酶联免疫斑点技术诊断潜伏结核的系统分析
酶联免疫斑点技术介绍
酶联免疫斑点技术介绍本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March酶联免疫斑点技术介绍一、 ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
T细胞酶联免疫斑点试验在结核病诊断中的应用
T细胞酶联免疫斑点试验在结核病诊断中的应用目的：探讨结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）在结核病快速诊断的临床应用价值。
方法：选取74例结核病患者（疾病组）和48例非结核病（对照组）对照，同时采用结核杆菌涂片、结核抗体（TB-Ab）、结核菌素试验（TB-PPD）及结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）进行检测，并比较四种检测方法对结核病的诊断价值。
结果：T-SPOT.TB法的敏感性为75.68%、特异性为91.67%、阳性预测值为93.33%、阴性预测值为70.97%，均明显高于TB-PPD法的55.41%、56.25%、66.13%、45.00%和TB-Ab法的36.49%、68.75%、64.29%、41.25%，涂片染色镜检阳性率仅为9.46%。
结论：T-SPOT.TB 是诊断结核感染的快速、敏感的方法，在结核性疾病早期诊断中有重要价值。
标签：结核杆菌涂片；结核抗体；结核菌素试验；T细胞酶联免疫斑点试验；结核病我国是全球结核高疫情国家之一，年新发病例超过100万人，以肺结核为主，肺外结核约占15%～20%[1]。
目前结核病的诊断主要依靠临床症状、影像学、痰涂片、痰分枝杆菌培养和结核菌素（PPD）试验等，阳性率与特异性均较低，临床上易造成漏诊和误诊，肺外结核更为明显，结核分枝杆菌培养阳性是结核诊断的金标准，但分枝杆菌培养时间太长（6～8周）[2]。
江苏省已广泛接种卡介苗（BCG），与结核菌素试验所用的结核杆菌纯化蛋白衍生物（PPD）有交叉反应，会出现较高的假阳性，部分老年人或免疫功能低下患者又会出现较高的假阴性率，影响患者的诊断和治疗。
因此笔者所在医院引进近年发展起来的结核感染T 细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB），为临床早期发现结核病提供帮助。
本文采用回顾性分析的方法，探讨结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）在结核病快速诊断的临床应用价值。
酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用
提供 ， 脑脊液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） 平 ≥５０ ｃｐｅ／ ｌ 断 为 阳 ＢＤ Ａ（ Ｃ 水 ０ ｏ ｉ ｍ 判 ｓ
性 ， ５ ０ｃｐｅ ｍ 判 断 为 阴 性 。 检 测 结 果 使 用 Ｐｉ ５０软 ＜ ０ ｏｉ ／ ｌ ｓ ｒｍ ． ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组 间率 的比较采用卡方
特 异 性 ｒ 扰 素 （Ｆ —） 平 可 以 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 的 干 ＩＮ ｒ 水
断为 阳性 ， 抗 原 检 测 结 果 为 阴性 ， 果 判 断 为 阴 性 ； 有 ３种 结 所 脑 膜 脑 炎 病 例 均 常 规 行 脑 脊 液 Ａ Ａ、 脊 液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） Ｄ 脑 Ｂ Ｄ Ａ（ Ｃ
检测 。脑脊 液 Ａ Ａ使 用 酶 标 法 进 行 检 测 ， 据 国 内 同行 Ｄ 根 ２０ ０４年对脑脊 液 Ａ Ａ在结 核性脑 膜脑 炎 中研 究 的标准 Ｊ Ｄ ， 脑脊液 Ａ Ａ１８Ｕ Ｌ判断为 阳性 ， ８Ｕ Ｌ判断为阴性 ； Ｄ ＞ ／ ＜ ／ 脑脊
液 Ｔ —Ｎ Ｂ Ｄ Ａ荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应 试剂 由达 安 基 因有 限 公 司
选 非 结 核 性 脑 膜 脑 炎 病 例 均 通过 临床 治 疗 转 归 及 实 验室 检 查 最终确诊 。
方 法
