280kda转膜条件
10kd蛋白转膜条件
10kd蛋白转膜条件
10kd蛋白转膜通常需要以下条件：
1. 准备一个合适尺寸的蛋白电泳凝胶。
一般来说，10%聚丙烯酰胺凝胶适合分子量在10kd左右的蛋白质。
2. 将样品加载到凝胶上进行电泳。
3. 电泳结束后，将凝胶固定在转膜装置上。
4. 准备转膜缓冲液。
常用的缓冲液包括Tris-glycine缓冲液或Tris-Tricine缓冲液等，pH一般在8.3左右。
5. 将转膜缓冲液加入转膜装置中，确保凝胶完全覆盖。
6. 将转膜装置连接到电源上，并设置合适的转膜条件。
转膜条件包括电压和时间。
一般来说，电压为100V至200V，时间为1至2小时。
7. 转膜完成后，将膜从凝胶上剥离，并进行后续的免疫检测或其他实验操作。
请注意，以上是一般的转膜条件，具体的转膜条件可能会因实验目的、样品特性和实验室设备等因素而有所不同。
在进行转膜实验前，建议查阅相关文献或咨询实验室的专家以获取更准确的转膜条件。
wb转膜条件公式
wb转膜条件公式（原创实用版）目录1.WB 转膜的定义和目的2.WB 转膜的常用方法3.WB 转膜的条件公式4.WB 转膜的注意事项5.总结正文一、WB 转膜的定义和目的WB（Western Blot）转膜，又称为免疫印迹转膜，是一种将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）转移到固相支持物上的技术。
其主要目的是为了将电泳分离得到的蛋白质样品，转移到固相载体上，以便于进行后续的免疫学检测和分析。
二、WB 转膜的常用方法WB 转膜常用的方法有以下几种：1.湿式转膜：湿式转膜是最常用的 WB 转膜方法，其主要原理是利用电场和分子渗透作用，将蛋白质从凝胶中转移到固相载体上。
2.干式转膜：干式转膜则是通过暴露于干燥的气氛中，使得凝胶中的蛋白质与固相载体上的抗体结合，然后再进行洗涤和检测。
3.半干式转膜：半干式转膜则是湿式转膜和干式转膜的结合，一部分采用湿式转膜，一部分采用干式转膜。
三、WB 转膜的条件公式在进行 WB 转膜时，需要控制的条件包括：1.转膜缓冲液：转膜缓冲液的 pH 值、离子强度和蛋白酶抑制剂的浓度等，都会影响到蛋白质的转膜效果。
2.转膜时间：转膜时间过长或过短，都会影响到蛋白质的转膜效果。
3.转膜温度：转膜温度一般控制在 12-18℃，温度过高或过低都会影响到蛋白质的转膜效果。
4.固相载体：固相载体的选择和处理，也会影响到蛋白质的转膜效果。
四、WB 转膜的注意事项在进行 WB 转膜时，需要注意以下几点：1.保持实验操作的无菌性，以防止细菌污染。
2.选择合适的转膜时间和温度，避免过度转膜或转膜不足。
3.选择合适的固相载体，并正确处理和封闭。
4.使用高质量的转膜缓冲液，避免缓冲液中蛋白酶的干扰。
五、总结WB 转膜是蛋白质研究中常用的技术，其操作需要注意控制转膜缓冲液、转膜时间、转膜温度和固相载体等条件。
细胞总蛋白的制备, SDS-PAGE,Western Blot
医学生物学研究技术与实验实验报告实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot一、实验目的1. 掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术二、实验原理1. 蛋白质提取常见裂解方法极其原理。
蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。
血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。
细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。
膜蛋白的抽提比较复杂。
膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。
外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。
固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏水性尾部结合。
在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。
较为理想的增溶剂是去垢剂。
目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。
