未在表中列出，采用线性内插法计算得到限度值,所测定的电导率值应不大于限度值.表1 温度和电导率的限度表内插法的计算公式为:k=[ ]＊(k1—k0)+k0式中,k ＝测定温度下的电导率限度值k1＝表中高于测定温度的最接近温度对应的电导率限度值 k0＝表中低于测定温度的最接近温度对应的电导率限度值 T ＝测定温度T1＝表中高于测定温度的最接近温度 TO ＝表中低于测定温度的最接近温度总有机碳：不得过0。
《中国药典》2015年版纯化水质量检验操作规程
本品为饮用水蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的制药用水，不含任何添加剂。
1、性状：本品为无色的澄明液体；无臭。
2、检查：2.1酸碱度取本品10ml，加甲基红指示液2滴，不得显红色；另取10ml，加溴麝香草酚蓝指示液5滴，不得显蓝色。
2.2 硝酸盐取本品5ml置试管中，于冰浴中冷却，加10%氯化钾溶液0.4ml 与0.1%二苯胺硫酸溶液0.1ml，摇匀，缓缓滴加硫酸 5ml，摇匀，将试管于50℃水浴中放置15分钟，溶液产生的蓝色与标准硝酸盐溶液[取硝酸钾0.163g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，精密量取1ml，加水稀释成100ml，再精密量取）0.3ml，加无硝10ml，加水稀释成100ml，摇匀，即得（每1ml相当于1μg NO3酸盐的4.7ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0.000006%）。
2.3 亚硝酸盐取本品10ml，置纳氏管中，加对氨基苯磺酰胺的稀盐酸溶液（1→100）1ml与盐酸萘乙二胺溶淮（0.1→100）1ml，产生的粉红色，与标准亚硝酸盐溶液[取亚硝酸钠0.750g（按干燥品计算），加水溶解，稀释至100ml，摇匀，精密量取1ml，加水稀释成100ml，摇匀，再精密量取1ml，加水稀释成）]0.2ml，加无亚酸盐的水9.8ml，用50ml，摇匀，即得（每1ml相当于1ugNO2同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0.000002%）。
2.4氨取本品50ml，加碱性磺化汞钾试液2ml，放置15分钟；如显色，与氯化铵溶液（取氯化铵31.5mg，加无水氨水适量使溶解并稀释成1000ml）1.5ml，加无氨水48ml与碱性磺化钾试液2ml制成的对照液比较，不得更深（0.00003%）。
2.5 电导率应符合规定（通则0681）2.6 总有机碳不得过0.50mg/L（通则0682）。
2.7 易氧化物取本品100ml，加稀硫酸10ml，煮沸后，加高锰酸钾滴定液（0.02mol/L）0.10ml，再煮沸10分钟，粉红色不得完全消失。
37纯化水监测操作规程
有限公司纯化水监测操作规程XY1-Z1-371目的：制订纯化水监测操作方法，对从事测试的工作人员进行培训指导，按操作方法操作。
2.范围：本方法适用于工艺用水纯化水的取样监测。
3.术语和定义：无4.职责：质量部负责实施。
5.内容:5.1仪器电热恒温鼓风干燥箱、净化工作台、压力蒸汽灭菌器、紫外分光光度计，电热恒温培养箱、PH计、电炉、电子天平、电热恒温水浴锅、电导率仪。
5.2磨砂口烧瓶（IOOOm1）.具塞三角烧瓶（50Om1）、移液管、比色管、三角烧瓶、量筒、培养皿、烧杯等。
5.3取样容器的准备5.3.1灭菌500m1具塞三角烧瓶（微生物试验取样用）：按如下方法灭菌：置手提式压力蒸汽消毒器内121°C20分钟高压灭菌；灭菌结束移入105±1°C的电热恒温鼓风干燥箱烤干，冷却后用于微生物试验取样。
5.3.2微生物实验取样方法：5.3.3微生物试验,取样人带上洁净手套，取样前先75%酒精等消毒剂消毒取水口，并打开水龙头放水约Imin后，揭开取样瓶的三角塞，在出水口，按正常流水量取样。
5.3.4检验纯化水中需氧菌总数是否达到要求，纯化水：WIooCfU/m1为合格。
