二重实时PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(1)概要
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因检测
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因检测赖奋强; 郭庆昕; 杨滨; 郑韵芳【期刊名称】《《中国人兽共患病学报》》【年(卷),期】2019(035)008【总页数】6页(P726-731)【关键词】耐甲氧西林金黄色葡萄球菌; 杀白细胞毒素; 基因分型【作者】赖奋强; 郭庆昕; 杨滨; 郑韵芳【作者单位】福州大学医院福州 350002; 泉州市正骨医院泉州 362000; 福建医科大学附属第一医院检验科福州 350005; 福建卫生职业技术学院福州 350101【正文语种】中文【中图分类】R378.1耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)是全世界范围内的主要公共卫生问题，在美国每年因MRSA感染所致的死亡人数高于艾滋病[1]。
这是由于社区获得性MRSA(Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus，CA-MRSA)的发展所致，也是急诊科中皮肤和软组织感染的主要原因[2]。
然而，分子特征决定CA-MRSA菌株在医院外传播和感染健康人群的能力仍然很差[3]。
细胞溶解肽，α-型苯酚可溶蛋白(Phenol-soluble modulinsα，PSMα)和α-毒素(α-toxin，hla)对CA-MRSA疾病的进展起决定性作用[4-5]，这两种毒力因子并非专门出现在CA-MRSA中，基因表达的差异可部分解释CA-MRSA菌株增强毒力的原因[4]。
值得注意的是许多CA-MRSA菌株携带有编码杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)的lukSF-PVL基因，而其他菌株中lukSF-PVL较少[3]，因此，PVL已被认为是导致CA-MRSA毒力增加的主要因素之一[6]。
1 材料与方法1.1 菌株来源 83株分离菌来自于某综合三甲医院临床各科室送检的痰、血液、伤口分泌物、耳道分泌物、尿液、脓液、无菌体液等标本，经临床微生物室分离鉴定的非重复MRSA菌株；按美国疾病预防控制中心(CDC)的CA-MRSA 定义为：患者在门诊或入院48 h之内分离到MRSA菌株；1年内无住院或与医疗机构接触史；没有留置各种导管及其他穿透皮肤的医用装置[3]，将临床分离的MRSA菌株分成医院获得性MRSA(HA-MRSA)组与CA-MRSA组。
金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析
金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析【摘要】金黄色葡萄球菌是导致多种感染的重要病原体，对其进行准确快速的检验至关重要。
本文首先介绍了金黄色葡萄球菌检验技术的原理，包括典型菌株鉴定和培养特点；其次详细描述了金黄色葡萄球菌检验方法，包括传统和分子生物学技术；接着分析了检验结果的意义和如何应对不同结果；最后探讨了金黄色葡萄球菌检验技术的优势和在临床应用中的意义。
在文章讨论了金黄色葡萄球菌检验技术的发展前景以及其局限性和未来发展方向。
通过本文的介绍和分析，读者将更全面地了解金黄色葡萄球菌检验技术，有助于提高对该病原体的检测与管理水平，促进临床诊疗水平的提升。
【关键词】金黄色葡萄球菌、检验技术、原理、方法、结果分析、优势、临床应用、发展前景、局限性、未来发展方向1. 引言1.1 背景介绍金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，可导致多种感染性疾病，如皮肤感染、败血症等。
因其对抗生素的抗性逐渐增加，使得对其进行有效检验和监测显得尤为重要。
金黄色葡萄球菌检验技术是一种能够快速准确检测金黄色葡萄球菌的方法，对于临床诊断和治疗具有重要意义。