增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。
纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。
抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水解酶活力，以减少细胞的自溶过程。
主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。
常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。
2. Lowry法测定蛋白质浓度1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物；2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线3.SDS-PAGE分离蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。
40kd蛋白转膜条件
40kd蛋白转膜条件
40KD蛋白转膜条件取决于所使用的蛋白转印装置和蛋白的性质。
一般来说，以下是一般的40KD蛋白转膜条件：
1. 准备转膜液：常用的转膜液包括常规转膜缓冲液（如Tris-Glycine缓冲液）和含有甲醇的转膜缓冲液（如Tris-Glycine-Methanol缓冲液）。
根据蛋白的性质，可以调整转膜液的含
甲醇浓度。
2. 准备蛋白：蛋白负载量对转膜效果有影响，通常使用约1-
2μg的蛋白。
3. 准备膜：使用适合的膜材料，如聚丙烯酰胺（PVDF）或硝
酸纤维素（NC）膜，并根据蛋白的分子量选择合适的孔径大小，对于40KD蛋白，一般选择0.2μm的孔径。
4. 装配转膜装置：根据装置的说明书安装转膜蛋白电泳细胞，确保膜材料正确安装在膜架上，并在该架上放置滤纸和发泡垫，并用蛋白转膜缓冲液充满转膜槽。
5. 转膜：将装载了蛋白样品的凝胶对准转膜槽，并将其放置在转膜装置中。
进行电泳转膜，根据转膜装置的说明书设置适当的电流和时间。
对于40KD蛋白，通常使用大约100-200mA
的电流，持续1-2小时。
6. 转膜结束后，将膜取出，可以进行染色、免疫检测、膜反应等进一步实验步骤。
需要注意的是，这只是一般的40KD蛋白转膜条件，具体的操作步骤和条件可能因实验目的、蛋白性质和仪器设备的不同而有所调整。
所以请在具体操作前参考相关文献和仪器说明书，并根据实验需要进行优化。
WB实验
步骤：样品制备1．培养细胞或药物处理。
2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞3次，去尽残留液体，可以将培养瓶倒置，下面放吸水纸或者干棉花。
3．加入1% SDS裂解液(我们用的是200ulRIPA,，注意整个装RIPA 的EP管先前需要加入10ul的PMSF.)(6-well plate(6孔板), 100 μl /w；75 cm2 plate, 500-1000 μl/瓶)，冰上静置5min后，用枪头折弯或者细胞刮刮落细胞，转移到Ep管。
注意：蛋白提取必须冰上操作，以免蛋白降解，先把细胞培养瓶放冰上预冷（裂解目的是使细胞膜破裂，蛋白可以释放）。
(此时可以-20℃保存，4-6步可以做WB当天再做)4．超声功率10%，10~15秒间歇20秒，剪切DNA以减低样品粘性，到蛋白尽量澄清。
5．离心12000g, 5 min，取上清。
6．煮沸样品5 min。
制胶槽前一天，清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，用洗洁精将板洗净。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
1）玻璃板对齐后放入制胶架中卡紧，即旋转到1.0（一定要对齐，以免漏胶，最好双人操作，一人用力往下压，卡紧后一定要用梳子先试一下，看是否能插入，调节一下。
否则配浓缩胶后插梳子很无奈）。
然后垂直卡在夹子上准备配胶。
2）配胶：先配分离胶，再配浓缩胶。
（物品大部分在新冰箱4度，用完最好尽快拧紧放回）插太深，防止枪头壁上粘太多，TEMED加后凝固很快，并且凝固时间和温度关系很大，换句话说，冬天TEMED加的要多些。