5.3.5取样量：微生物试验：250OmI5.3.6在容器上标明取样名称、取样日期、取样人、取样点。
5.4化学性能取样容器的准备5.4.1IOOOm1试剂瓶或具塞磨砂口三角烧瓶：洗净、干燥5.4.2化学性能实验取样方法：化学试验用取样时，试剂瓶用工艺用水清洗3次后，按正常流水量取样5.4.3取样量：化学试验：⅛1000m1o5.4.4在容器上标明取样名称、取样日期、取样人、取样点。
5.4.5检验纯化水中的外观、气味、电导率、酸碱度、硝酸盐、亚硝酸盐、氨、易氧化物、不挥发物、重金属是否符合要求。
6.5微生物实验取样、化学性能实验取样频率：用水点每月每个点至少监测一次，送水口、回水口、储水罐每周一次全性能检测，化学性能每日检测需监测纯水罐的电导率、酸碱度、性状项目，发现问题及时上报整改，并做好记录。
纯化水臭氧灭菌验证
臭氧消毒验证纯化水系统消毒和臭氧发生器的杀菌能力验证消毒：制备大概300L的纯化水，储存在储水罐中，打开纯水罐，开动臭氧消毒器进行管道消毒，并进行臭氧发生器循环时间验证。
验证结束后关闭臭氧发生器和纯水泵，将纯水罐和循环管道里的水排尽，然后再制300L，打开纯化水泵循环，边循环边将纯水罐和循环管道里的水排干，如此循环，直至用水点取样的水电导率与消毒前一致。
（1）杀菌前后，通过检测水中臭氧浓度检测臭氧发生器的杀菌能力。
在纯化水系统运行情况下，取样，然后打开臭氧发生器循环60、90、120分钟后取样，分别测试结果。
臭氧发生器开启后杀菌循环时间有确定，确定储水罐有足够循环的纯化水，打开臭氧发生器进行循环。
分别在60、90、120分钟时在总送水口、总回水口、洁具间、检验室、清洗间、浓配间、洗衣间取样，检验水中臭氧浓度，以确定臭氧消毒最强佳时间。
（2）消毒效果标准：按照卫生部《消毒技术规范》关开臭氧消毒的规定，对于二级反渗透制备的纯化水用臭氧消毒，要达到消毒效果需保证水中臭氧浓度达到0.1~0.5mg/L，维持5~10分钟。
（3）操作步骤：①把臭氧发生器的开启时间设定为2个小时；②把臭氧发生器的开关度确定为100%；③打开臭氧发生器，并开启计时准备取样检验。
臭氧浓度取样点杀菌前循环60分钟循环90分钟循环120分钟测试结果结论总出水口总回水口纯水罐洗衣间洁具间检验室清洗间（4）测试到臭氧浓度达到消毒效果所需浓度（0.5mg/L）后，确定该时间加上25分钟为正常管道臭氧消毒时间，浓度达到后继续循环20分钟，并且按次序打开各个用水点阀门，最少5分钟进行消毒。
（5）臭氧消毒周期的确定：臭氧消毒周期确定为一个质监控周期。
检查人：日期：复核人：日期：（6）冲洗：运行设备进行制水，水量足够后打开纯水泵循环，同时打开储水罐下部排水阀，次序找开各个用水点阀门（最少5分钟），排放罐内循环水；重复上述操作直到各用水点水的电导率与纯化水的电导率一致。
纯化水内控质量标准
需氧菌总数：≤100CFU/ML
类别
溶剂、稀释剂
贮藏臭，无味。
酸碱度
本品10ml，加甲基红指示液2滴，不得显红色。
本品10ml，加溴麝香草酚蓝指示液5滴，不得显蓝色。
硝酸盐
取本品5ml与标准硝酸盐溶液0.3ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0.000006%）
亚硝酸盐
取本品10ml，与标准亚硝酸盐溶液0.2ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0.000002%）
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NO
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修订编号
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版本
页次
1
2022-02-21
-
新制订
A0
核准
审核
制订
1
依据 2015 年版《中国药典》二部，制订纯化水内控质量标准，保证安全产品的实现。
2.