背景介绍的部分主要从以下几个方面展开：介绍金黄色葡萄球菌的基本特征，包括其形态特征、生长条件等；说明金黄色葡萄球菌对人体的危害和致病机制，引出对其进行检验的必要性；介绍目前金黄色葡萄球菌感染的流行状况和抗生素抗性情况，指出对其进行检验的紧迫性；简要介绍当前金黄色葡萄球菌检验技术的发展现状和存在的问题，为后续正文内容做铺垫。
通过背景介绍，读者可以对金黄色葡萄球菌检验技术的研究和应用有一个初步的了解，为后续内容的阐述提供了必要的背景信息。
1.2 研究意义金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，在医疗卫生领域中具有重要的病原检测价值。
对于金黄色葡萄球菌的检测技术的研究意义主要可以从以下几个方面来看：1. 临床诊断：金黄色葡萄球菌是导致各种感染的主要细菌之一，如皮肤感染、呼吸道感染等。
准确检测金黄色葡萄球菌的存在可以帮助医生及时诊断并采取相应的治疗措施，有助于提高治疗效果和减少治疗成本。
多重PCR法检测金黄色葡萄球菌耐药基因及致病毒素基因
ｓｓａ ｔｇ ｎ ａ ｒｅ ｙ ｓａ ｙｏ ｏ ｃ ｓ ａ ｒ ｕ ． ｅ ｈ ｄ ：Ｔ ｅ ｄ ｔ ｃ ｉ ｎ ｏ ｖＬ ｇ ｎ ．ｍｅ Ａ ｇ ｎ ｎ Ｓ Ｔ－ ｅ ｅ ｗｅ ｅ ｉｔ ｎ ｅ ｅ ｃ ｒｉ ｄ ｂ ｔｐｈ ｌｃ ｃ ｕ ｕ ｅ ｓ Ｍ ｔ ｏ ｓ ｈ ｅ ｅ ｔｏ ｆ Ｐ ｅ ｅ ｃ ｅ ｅ ａ ｄ Ｔ Ｓ １ ｇ ｎ ｒ ｃ ｒｉ ｄ ｏ ｔｂ ｌ ｐ ｅ ＣＲ． ｓ ｌ ：８ ｔａｎ ｆｓａ ｈ ｌ ｃ ｃ ｕ ｌ ｅ ｒ ｅ ｅ ｔ ｄ ｍｅ Ａ ｅ ｅ ｗｉ ｌ ｐ ｅ ＣＲ， ａ ｒｅ ｕ ｙ ｍｕ ｔ ｌ ｘ Ｐ ｉ Ｒｅ ｕ ｔ ｓ ４ ｓｒ ｉ ｓ ｏ ｔ ｙｏ ｏ ｃ ａ ｒ ｕ ｗｅ ｅ ｄ ｔ ｃ ｅ ｃ ｇ ｎ ｔ ｍｕ ｔ ｌｘ Ｐ ｐ ｓ ｘ ｓ ｈ ｉ
・
医学检 验 ・
２０ １第 卷 ２ ０ 年 月 ７第 期 １
多重 Ｐ ＣＲ法检测金黄色葡萄球菌耐药基 因 及 致 病 毒素 基 因
王 凤 玲 ， 国 华 ， 英 荣 刘 侯
（ 河北省沧州中西医结合 医院检验科 ， 河北沧州 ０ １０ ） ６０ １
【 要】目的 ： 摘 了解金 黄色 葡萄球 菌 （ 称金 葡菌 ） 药基 因及 所携 带致 病毒 素 基因 Ｐ 与 Ｔ Ｓ － 简 耐 Ｓ Ｔ １的特 点 。 法 ： 方 应用
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药特征
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药特征发表时间：2012-10-31T10:14:31.733Z 来源：《医药前沿》2012年第21期供稿作者：朱青川[导读] 了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药性。
朱青川 (福建省漳州市中医院检验科 363000)【摘要】目的了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药性方法采用纸片扩散法检测MRSA对抗菌药物的耐药分析。
结果MRSA 的检出率为34.13%(43/126),多数菌株具有多重耐药性,但对万古霉素、氯霉素和复方磺胺甲口恶唑较为敏感。
结论MRSA具有多重耐药的特征。
【关键词】葡萄球菌金黄色耐甲氧西林金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(SAU)是临床上常见病原菌,其对抗菌药物的耐药性日趋严重,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现及流行,使得原来用于治疗该类细菌感染的多种抗菌药物, 如β-内酰胺类、酶抑制剂复合抗菌药物及碳青酶烯类药物不再具有疗效。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是医院内感染常见的病原菌之一,检出的MRSA一般呈多重耐药性,增加了治疗困难,已成为日益严重的临床问题。