3）按前面方法配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，用枪多次吸取1ml胶沿玻璃放出，待胶面升到制胶架？？？？高度时即可，给积层胶留出足够空间（梳齿长再加1cm）。
然后胶上加一层无水酒精，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。
WB实验简介PPT课件
一、收集蛋白样品(Protein sample preparation)
1.蛋白样品选择是否合适。(组织 细胞的表达特异性)
2.蛋白样品的处理时候合适。(刺 激效果是否达到)
3.蛋白样品的验证是否可靠。(包 括浓度，样品有没有降解等)
样品制备中用到的试剂
甘油：主要起沉降作用，让你在上样的时候不飘到孔外。
过三维网状结构的胶，由于蛋白分子的大小不同，质量不同，导致 它的迁移率不同，最终跑胶介绍会呈现分子量的一个梯状条带，分 子量大的跑的越慢。
浓缩胶：浓度比较低（4%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺），里面的孔 径也比较大，所有的蛋白都能够在进入分离胶之前在同一水平线上
分离胶：浓度比较大（>10%），里面胶孔径也比较小，这样施加电 压的时候小的蛋白可以穿过孔跑到下面去，而分子量大的蛋白就可 能被拦住，所以能呈现分子量不同的梯度。
丽春红染色的实例
四、封闭(Blocking)
作用：用其他蛋白填满膜上无蛋白的部分空隙，以免孵抗体的时候一抗二 抗与之结合，产生非特异条带或者是背景杂乱。
步骤：转膜完毕后，丽春红染色之后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的 TBST中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的丽春红染液。从转膜完毕起，以后 所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景 。加入封闭液（5%脱脂奶粉），在水平摇床上缓缓摇动，室温封闭1-2小 时。
SDS：导致蛋白质变性，易于蛋白结合，形成易溶于水的复 合物。
β-mercaptoethanol：作为还原剂，打开二硫键，使蛋白质的 四级或三级结构被破坏，使蛋白成为寡氨基酸链。以与二硫 苏糖醇（DTT）或三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）互换使 用
溴酚蓝：作为一种指示剂，成蓝色，只是我们样品跑胶的一 种程度。
WB实验技术手册
1、根据检测蛋白的位置选择合适的裂解 buffer：
蛋白位置
推荐 buffer
全细胞
NP-40 或 RIPA
胞浆（可溶性蛋白）
Tris-HCl
胞浆（骨架结合蛋白）
Tris-Triton
膜蛋白
NP-40 or RIPA
核蛋白
RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白
RIPA or 线粒体分离试剂盒
线粒体/细胞浆蛋白分离试剂：该试剂盒提供独特的试剂可从多种哺乳 动物细胞（包括凋亡和非凋亡细胞）中分离出线粒体部分和胞浆部分，得 到的蛋白保持了原有的生物学活性，可直接用于分析线粒体组份在胞浆和 线粒体中分布的变化，如：WB，ELISA 等。操作过程简单、方便，不使用 有毒的物质，无需超速离心。该试剂盒也可用于分离完整的线粒体架构。
积。分装然后保存在-20°C
注意：在煮沸过程中液体体积避免变化太大，可加瓶盖以免溶液过渡蒸发。需
在通风橱中操作。溶液变黄后即丢弃。
相关产品信息
目录号
产品描述
ab65621
Protease Inhibitor Cocktail (Aprotinin,Leupeptin,Pepstatin A,PMSF)
电泳时间： 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或 者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当 分离后即可停止电泳。
二、转膜
杂交膜是 WB 进行的介质，选择合适的、高质量的杂交膜对整个 WB 的实验是非常重要和关键的。可以根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，
选择合适的膜类型。
021-61130227/8/9
６