适用于质量管理部及生产管理部对纯化水的监督检查、使用及管理。
3.
质量管理部负责纯化水的检验与质量控制。
4.
检验项目
氨
本品50ml，与氯化铵溶液1.5ml制成的对照液比较，不得更深（0.00003%）
易氧化物
本品100ml，加稀硫酸10ml，煮沸后加高锰酸钾滴定液（0.02mol/L）0.10ml，煮沸10分钟，粉红色不得完全消失。
不挥发物
本品100ml，水浴蒸干，105℃干燥至恒重，遗留残渣应≤1mg。
重金属
本品50ml，加水18.5ml蒸发至20ml与标准铅溶液1.5ml加水18.5ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0.00001%）
水的微生物检验规程
1 目的
建立水的微生物限度的检测规程。
从而有效地控制生产用水的质量。
2 范围
本规程适用于我司所有用水的微生物检测。
3 职责
3.1 设备部负责纯化水的制备和消毒工作。
3.2 实验室实验员负责水的微生物检验工作。
4 检测程序
4.1 检测仪器：
高压蒸汽灭菌器；生化培养箱；冰箱；恒温水浴锅；放大镜；75%酒精棉；镊子；置于高压蒸汽灭菌器中121℃进行30分钟灭菌后的三角烧瓶、不锈钢过滤器、100mL量筒；φ9cm无菌平皿
4.2 检测用培养基的制备
取R2A琼脂培养基，根据试验需要，按培养基配制的比例要求溶于三角烧瓶后，用瓶塞盖上，将其放入高压蒸汽灭菌器进行灭菌，无菌操作法倒入平皿中，待冷却后置于培养箱中培养48小时，确定无菌生长后使用。
4.3 纯化水样品采集：
4.3.1 每周一次对纯化水进行检测
4.3.2 取11个灭菌的带盖的三角烧瓶，分别用记号笔标注出水口编号，依次标为A1至A11出水口，如
下表：。
水-中-细-菌-总-数及大肠菌群的检测方案
水中细菌总数的检测及大肠菌群的测定一、实验的目的要求1、学习并掌握水的细菌学检测方法2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。
二、实验原理细菌总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。
细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标。
我国现行的生活饮用水标准检验方法GB5750—85规定水样中细菌总数测定是1ml水样在普通营养琼脂培养基中37℃经24小时培养所生长的细菌菌落的总数。
所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染，但不能说明污染的来源。
因此必须结合总大肠菌群数来判断水污染的来源和安全程度。
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
平板菌落计数法的优点：能测出样品中的活菌数。
此法常用于某些成品和生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。
缺点：手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。
生活饮用水细菌卫生标准我国饮用水卫生标准：≤3个大肠菌群/1L饮水，≤100个细菌总数/1ml饮水三、实验仪器和材料(三)实验器材(1) 菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
(2)大肠菌群的测定；1)培养基：伊红美蓝琼脂培养基：蛋白胨10g，乳糖10g， K2HP042g， 2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。
制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
《中国药典》2015年版纯化水质量检验操作规程
本品为饮用水蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的制药用水，不含任何添加剂。
1、性状：本品为无色的澄明液体；无臭。
2、检查：2.1酸碱度取本品10ml，加甲基红指示液2滴，不得显红色；另取10ml，加溴麝香草酚蓝指示液5滴，不得显蓝色。
2.2 硝酸盐取本品5ml置试管中，于冰浴中冷却，加10%氯化钾溶液0.4ml 与0.1%二苯胺硫酸溶液0.1ml，摇匀，缓缓滴加硫酸 5ml，摇匀，将试管于50℃水浴中放置15分钟，溶液产生的蓝色与标准硝酸盐溶液[取硝酸钾0.163g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，精密量取1ml，加水稀释成100ml，再精密量取）0.3ml，加无硝10ml，加水稀释成100ml，摇匀，即得（每1ml相当于1μg NO3酸盐的4.7ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0.000006%）。
2.3 亚硝酸盐取本品10ml，置纳氏管中，加对氨基苯磺酰胺的稀盐酸溶液（1→100）1ml与盐酸萘乙二胺溶淮（0.1→100）1ml，产生的粉红色，与标准亚硝酸盐溶液[取亚硝酸钠0.750g（按干燥品计算），加水溶解，稀释至100ml，摇匀，精密量取1ml，加水稀释成100ml，摇匀，再精密量取1ml，加水稀释成）]0.2ml，加无亚酸盐的水9.8ml，用50ml，摇匀，即得（每1ml相当于1ugNO2同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0.000002%）。
2.4氨取本品50ml，加碱性磺化汞钾试液2ml，放置15分钟；如显色，与氯化铵溶液（取氯化铵31.5mg，加无水氨水适量使溶解并稀释成1000ml）1.5ml，加无氨水48ml与碱性磺化钾试液2ml制成的对照液比较，不得更深（0.00003%）。
2.5 电导率应符合规定（通则0681）2.6 总有机碳不得过0.50mg/L（通则0682）。
2.7 易氧化物取本品100ml，加稀硫酸10ml，煮沸后，加高锰酸钾滴定液（0.02mol/L）0.10ml，再煮沸10分钟，粉红色不得完全消失。
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纯化水中需氧菌总数检测方法
纯化水微生物限度检测
计数方法适用性试验
1. 供试液制备
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均勻加热，且温度不应超过45#C 。
供试液从制备至加人检验用培养基，不得超过1小时。
常用的供试液制备方法如下。
如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。
(1)水溶性供试品取供试品，用PH7.0无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液，或PH7.2磷酸盐缓冲液，