有关医院内感染中MR-SA研究的报道较多[１-２], MRSA的甲氧西林耐药决定簇(methicillin resistant deter minant,mecA)位于葡萄球菌盒染色体mec(staph ylococcal cassette chromosome mec,SCC mec)上,该结构类似于转座子,可以介导mecA基因游离传播,使敏感的葡萄球菌获得甲氧西林耐药性;部分SCC mec还携带有其他多种耐药基因,是MRSA多重耐药性产生的重要遗传学基础[3-4]。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株来源2005年6月—2006年6月,广州、深圳和湖南省部分地区临床分离的金黄色葡萄球菌(无重复)共126株,分离自126例患者。
其中116例依据2006年9月卫生部颁布的《医院感染管理办法》附则确定为医院内获得性感染。
金黄色葡萄球菌的耐药机制研究现况
金黄色葡萄球菌的耐药机制研究现况近年来，耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)感染的耐药率和多重耐药菌株不断增长，导致临床抗感染治疗难度增加。
金黄色葡萄球菌是引起化脓性感染和医院感染的常见病原菌。
数十年来，由于细菌的进化和抗生素的滥用，该菌的耐药性逐渐增强，特别是甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌。
为了及时了解该菌的耐药情况，本文从分子水平阐明了其对几种常见抗菌药物耐药机制，对于医务人员从分子生物学角度对临床耐药性加以研究，治疗金黄色葡萄球菌引起的感染，指导临床合理用药，减少耐药性的产生具有重要意义。
1甲氧西林耐药机制甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌是指表达mecA基因或具有其它甲氧西林耐药机制的金黄色葡萄球菌J。
目前，实验室利用苯唑西林或头孢西丁代替甲氧西林进行MRSA检测。
临床微生物实验室检测MRSA，常利用药敏纸片法(K—B 法)，该法将30片头孢西丁纸片贴在培养基上，35℃培养24 h，当抑菌环大于或等于22 mm判为苯唑西林敏感金黄色葡萄球菌，小于或等于21 HnTI则为苯唑西林耐药金黄色葡萄球菌。
青霉素结合蛋白(PBP)是金黄色葡萄球菌细胞壁主要成分肽聚糖合成过程中所必需的转肽酶，其催化细胞外五肽侧链的交联而构成肽聚糖网状立体结构。
金葡菌正常的PBP有PBP1、PBP2、PBP3和PBP4 [1]，B-内酰胺类抗生素通过与PBPs结合抑制其酶活性，从而阻碍细胞壁肽聚糖交联，使得细菌细胞壁合成被破坏而死亡。
而MRSA能产生一种新的特殊的PBP2a。
PBP2a常由B一内酰胺类抗生素诱导，对大多数8-内酰胺类抗生素亲和力低，由于其可替代高亲和力的正常PBPs催化肽聚糖交联，使细菌得以逃逸B-内酰胺类抗生素的作用而表现出耐药性[2]。
治疗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌，首选药物为万古霉素。
然而，目前国际上已经出现了万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌。
2万古霉素耐药机制万古霉素为糖肽类抗生素，主要抑制细胞壁的合成。
细胞壁前体D一丙氨酰一D一丙氨酸是万古霉素的作用靶位。
多重PCR在诊断慢性上颌窦炎耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的作用
自 １６ 年 Ｊｖｎ 报 道 发 现 耐 甲 氧 丙 林 金 黄 ９１ ｅｏ ｓ 色 葡 萄 球 菌 （ ｔｉ ｌｎｒｓ ｔｎ ｔｐ ｙｏｏ ｃｓａ ｍｅｈｅｌ — ｉ ａ ｔ ａ ｈ ｌ ｃ ｕ ｕ ｉｉ ｅ ｓ ｓ ｃ ｒｕ ， Ｓ 以来 ． 别 是 ２ ｅ ｓＭＲ Ａ） 特 ０廿 纪 ８ ０年 代 后 ． ＭＲ Ｓ 感 染 率 断 上 升 ， 于 其 具 有 多 重 耐 药 性 ， 临 Ａ 由 给
多重 聚合 酶 链 反 应 （ Ｃ 技 术 『 检 测 『 ＭＰ Ｒ） 司时 司一 Ｄ Ａ模 板 中 的台 黄 色葡 萄 球 菌耐 药 基 冈 ｍｅＡ及 金 黄 色 葡 萄 球 Ｎ ｃ