我要抗体 51AB
51AB 无忧抗体
10%分离胶的电泳和转膜条件
10%分离胶的电泳和转膜条件
10%分离胶的电泳和转膜条件如下：
电泳条件：
1. 电源：采用恒压或恒流的电源，电压根据分离胶的厚度和电泳槽的体积而定，一般设置为60\~100V。
2. 温度：电泳过程应保持恒温，温度过高可能导致凝胶溶化，电泳速率降低；温度过低则可能导致电泳时间延长，对电泳效果产生影响。
3. 缓冲液：使用适当的电泳缓冲液，以保证电泳的稳定性和分离效果。
4. 凝胶浓度：10%分离胶的凝胶浓度为10%，适合分离相对分子量较大的蛋白质。
5. 电场强度：电场强度越高，电泳速率越快，但过高的电场强度可能导致凝胶溶化和电泳条带变形。
转膜条件：
1. 转膜方法：常用的转膜方法包括湿转法和半干转法。
湿转法操作简单，转移效率高，但需要使用昂贵的硝酸纤维素膜；半干转法适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少，但操作相对复杂。
2. 转膜缓冲液：通常使用含有甲醇、甘氨酸和Tris等成分的转膜缓冲液，根据具体实验条件调整配方。
3. 转移时间：根据蛋白大小和所需的转移效率而定，一般小分子蛋白的转移时间较短，大分子蛋白的转移时间较长。
4. 电流密度：电流密度越高，转移效率越高，但过高的电流密度可能导致蛋白烧伤和膜破裂。
5. 温度：保持恒温的转移温度，温度过高可能导致蛋白丢失和膜溶化；温度过低则可能导致转移效率降低。
蛋白电泳预制胶（HEPES Tris-Glycine）说明书
蛋白电泳预制胶（HEPES/Tris-Glycine）说明书【产品名称】蛋白电泳预制胶（HEPES/Tris-Glycine）【产品介绍】四正柏提供HEPES和Tris-Glycine两种凝胶体系的蛋白电泳预制胶，常用于PAGE和Western Blot检测。
采用自动化的灌胶生产技术，确保了产品质量的高稳定性和重复性采用玻璃胶板，有效减少蛋白非特异性吸附，使蛋白条带更为尖锐，清晰胶夹打开极为轻松，只需用刀片在胶夹一侧轻轻一划即可打开凝胶中不含SDS,可用于变性和非变性电泳兼容市场上主流的mini电泳槽，如BIORAD,Invitrogen,天能和君意东方等提供多种浓度的均一胶和梯度胶均一胶可选浓度：6%，7.5%，8%，10%，12%，15%梯度胶可选浓度：4-12%，4-15%，4-20%，8-16%，8-20%【基本信息】预制胶板尺寸：长98mm，宽84mm，厚度4.1mm预制胶尺寸：长81mm，宽74mm，厚度1.5mm浓缩胶：4%，1.5cm丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺的比例：29:1包装规格：10片/盒【储存条件及有效期】1.HEPES体系预制胶2~8℃冷藏，不可冷冻，保质期18个月2.Tris-Glycine体系预制胶2~8℃冷藏，不可冷冻，保质期12个月3.常温运输4.冬季，泡沫盒保温运输【HEPES和Tris-Glycine两种体系蛋白电泳预制胶比较】参数Hepes-Tris体系预制胶Tris-Glycine体系预制胶分辨率高中等电压及电泳时间150V，40-50min180V，60min电泳缓冲液提供变性或非变性蛋白专用电泳缓冲液普通Tris-Glycine缓冲液（需自行配制或另购）【订购信息】1.HEPES体系预制胶产品编号浓度孔数最大上样量电泳缓冲液转膜缓冲液分离范围变性非变性4APA034H-060TS4APA034H-060TN6%1060μl30-300KDa4APA034H-060FS4APA034H-060FN1530μl4APA034H-075TS4APA034H-075TN7.5%1060μl40-200KDa4APA034H-075FS4APA034H-075FN1530μl4APA034H-080TS4APA034H-080TN8%1060μl40-200KDa4APA034H-080FS4APA034H-080FN1530μlHepes-trisTris-glycine4APA034H-100TS 4APA034H-100TN 10%1060μl 20-160KDa 4APA034H-100FS 4APA034H-100FN 1530μl 4APA034H-120TS 4APA034H-120TN 12%1060μl 10-85KDa 4APA034H-120FS 4APA034H-120FN 1530μl 