所 有 病 例 均抽 取 乙 二 胺 四 乙 酸 （ Ｄ Ａ） 凝 血 ５ｍ ， ＥＴ 抗 ｌ送
实 验 室 行 Ｅｉ ｏ检 测 。检 测 结 果 根 据 斑 点 数 量 设 定 ， 一 反 ｌｐ ｔ ｓ 每
术 在 结 核 性 脑 膜脑 炎 中 的应 用 价 值 。
临 床 资 料
、
果
在 ７ 例 结 核 性 脑 膜 脑 炎 的 诊 断 中 ，ｌｐ ｔ 性 者 ４ ３ Ｅｉ ｏ 阳 ｓ ５
免疫酶斑点试验
应用领域
临床诊断
药物筛选
用于检测感染性疾病、自身免疫性疾病、 肿瘤等疾病的相关抗原或抗体，辅助临床 诊断和制定治疗方案。
用于筛选和鉴定药物的靶点、研究药物的 免疫活性等。
食品安全检测
环境监测
用于检测食品中的病原微生物、毒素等有 害物质。
用于检测环境中的有害物质、污染物等， 保障环境安全。
02
免疫酶斑点试验的原理与技术
肿瘤
免疫酶斑点试验也可用于肿瘤标志物的检测，如癌胚抗原、甲胎蛋白 等，有助于肿瘤的早期发现和监测。
在药物研发中的应用
新药筛选
免疫酶斑点试验可用于筛选和鉴定具有药理活性的小分子 化合物，为新药研发提供有力支持。
药物代谢研究
通过免疫酶斑点试验可以研究药物在体内的代谢过程，了 解药物在体内的分布、代谢和排泄情况，为药物设计和优 化提供依据。
04
免疫酶斑点试验的结果分析
阳性结果的判定
01
02
03
斑点颜色明显
如果斑点颜色深且清晰， 与背景形成明显对比，通 常被认为是阳性结果。
斑点大小
斑点大小超过一定阈值通 常被认为是阳性，具体阈 值可能因试验而异。
周围晕圈
在阳性结果中，有时会出 现围绕斑点的浅色晕圈， 这有助于识别阳性斑点。
阴性结果的判定
药物疗效评估
免疫酶斑点试验可检测药物对靶点的抑制作用，评估药物 的疗效和安全性，为临床用药提供参考。
在生物科学研究中的应用
01
蛋白质组学研究
免疫酶斑点试验可用于蛋白质组学研究，检测蛋白质的表达和修饰情况，
了解蛋白质的功能和作用机制。
02
细胞信号转导研究
通过免疫酶斑点试验可以检测细胞内信号转导通路的活性变化，了解细
研究酶联免疫斑点法检测在涂阴肺结核患者的诊断价值
研究酶联免疫斑点法检测在涂阴肺结核患者的诊断价值目的探讨酶联免疫斑点法（ELISPOT）在涂阴肺结核患者中的诊断价值。
方法将2016年5月～2017年3月期间我院收治的346例肺结核患者，其中A 组涂阴肺结核患者（180例）、B组为非涂阴肺结核患者（166例），两组均采用ELISPOT检测肺泡灌洗液、外周血液中分泌的结核抗原特异性干扰素的T淋巴细胞水平，之后绘制出两组患者的工作特征曲线（ROC），并计算出曲线下的面积；将A组肺泡灌洗液做结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测、涂片抗酸染色、培养分枝杆菌，比较诊断价值与阳性率。
结果A组、B组患者的血液ELISPOT 检测的特异性分别为84.44%（152/180）与90.96%（151/166）；肺泡灌洗液ELISPOT 检测的特异性分别为92.78%（167/180）与94.58%（157/166）（P>0.05）；A组、B组患者的肺泡灌洗液ELISPOT检测的ROC曲线下面积分别为0.938与0.869，差异有统计学意义（P＜0.05）；涂阴肺结核的肺泡灌洗液ELISPOT 检测的阳性率为91.67%（165/180），而结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测、涂片抗酸染色、培养分枝杆菌的阳性率分别为34.44%（62/180）、15.56%（28/180）、31.67%（57/180）（P＜0.05）。
结论在涂阴肺结核患者的临床诊断中，应用ELISPOT 检测肺泡灌洗液中分泌的结核抗原特异性干扰素的T淋巴细胞水平，检测效率高、敏感性与特异性强，可作为涂阴肺结核的诊断方法予以推广。
