10kd蛋白转膜条件
western转膜条件
western 转膜条件蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70 KDWB用膜类型、孔径：0.45 NC转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA 转膜时间：60~90 minPS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min 就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。
蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin & AKT 蛋白分子量：65 KD & 56 KDWB用膜类型、孔径：0.45 PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100 V转膜时间：60~70 min设备名字是“ Bio-Rad mini ”。
蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KDWB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12 V 转膜时间：30-40 min 设备：“ Bio-Rad mini ” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。
蛋白来源：293T 细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95 KD & 35 KDWB用膜类型、孔径：PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90 V-110 V ，控制电流不要超过300 mA。
转膜时间：70 min蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min转膜设备：湿转Bio-Rad说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。
WB常见问题的解答
Western Blot详解Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项
WesternBlot实验方法及注意事项实验原理：WesternBlot印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。
如果转印膜上含有靶蛋白，经X光片曝光、显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。
实验材料：分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、1×Tris・Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物、1×SDS电泳缓冲液、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件、0.75mm封边垫片、0.75mm样品梳子、50μl微量加样器、恒流电源常用试剂：1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。
小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
2）4×Tris・Cl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至8.8,补加H2O至体积500ml。
用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
3）4×Tris・Cl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至6.8,补加H2O至体积100ml。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）
献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）上回说到如何进行蛋白质的样品制备、蛋白质定量及 SDS－PAGE 电泳，如果你还没看过，点此详见：《献给初学者：western blot 操作步骤详解（上）》。
下面就跟大家讲讲接下来的步骤。
四、转膜我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。
对于转印90 kd 以下的蛋白，转膜液都不用加SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037% 的 SDS。
1.在电泳结束前20 min 开始准备转膜所需的东西。
转一张膜需准备 6 张的滤纸（长一般为 8.1~8.3 cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁 8 cm 就行）和 1 张 PVDF 膜。
切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。
PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1 min~2 min。
目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
2.将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。
除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。
也可取10 ml 注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。
取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。
之后有两种方法供选择，一是按照marker 指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。
在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF 膜和滤纸，平衡10 min 左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。