菌同有的 ｆ ｅ ｍＡ基 因 结 果 ｃ１ ５ ５ ／ ３倒 １ 结 论 ｆ ｃ ｍＡ基 囡 为 台 黄 色 葡萄 球 菌 的特 有 基 闻 ｃ Ａ基 杠 ＭＲ Ａ 中检 出 率 为 ９ ％ Ｓ ６２
一
材 料 与 方 法
、
病 例 选 择
１９ ９ ９年 １ ～ ｌ 月 ０月 间 我 院 共 选 择 ２ ６例 慢 性 ｌ 上 颔 窦 炎 患 者 行 颌 窦 穿 刺 或 手 术 并 收 集 标 本 。 其 中 穿 刺 １５例 ， 术 Ｉ １倒 ｉ ｌ４例 ． ９ ０ 手 ｌ 男 ２ 女 ２例 ； 年 龄 １ ～７ 岁 ， 均 为 ３ ４ ｌ 平 ９ ３岁 。 二 、 株 来 源 菌 ２６ 例 慢 性 上 领 窦 分 泌 物 经 细 菌 培 养 、 ｌ ｖｒ Ｅ Ａ Ｓ 法 国 产 ） ｒ Ｋ— Ｍ （ 自动 微 生 物 系 统 鉴 定 和 改 良 液 体 稀 释 法 测 定 苯 唑 西 林 的 最 低 抑 菌 浓 度 （ Ｉ１得 到 金黄 色 葡萄 球 菌 ６ Ｍ Ｃ ， ７株 ， 中 耐 药 ５ 其 ３ 株 （ Ｒ Ａ， Ｃ≥ ４ ｍｇ １） 敏 感 ｌ 株 （ Ｓ Ａ， Ｍ Ｓ ＭＩ ／ ． ４ Ｍ Ｓ
甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的实验室诊断
◆
和（或）ＶＡ筛选平 皿上有菌落生长
并且ＶＡ筛选平皿
可能是ＶＩＳＡ／ＶＲＳＡ
可能是ＶＩＳＡ／ＶＲＳＡ
报告很可能为ＶＳＳＡ４
上
核查菌株的纯度
上
进一步鉴定确认为金葡菌
｛ｉＬ…ＳＩ．金葡菌历古孑享节掌、 敏感：ＭＩＣ≤２ｍｇ／Ｌ
Ｌ ＶＳＳＡ Ｊ
中介：ＭＩＣ ４～８ｍｇ／Ｌ（ＶＩＳＡ） 耐药：ＭＩＣ／＞１６。。ｇ，Ｌ（ＶＲＳＡ）
Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ ｌｅｕｋｏｃｉ—
群谱型分析法（ＰＡＰ）被公认为检测ｈＶＩＳＡ的金标 准，确认标准为ＶＳＳＡ：（ＡＵＧ，｛测菌株／ＡｕｃＭ∞比值）＜
０．９；ｈＶＩＳＡ：０．９≤（ＡＵＣ待测菌株／ＡＵＣ Ｍ。３比值）＜１．
３；ＶＩＳＡ：（ＡＵＣ待测菌株／ＡＵＣＭ。３比值）≥１．３ Ｌ“。然 而，ＰＡＰ费时费力、需要特殊仪器，不适合常规实验 室开展，当临床上遇到万古霉素治疗ＭＲＳＡ无效病 例时可用此方法检测以明确治疗方向。ＢＨＩＡ筛选 法的结果需要进一步用ＰＡＰ加以确认，不适合临床 确认ｈＶＩＳＡ，但适合于大规模筛查ｈＶＩＳＡ／ＶＩＳＡ。 我们以前的研究结果显示Ｌ５］，ＢＨＩＴ５（含替考拉宁５ ｍｇ／Ｌ的脑心浸液琼脂平皿）的敏感性为８８．９％，特 异性为１７．３％；ＢＨＩＶ６（含万古霉素６ ｍｇ／Ｌ的脑心 浸液琼脂平皿）的灵敏度和特异度则分别为３．７％ 和９８．８％。ＭＥＴ相比较于ＢＨＩＡ筛选法敏感性和 特异性较高，实验室问一致性也较好，但昂贵。目前 国际公认的折点为ＭＩＣ万占霉素≥８ ｍｇ／Ｌ且ＭＥＴ ＭＩＣ替考拉宁≥８ ｍｇ／Ｌ或ＭＥＴ ＴⅢＣ替考拉宁≥１２ ｍｇ／Ｉ］…。 （二）万古霉素中介耐药的金葡菌（ＶＩＳＡ）
金黄色葡萄球菌
参考文献
陈靖,陈叶.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测金黄色葡萄球菌肠 毒素[J].中国食用菌,1999,18(5):39～40. 杨红,刘桂华,龚云伟等,食品中金黄色葡萄球菌的污染状况及 检测方法[J]. 黄吉城. 金黄色葡萄球菌快速检测培养基检测效果观察 [J].中国卫生检验杂志,2000,10(5):614-615. 袁桂兴,温 剑.金黄色葡萄球菌的快速检测方法[J].生物技术通 报,2007,(6):75-78. 张凤笑, 石磊.PCR 技术在金黄色葡萄球菌中的研究进 展[J].现代食品科技,2008,10:26-28.
金葡菌的主要来源
从图3 可以看出, 金 葡菌主要来源于生 鲜乳、生鲜肉、速 冻食品和肉制品, 其中生鲜肉所占比 例最大, 其次为生 鲜乳、速冻食品和 肉制品。其中, 肉 类速冻食品的金葡 萄污染高于其它速 冻食品。
小结
1.金黄色葡萄球菌作为一种主要的食源性致病菌一直是