[Abstract] Objective To discuss the value of ELISPOT in Diagnosis of Smear negative pulmonary tuberculosis. Methods 346 cases with TB from May 1 2016 to March 2017 year in our hospital were selected as objects.The group A was smear negative pulmonary tuberculosis patients （180 cases），and the group B was non smear negative pulmonary tuberculosis patients （166 cases）.Bronchoalveolar lavage fluid and peripheral blood IFN-y T levels of two groups were detected by ELISPOT.The curve of the two groups （ROC）was drew，and AUC was calculated.Mycobacterium tuberculosis nucleic acid amplification fluorescence detection，Smear fast stain，and mycobacteria culture in bronchoalveolar lavage fluid of group A were done.Diagnostic value and positive rate were compared. Results Specificities of ELISPOT for blood in group A and group B were 84.44%（152/180）and 90.96%（151/166）；Specificities of ELISPOT for bronchoalveolar lavage fluid in group A and group B were 92.78%（167/180）and 94.58%（157/166）（P>0.05）.AUC of ELISPOT for bronchoalveolar lavage fluid in group A and group B were 0.938與0.869 （P＜0.05）；The positive rate of ELISPOT for bronchoalveolar lavage fluid in smear negative pulmonary tuberculosis was 91.67%（165/180），and the positive rate of Mycobacterium tuberculosis nucleic acid amplification fluorescence detection，Smear fast stain，and mycobacteria culture were 34.44%（62/180），15.56%（28/180），31.67%（57/180）（P＜0.05）. Conclusion In the clinical diagnosis of smear negative pulmonary tuberculosis patients，application of ELISPOT detection of IFN-y T levels in bronchoalveolar lavage fluid is of high detection efficiency，and high sensitivity and specificity，which can be used as a method for diagnosis of smear negative pulmonary tuberculosis to be promoted.[Key words] Smear negative pulmonary tuberculosis；Enzyme-linked immunosorbent assay；Bronchoalveolar lavage fluid；Diagnostic value我院应用该技术来检测肺泡灌洗液中分泌的结核抗原特异性干扰素的T淋巴细胞水平，并与其它检测方法进行了比较，旨在探讨ELISPOT在涂阴肺结核患者中的诊断价值，现报道如下。
ELISPOT法在结核诊断中的应用
ELISPOT法在结核性腹腔积液诊断中的应用腹腔积液在临床上较为常见，以往对于结核性腹腔积液的实验室检查多采用涂片找抗酸杆菌及PCR法检测结核杆菌，但这些方法灵敏度不够理想，近年来也有很多文献报道了采用ADA、CEA对鉴别结核性、癌性胸腹腔积液的应用价值，但而这些方法特异性较差，特别是40岁以上的结核性与癌性腹腔积液的鉴别较为困难[1]。