3.带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3 张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜（此时可在PVDF 右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外3 张浸泡过缓冲液的滤纸。
大蛋白转膜条件
大蛋白转膜条件
大蛋白转膜是一种常用的蛋白质分离与浓缩方法，可以通过电压驱动将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
以下是常用的大蛋白转膜条件：
1. 凝胶类型：常见的凝胶类型包括聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）和琼脂糖凝胶（agarose gel）等。
根据
蛋白质的大小，选择合适的凝胶浓度和孔隙大小。
2. 转移缓冲液：转移缓冲液的选择取决于凝胶类型和蛋白质性质，常用的转移缓冲液成分包括Tris（pH 8.3-9.5）、甲胺基
乙烷磺酸（MES）、磷酸盐缓冲液等。
同时，可以添加适量
的SDS（Sodium dodecyl sulfate）来增加蛋白质的负电荷。
3. pH 值：转移缓冲液的 pH 值选择取决于目标蛋白的特性。
一般来说，聚丙烯酰胺凝胶转移使用 Tris 缓冲液（pH 8.3-
9.5），琼脂糖凝胶转移使用磷酸盐缓冲液（pH 7.0-8.0）。
4. 电压和时间：电压和时间的选择取决于凝胶类型和蛋白质大小。
常见的电压范围是10-30 V/cm，转移时间通常为1-4 小时。
5. 温度：转移过程可以在室温或低温条件下进行。
室温下的转膜通常速度更快，但低温条件可以减少蛋白质在转移过程中的变性和降解。
总结起来，大蛋白转膜的条件涉及凝胶类型、转移缓冲液的配
方和 pH 值、电压和转移时间，以及转膜温度等因素。
根据具体实验需求和蛋白质性质的不同，可以进行合理的调整。
蛋白转膜条件
蛋白转膜条件蛋白转膜（protein transmembrane）是指膜蛋白从胞浆一侧跨越细胞膜至胞外一侧的过程。
蛋白转膜在细胞中起着至关重要的作用，它参与了细胞内外信号传导、物质转运等多种生物功能。
在研究蛋白转膜过程中，选择合适的条件对蛋白进行转膜操作是至关重要的。
本文将介绍蛋白转膜的条件选择，并以蛋白转膜的经典方法电穿孔和lipofection为例，详细讨论其条件及操作步骤。
蛋白转膜的条件选择是根据所研究蛋白的性质以及转膜方法的原理来确定的。
一般来说，选择合适的转膜条件需要考虑蛋白的分子量、结构特点、理化性质等因素。
另外，对于不同的转膜方法，也需要考虑一些特殊的条件，比如电穿孔需要具备一定的电压、脉冲长度和频率，而lipofection则需要考虑转染试剂（lipofectamine等）的浓度和配比等。
对于蛋白结构较为复杂的情况，传统的电穿孔方法通常难以实现高效的转膜效果，可以考虑使用新一代的磁穿接法（magnetoporation）或微流控技术等方法来实现转膜。
对于高分子量的蛋白，由于其分子尺寸较大，传统的转膜方法效果有限，可以尝试使用特殊的电极和膜片材料，如静电纺丝法、脂质管道法等。
此外，对于具有较高的疏水性的蛋白，传统的lipofection方法往往效果不佳，可以尝试使用膜蛋白融合剂（membrane fusion）法或化学修饰法等。
以经典的电穿孔法为例，蛋白转膜的基本步骤如下：1. 准备电穿孔实验所需材料，包括电穿孔仪、电穿孔膜片、胞外液和胞内液等。
2. 将待转膜的蛋白加入胞内液中，使其达到适当的浓度。
3. 将胞内液注入电穿孔膜片内，确保液体充满整个膜片。
4. 连接电穿孔仪，调整电穿孔参数，如电压、脉冲长度和频率等，以及膜片和电极之间的距离。
5. 将电穿孔膜片放置于仪器中央，开始电穿孔过程。
6. 调整胞外液流速，保持恒定，以保证蛋白转膜的稳定性。
7. 在一定的时间范围内，观察蛋白转膜的效果，可以使用蛋白定量方法，如Western blot等，来检测蛋白的转膜效率。
wb小分子蛋白半干转条件 -回复
wb小分子蛋白半干转条件-回复WB小分子蛋白半干转条件小分子蛋白半干转（Western Blot Semi-Dry Transfer）是一种常用的蛋白转印技术，用于将蛋白质从制备好的凝胶转移到膜上，以便进一步进行免疫印迹分析。
WB半干转法具有时间短、样品消耗少、结果可靠等优点，逐渐成为了实验室中最被推崇的蛋白转印方式之一。
本文将为您一步一步回答关于WB小分子蛋白半干转条件的问题。
第一步：准备工作在开始实验之前，您需要准备以下实验材料以及仪器设备：1. 蛋白凝胶：可以是SDS-PAGE凝胶、Native凝胶或者IEF凝胶等。
2. 转膜设备：一般使用膜构（membrane sandwich）装置。
3. 蛋白质转膜膜：可以选择PVDF膜或者NC膜等，根据需要选择合适的膜材。
4. 电源：选择合适电源以供电转印。
5. 混合溶液：制备半干转膜缓冲液。
第二步：制备半干转膜缓冲液半干转膜缓冲液一般由粗转膜缓冲液（Cathode Buffer）和精转膜缓冲液（Anode Buffer）混合而成。
其中，粗转膜缓冲液可视实验室条件选择具体配方，一般包括Tris-HCl缓冲液、甘油（glycerol）和SDS等成分；精转膜缓冲液包括甘油、Tris-HCl缓冲液以及SDS等。
具体的条件可以从文献中找到或者咨询相关实验室的技术人员。
第三步：装置装配1. 在半干转膜装置上安装内外层的导电网（wick）和滤纸等辅助物质。
内层wick（即离孔层）可以是滤纸或者海绵，而外层wick一般是滤纸。
2. 将内外层wick放置在半干转膜装置的相应位置上。
确保内外层wick与电极完全贴合，且相对平整。
3. 在内层wick上还可以放置一块滤纸，以增加液体的吸收能力。
第四步：蛋白转膜条件确定好实验条件后，即可进行蛋白转膜：1. 首先，在浸泡一段时间的转膜膜上进行标记，将蛋白凝胶与转膜膜定位对齐。
2. 将架于内阴极涂抹有粗转膜缓冲液的内层wick上，确保内外层wick贴合时形成一个平滑的表面。
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10kd蛋白转膜条件
10kd蛋白转膜通常需要以下条件：
1. 准备一个合适尺寸的蛋白电泳凝胶。
一般来说，10%聚丙烯酰胺凝胶适合分子量在10kd左右的蛋白质。
2. 将样品加载到凝胶上进行电泳。
3. 电泳结束后，将凝胶固定在转膜装置上。
4. 准备转膜缓冲液。
常用的缓冲液包括Tris-glycine缓冲液或Tris-Tricine缓冲液等，pH一般在8.3左右。
5. 将转膜缓冲液加入转膜装置中，确保凝胶完全覆盖。
6. 将转膜装置连接到电源上，并设置合适的转膜条件。
转膜条件包括电压和时间。
一般来说，电压为100V至200V，时间为1至2小时。
7. 转膜完成后，将膜从凝胶上剥离，并进行后续的免疫检测或其他实验操作。
请注意，以上是一般的转膜条件，具体的转膜条件可能会因实验目的、样品特性和实验室设备等因素而有所不同。
在进行转膜实验前，建议查阅相关文献或咨询实验室的专家以获取更准确的转膜条件。