医学界研究的重点。这是因为金葡菌在食品中分布的 广泛性及对不良环境的抵抗能力在非芽孢菌中最强, 能 产生耐热的肠毒素, 普通的烹饪条件无法使其失活。因 此, 在选购食品时建议选择知名品牌的合格商品, 应在 阴凉、通风、干燥、低温处贮藏食品, 以防止金葡菌肠 毒素的产生。 受到污染食品加工过程中应注意个人卫生问题, 必须佩 戴口罩及一次性手套。
快速分析方法
2.2傅里叶变换红外光谱（FTIR）检测金黄色葡萄球菌 FTIR法不仅可以反映微生物细胞壁 细胞膜细胞质甚至细胞 核中的蛋白质多糖脂质核酸及其大分子水分等混合成分的分 子振动信息，而且能敏锐地探测分子基团及其周围环境的变 化利用FTIR法检测金黄色葡萄球菌时，将细胞壁和细胞质洗 脱后，分别在傅立叶变换红外光谱仪上扫描，采集光谱，分 析细胞壁与细胞质对红外光吸收的变化规律。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三种筛查方法比较
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三种筛查方法比较目的: 以PCR检测的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的mecA基因为金标准，比较耐甲氧西林金葡菌快速胶乳凝聚检测法、头孢西丁纸片法、苯唑西林纸片法三种检验方法在MRSA筛查中的特异性和敏感性。
方法：采用NCCLS 推荐的30 μg头孢西丁纸片法和苯唑西林纸片法，以及快速乳胶法检测。
结果：苯唑西林纸片法检测MRSA阳性47株，阴性36株，敏感性94%，特异性94.7%。
头孢西丁纸片法检测MRSA阳性49株，阴性38株，敏感性98%，特异性100%。
快速胶乳检测法检测MRSA阳性49株，阴性37株，敏感性98.0%，特异性97.4%。
结论：头孢西丁纸片法、快速胶乳检测法与PCR法这个金标准有很高的一致性。
标签：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）；头孢西丁纸片法；快速乳胶检测法；苯唑西林纸片法；筛查耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 的临床院感率不断上升，在世界各地医院都有感染流行，甚至发生暴发流行，几乎在所有使用抗生素的地方都有MRSA 存在，已引起全球范围内的广泛关注[1]。
PCR法检测MRSA特异的青霉素结合蛋白2α（PBP2α）的mecA 基因，是国际公认的金标准，但因为设备、试剂费用高，实验要求严格等因素临床实验室难以常规开展。
本实验通过检测已经经过PCR法检测过的菌株88例，探讨苯唑西林纸片法、头孢西丁纸片法、快速乳胶检测法三种方法的敏感性、特异性和临床实用性。
现报道如下：1 材料与方法1.1 实验材料和试剂1.1.1 菌株来源实验菌株为2003年5月来本院微生物实验室从临床标本分离出的金黄色葡萄球菌88株，标准参考菌株ATCC 25923来自军事医学科学院微生物流行病研究所。
1.1.2 材料和试剂MRSA快速胶乳检测试剂由英国Oxoid公司生产。
头孢西丁纸片（30 μg）、苯唑西林纸片（1 μg）购自北京天坛药物生物技术公司。
水解酪蛋白（M-H）琼脂为杭州天和微生物试剂有限公司产品。
武汉地区门诊皮肤软组织感染患者中甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 PVL基因携带及耐药性检测要点
·论著·武汉地区门诊皮肤软组织感染患者中甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌PVL基因携带及耐药性检测刘小丽王斌江元山梁建生袁红张丽华周燕飞许慧琼430015武汉市疾病预防控制中心消毒与病媒生物防制所（刘小丽、王斌、梁建生、许慧琼），病原生物检测所（江元山）；武汉市第一医院护理部（袁红）；黄陂区人民医院医院感染管理科（张丽华）；武汉市第五医院医院感染管理科（周燕飞）通信作者：梁建生，Email:wh-ljs@DOI：10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.005【摘要】目的探讨从武汉地区门诊皮肤软组织感染（SSTI）患者中分离的甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）携带杀白细胞毒素（PVL）基因及耐药特征。