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）是由Czerkinsky等于1983年建立的一种对于单细胞水平检测特异性抗体分泌细胞功能的免疫学技术，以后运用于检测分泌细胞因子的某种抗原特异性T淋巴细胞的数量。
由于结核杆菌可以诱导T淋巴细胞的细胞免疫反应，Lalvani等首先应用ELISPOT法用于结核病的诊断，以往关于运用ELISPOT检测血液中特异性T淋巴细胞的报导较常见[2]。
本文对腹腔积液采用ELISPOT法检测，并探讨其在对结核性腹腔积液诊断价值。
1材料与方法1.1 标本来源 2011年8月至2012年10月我院住院患者，共116例。
根据实验室检查、影像学、病理结果及检临床表现确诊为结核性腹膜炎患者62例，年龄17～51岁，平均年龄33岁。
对照组为54例恶性肿瘤患者，年龄25～54岁，平均34岁。
临床医师腹穿采集腹腔穿刺液标本。
穿刺液用EDTA-K2进行抗凝后，取8ml穿刺液并使用Ficoll-Hypaque进行密度梯度离心分离其中的单个核细胞。
分离后的单个核细胞加入冻存液贮存于-80℃环境下。
1.2 试剂与仪器荧光定量聚合酶链反应(PCR)TB-DNA试剂盒由达安基因生物公司提供，仪器为美国ABI 7300实时荧光定量PCR仪。
Cryostar冻存液及结核杆菌T淋巴细胞斑点TB-ELISPOT试剂盒购于北京达科为生物技术公司。
1.3 对穿刺液沉淀提取物进行结核杆菌DNA PCR检测，按照试剂盒说明书进行扩增30个循环后，通过ABI 7300PCR分析仪软件分析判断，并报告TB-DNA拷贝数量，当DAN含量>103考贝/ml时为阳性。
酶联免疫斑点试验对活动性结核病的诊断价值
酶联免疫斑点试验对活动性结核病的诊断价值覃伟;银春莲;杨莉;李海;郑春燕【摘要】目的探讨酶联免疫斑点试验(ELISPOT)在活动性结核病中的辅助诊断价值.方法选取活动性结核病患者36例(结核病组)和非结核病患者(对照组)38例,收集受试者外周血单核细胞进行ELISPOT检测,同时对部分受试者进行结核菌素皮肤试验(TST).结果结核病组中ELISPOT的灵敏度为91.7%(33/36),特异度为81.6%(31/38).TST的灵敏度为48.1%(13/27),特异度为57.9%(22/38).同时完成ELISPOT和TST检测的27例结核病患者中,ELISPOT阳性检出率为88.9%(24/27),明显高于TST检出率的48.1%(13/27,P=0.021);对照组中,ELISPOT 阳性检出率为18.4%(7/38),明显低于TST检出率的42.1%(16/38,P＜0.05).结论ELISPOT诊断活动性结核病的准确性较高,可作为结核病的辅助诊断方法.%Objective To exptore the auxitiary vatue of enzyme-tink immunospot assay( EUSPOT ) for diagnosis of aetive tubereutosis. Methods Thirty six patients vvith aetive tubereutosis( TB group) and 38 patients vvith non-tubereutosis ( controt group ) were enrotted in the study. The peripherat btood mononuetear eetts of att partieipants were detected by ELISPOT, and some partieipants atso underwent tubereutin skin test( TST ) simuttaneousty. Resutts The sensitivity, specificity of ELISPOT in TB group were 91. 7%( 33/36 ) and 81. 6% ( 31/38 ), respectivety , white those of TST were 48. 1%( 13/27 ) and57.9%( 22/38 ),respectivety. In 27 TB cases who were tested by EUSPOT and TST simuttaneousty ,the positive rate of EUSPOT was significantty higher than that of TST[ 88. 9%( 24/27 ) vs 48. 1%( 13/27 ),P =0. 