4APA034H-150TS 4APA034H-150TN 15%1060μl 10-50KDa 4APA034H-150FS 4APA034H-150FN 1530μl 4APA034H-412TS 4APA034H-412TN 4-12%1060μl 15-200KDa 4APA034H-412FS 4APA034H-412FN 1530μl 4APA034H-415TS 4APA034H-415TN 4-15%1060μl 10-200KDa 4APA034H-415FS 4APA034H-415FN 1530μl 4APA034H-420TS 4APA034H-420TN 4-20%1060μl 3.5-200KDa 4APA034H-420FS 4APA034H-420FN 1530μl 4APA034H-816TS 4APA034H-816TN 8-16%1060μl 5-5200KDa 4APA034H-816FS 4APA034H-816FN 1530μl 4APA034H-820TS 4APA034H-820TN 8-20%1060μl 6.5-200KDa4APA034H-820FS 4APA034H-820FN1530μl产品编号浓度孔数最大上样量电泳缓冲液转膜缓冲液分离范围4APA034G-060T 6%1060μl Tris-Glycine Tris-Glycine60-200KDa4APA034G-060F 1530μl 4APA034G-075T 7.5%1060μl 50-200KDa 4APA034G-075F 1530μl 4APA034G-080T 8%1060μl 40-200KDa 4APA034G-080F 1530μl 4APA034G-100T 10%1060μl 20-160KDa 4APA034G-100F 1530μl 4APA034G-120T 12%1060μl 15-85KDa 4APA034G-120F 1530μl 4APA034G-150T 15%1060μl 10-50KDa4APA034G-150F 1530μl 4APA034G-412T 4-12%1060μl 20-200KDa 4APA034G-412F 1530μl 4APA034G-415T 4-15%1060μl 20-200KDa 4APA034G-415F 1530μl 4APA034G-420T 4-20%1060μl 5-200KDa 4APA034G-420F 1530μl 4APA034G-816T 8-16%1060μl 10-200KDa4APA034G-816F 1530μl 4APA034G-820T 8-20%1060μl 3-200KDa4APA034G-820F1530μl【电泳操作说明】电泳缓冲液：Hepes 凝胶体系预制胶每盒赠送10包变性蛋白或非变性蛋白电泳缓冲液粉末，每包粉末可用500ml ddH 2O（去离子水）进行溶解，得到500ml 1×电泳液。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
280kda转膜条件
将蛋白质转移到膜上是生物化学和分子生物学研究中常见的实
验步骤之一。
在转膜过程中，蛋白质从凝胶中转移到固体膜上以便
进行后续的检测和分析。
对于较大分子量的蛋白质（如280 kDa），通常需要使用较长时间和较高的电场强度来完成转膜过程。
转膜条件通常包括以下几个方面：
1. 凝胶类型，根据实验需要选择合适的凝胶类型，如SDS-PAGE凝胶或者非变性凝胶。
2. 转膜缓冲液，常用的转膜缓冲液包括Tris-甘氨酸缓冲液（TGS）或者Tris-甘氨酸-SDS缓冲液（TGS-SDS）。
这些缓冲液可
以提供适当的离子强度和pH条件，有利于蛋白质的转移。
3. 蛋白质转移时间和电场强度，对于较大分子量的蛋白质，通
常需要较长时间的转膜（如1-2小时或更长），以及较高的电场强
度（通常在100 V至200 V之间）来完成转移过程。
4. 膜类型，选择合适的转膜膜材料，如聚偏氟乙烯（PVDF）膜
或硝酸纤维素膜（NC膜），以确保蛋白质能够牢固地附着在膜上。
在进行转膜实验时，需要根据具体的实验条件和样品特性进行优化和调整。
此外，还需要注意转膜过程中的温度控制、电极排列和蛋白质的稀释等因素，以确保转膜过程的顺利进行和蛋白质的高效转移。
最后，在转膜完成后，还需要对转膜膜进行染色或者免疫检测等后续步骤，以获取所需的实验结果。