方法收集2011—2013年在武汉市5所医疗机构门诊就诊SSTI患者中分离的182株MSSA，采用纸片扩散法进行药敏试验，多重PCR法检测mecA基因和PVL基因。
结果182株MSSA中有65株PVL阳性，阳性率为35.71%。
不同病种PVL阳性率差异有统计学意义（χ2=49.76，P=0.00），其中疖/痈（7/7）、毛囊炎（3/3）、脓肿（55.53%，30/57）和脓疱疮（2/4）的检出率较高。
PVL阳性患者年龄［（35.40±19.31）岁］小于PVL阴性患者［（43.21±20.75）岁］，差异有统计学意义（t=2.50，P=0.01）。
在65株PVL阳性MSSA菌株中，耐药率居前3位的依次是氨苄西林（87.69%）、青霉素（53.85%）、红霉素（41.54%）。
在117株PVL阴性MSSA菌株中，耐药率居前3位的依次是克林霉素（26.50%）、青霉素（20.51%）、氨苄西林（12.82%）。
PVL阳性MSSA菌株对青霉素（χ2=21.19）、氨苄西林（χ2=97.97）、多西环素（χ2=11.61）、环丙沙星（χ2=8.07）、红霉素（χ2=25.04）、庆大霉素（χ2=10.86）的耐药率高于PVL阴性MSSA菌株，差异均有统计学意义（P<0.05）。
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二重实时PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(1)
】 目的 建立二重实时聚合酶链反应(duplex realtime PCR)快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。方法 采用二重SYBR Green实时PCR快速检测MRSA的决定基因mecA和金葡菌的种特异性基因nuc，经熔解曲线分析鉴定产物。结果 所有MRSA菌株的熔解曲线均呈现mecA、nuc基因特异性的峰，甲氧西林敏感的金葡菌仅有nuc峰，耐甲氧西林的表葡菌仅有mecA峰，甲氧西林敏感的表葡菌与其他菌种的菌株无特异峰出现；当MRSA菌浓度达102cfu/ml时就可检出。在131株金葡菌中，30.53%(40/131)耐药；二重实时PCR扩增mecA基因29.01%(38/131)阳性，nuc基因100%阳性。单引物与二重实时PCR两者阳性扩增符合率为100%。结论 对mecA、nuc基因进行二重实时PCR能准确、快速地鉴定耐甲氧西林的金葡菌和凝固酶阴性的葡萄球菌。
【关键词】 实时聚合酶链反应 耐甲氧西林金葡菌 mecA基因 nuc基因
Rapid detection of methicillinresistant Staphylococcus aureus
ABSTRACT Objective To establish a duplex realtime polymerase chain reaction (PCR) assay for rapid detection of methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA). Method A duplex SYBR Green realtime PCR assay targeting the mecA gene and a Staphylococcus aureus specific markernuc gene and identifying PCR products through melting curve analysis was used to rapidly identify MRSA. Results All MRSA strains tested in the study presented mecA and nuc gene specific peaks in the melting curve analysis; methicillinsusceptible Staphylococcus aureus (MSSA) strains only had a nuc peak, methicillinresistant Staphylococcus epidermidis (MRSE) strains only had a mecA peak, and methicillinsusceptible Staphylococcus epidermidis (MSSE) strains and strains of species other than staphylococci had no peak. MRSA strains could be detected, by use of this duplex realtime PCR in an 102 cfu/ml inoculum. Positive rate of drug sensitivity test was 30.53% (40/131) among 131 S.aureus isolates tested, of which 29.01% (38/131) were positive for mecA gene and all were positive for nuc gene in the duplex realtime PCR. The agreement between simplex and duplex realtime PCR was 100% for positive results. Conclusion This study shows that the duplex realtime PCR assay with the primers for to mecA and nuc genes is a valuable tool for rapid and precise identification of MRSA and methicillinresistant coagulasenegative staphylococci (MRCNS).
KEY WORDS Realtime polymerase chain reaction (RTPCR); Methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA); mecA gene; nuc gene收稿日期：20060615 修回日期：20061030
金黄色葡萄球菌是引起医院和社区获得性感染的重的人类病原菌，在整合了葡萄球菌盒式染色体mec元件(staphylococcal cassette chromosome mec element，SCCmec)并经历几次突变可演化成耐甲氧西林金葡菌(methicillinresistant Staphylococcusaureus，MRSA)，导致包括万古霉素在内的几乎所有抗生素治疗的失败［1］。因此，快速、准确地鉴定MRSA是控制院内感染的先决条件。
MRSA对甲氧西林耐药的机制主是由青霉素结合蛋白PBP2a介导的，SCCmec中的mecA基因是PBP2a的编码基因［2］。金葡菌的胞外热稳定核酸酶的基因序列nuc具有种的特异性［3］。我们运用二重荧光实时聚合酶链反应(realtime polymerase chain reaction)检测金葡菌临床分离株的nuc基因和mecA基因，在进行菌种确认的同时快速鉴定MRSA。
1 材料与方法 1.1 材料 (1)菌株来源 2005年9月从安徽省35所医院临床标本中无重复分离的131株金葡菌和6株凝固酶阴性的表葡菌；标准菌株金葡菌ATCC33591(MRSA)和金葡菌ATCC29213(MSSA)以及大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、铜绿假单胞菌ATCC27853等均由安徽医科大学附属医院感染病科提供。