或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。
若需要，调节供试液pH值至6?8。
必要时，用同一稀释液将供试液进一步1 0倍系列稀释。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2. 接种和稀释
按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。
所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。
为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。
(1)试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混勻，使每lm l供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。
(2 )供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。
(3)菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加人试验菌液并进行微生物回收试验。
若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试%液进行进一步的处理。
如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加人试验菌悬液进行方法适用性试
验。
供试品检查
检验量检验量即一次试验所用的供试品量(g、m l或cm2) 。
一般应随机抽取不少于2 个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2; 贵重药品、微量包装药品的检
验量可以酌减。
检验时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供品，大蜜丸还不得少于4 丸，膜剂还不得少于4 片。
供试品的检査
按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。
阴性对照试验以稀释液代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长，如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调査。
1. 平皿法
平皿法包括倾注法和涂布法。
除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2 个平板。
培养和计数除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30?35°C培养3?5 天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20?25°C培养5?7 天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。
菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。
点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。
菌数报告规则需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于lOOcfu的稀释级，作为菌数报告的依据。
取最髙的平均菌落数，ij*算lg 、lm l或10cm2供试品中所含的微生物数，取两位4 效数字报告。
如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1 时，以< 1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
2. 薄膜过滤法
除另有规定外，按计数方法适用性试验确认的方法进行供试液制备。
取相当于l g 、lm
l或10cm2供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照
方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。
培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每张滤膜上的菌落数应不超过lOOcfu苗数报告规则以相当于lg 、lm l或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以< 1 报告菌数（每张滤膜过滤lg 、lm l或10cm2供试品），或< 1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
3. MPN 法
取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和供试品接种，所有试验管在30?35X：培养3?5天，如果需要确认是否有微生物生长，按方法适用性试验确定的方法进行。
记录每一稀释级微生物生长的管数，从表3 査每l g 或lm l供试品中需氧菌总数的最可能数。
结果判断
需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数(包括真菌菌落数霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数(包括细菌菌落数）。
若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氣霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基)进行霉菌和酵母菌总数测定。
使用选择性培养基时，应进行培养基适用性检查。
若采用M P N法，测定结果为
需氧菌总数。
各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：
lO ^ fu：可接受的最大菌数为20;
102cfu：可接受的最大菌数为200;
103cfu：可接受__________的最大菌数为2000，依此类推。
若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检査结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。
稀释液、冲洗液及培养基
见非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法。