(2)主试剂 SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)购自TaKaRa公司，是一种二倍浓度的预混试剂(包含热启动DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS、反应用缓冲液、dNTP、SYBR Green I等)并附带参比染料ROX Reference Dye II(50×)；MuellerHinton琼脂(英国Oxoid公司)；头孢西丁钠(海南海药公司海口制药厂)。 (3)主仪器 ABI Prism 7500型荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，多点接种仪(英国AQS Manufacturing公司)。
(4)实时PCR引物 nuc基因的引物NUC1/NUC2，mecA基因的引物MECA1/MECA2分别扩增MRSA的279和222bp片段［3～5］。两种引物对均委托TaKaRa公司合成(表1)。
1.2 方法 (1)细菌培养与模板制备 将实验用菌种复苏后，分别划线接种到MH琼脂平板上，35℃培养24h后，挑取单个菌落溶于100μl灭菌蒸馏水中。菌悬液95℃水浴15min，7000r/min离心1min，弃沉淀、留上清液作为PCR反应的DNA模板。
表1 nuc、mecA二重实时PCR的引物序列
引物GenBank号序列(5′→3′)Tm(℃)NUC1V01281GCGATTGATGGTGATACGGTT55.9 (511→531)NUC2V01281AGCCAAGCCTTGACGAACTAA60.4 AGC(766→789)MECA1X52593GCAATCGCTAAAGAACTAAG51.3 (693→712)MECA2X52593GGGACCAACATAACCTAATA51.3 (895→914)
(2)nuc或mecA基因单一引物实时PCR 25μl的反应体系中包含有12.5μl的SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、0.5μl的ROX Reference Dye II(50×)、2μl的DNA模板、上游和下游引物各0.2μmol/L。在ABI Prism 7500 PCR仪上经95℃、10s的模板预变性后，再进行40个循环的PCR扩增即95℃变性5s、60℃退火和延伸34s。最后一个循环的熔解程序为：95℃，15s；58℃，1min；95℃，15s。温度变化率除了从58℃升至95℃这一步为0.1℃/s，其余均为20℃/s。荧光信道设置在F1(530nm)处，单点荧光检测在每个循环的60℃、34s退火和延伸步骤。
(3)nuc、mecA基因二联引物实时PCR 反应总体积为25μl，包括：2×SYBR Premix Ex TaqTM 12.5μl，50×ROX Reference Dye II 0.5μl，DNA模板2μl，引物NUC1、NUC2各0.2μmol/L，引物MECA1、MECA2各1.0μmol/L。扩增程序与单一引物实时PCR相同。每次试验均包括阳性对照(MRSA标准菌株)和阴性对照(模板DNA由无菌水取代)。 【摘】目的 建立二重实时聚合酶链反应快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。方法
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(4)数据分析 反应结束后，确认SYBR Green I实时PCR扩增曲线和熔解曲线，结合CT(threshold cycle，阈循环)值、Tm(melting temperature，熔解温度)值判定结果。样本菌的扩增CT值≤35且荧光曲线呈对数增长；Tm值在MRSA标准株的Tm(mecA)±0.3℃范围之内的菌株被认为mecA基因阳性，Tm值在标准株的Tm(nuc)±0.5℃范围之内的菌株被认为nuc基因阳性。随机选取部分野生株的PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(5)特异性试验 用于检测该二重实时PCR体系特异性的相关菌株如前所述。
(6)灵敏度试验 MRSA标准菌纯培养增菌后，将上述增菌液各稀释成100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7等八个梯度。取一份稀释液用煮沸法提取核酸作为模板上荧光PCR仪；另取一份用来涂布三个平板，进行平板计数。