021 ]. Incontrots,the positive rate of ELISPOT was significantty tower than that of TST[18.4%( 7/38 ) vs 42. 1%( 16/38 ),P ＜0. 05 ]. Conctusion EtISPOT appears to be a more accurate approach for the auxitiary diagnosis of aetive tubereutosis.【期刊名称】《广西医学》【年(卷),期】2012(034)011【总页数】3页(P1466-1468)【关键词】结核病;诊断;酶联免疫斑点试验;结核菌素皮肤试验【作者】覃伟;银春莲;杨莉;李海;郑春燕【作者单位】广西南宁市第四人民医院结核二病区,南宁市,530023;广西南宁市第四人民医院结核二病区,南宁市,530023;广西南宁市第四人民医院结核二病区,南宁市,530023;广西医科大学公共卫生学院职业卫生与环境卫生学教研室;基础医学院免疫学教研室,南宁市,530021【正文语种】中文【中图分类】R52目前我国属全球22个结核病高负担国家之一，结核病患者在世界排名第二，约有450万，其中200万是开放性结核病，每年因结核病死亡的人数约有13万，结核病已成为感染性疾病的头号杀手［1］。
酶联免疫斑点试验对肺外结核病的辅助诊断价值
结 果
１ 研 究对 象
选 取 西 安 交 通 大学 第 一 附 属 医院
１ 肺 外结核病 患者 基 本 情 况和 结 核 病 累及 部 位 结核 病患 者 的平均 年龄 为 ４ ４ ． ５ ８岁 （ Ｏ ． ７ ５ ～８ ７岁 ） 。 其 中受 累最 多 的部位 是 骨／ 关节结核 （ 一２ ２ ） ， 其 次 为 胸 膜 和腹膜 （ 分 别为 一 １ ９ ） 。在 这 些肺 外 结核 患 者 中 Ｔ － Ｓ Ｐ ＯＴ 阳性 率 为 ７ ３ ． ６ ， 其中 Ｔ — Ｓ Ｐ ＯＴ 阳性率 最 高 的是 多发部 位结 核 患者 （ １ ０ ０ ） ， 其 次为结 核性 腹膜 炎 （ ８ ４ ． ２ ） 及 淋 巴结核 （ ８ ３ ． ３ ） ， 骨／ 关 节结 核 阳性率 最 低（ ５ ４ ． ５ ） ， 多 部位 结 核感 染 中有 结 核性 心 包 炎 合 并 胸 膜炎 ２例 ， 结核 性胸 膜炎 合并 腹膜 炎 ２ 例， 睾 丸结 核 合 并淋 巴结 核 、 肺 结 核 １例 ， 淋 巴结 核 合 并 肾 结 核 １ 例， 结 核性 胸膜 炎合并 腹膜 炎 、 心包炎 １ 例 。其 它结 核
其 在 不 同部 位 结核 感 染 中的诊 断价 值 不 同。
主 题词 结核 ／ 诊 断 ＠Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ｐ ＯＴ
【 中 图 分 类 号 】 Ｒ５ ２ 【 文 献标 识码】 Ａ ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ０ — ７ ３ ７ ７ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ８ ． ０ ３ ５
８ ７例 初 治 的肺 外结核 病 患者 进行 了酶联免 疫 斑 点技 术 、 病理 检 测 、 痰 涂 片找结核 杆 菌 、 结核 Ｐ Ｃ Ｒ检 测 及 结核 Ｉ ｇ Ｇ 的检 测 ， 比较 了不 同方 法的敏 感 性 ， 并观 察 了酶 联免 疫斑 点试 验在 不 同部 位 肺 外 结核
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酶联免疫斑点技术诊断潜伏结核的系统分析【摘要】目的系统分析方法评价酶联免疫斑点技术快速诊断潜伏结核的准确性。
方法通过检索PubMed、EMBASE、CNKI等数据库和其他方式收集文献。
用Meta-Disc软件计算合并灵敏度、合并特异性和ROC曲线等评价T细胞斑点试验的诊断正确性。
结果终纳入6篇文献。
酶联免疫斑点技术在检测潜伏结核时,均显示了较高的灵敏度,但特异性相对较低,且存在异质性。
合并灵敏度=93.9% [95% CI(90.9%-96.2%)],合并特异性=合并SPE为66.2% [95% CI(62.4%-69.8%)],ROC曲线下面积为0.9658。
结论联免疫斑点技术诊断潜伏结核显示了较高的灵敏度,但特异性相对较差,限制了该方法的应用。
【关键词】潜伏结核;分枝杆菌;诊断;酶联免疫斑点技术;系统分析人体感染结核分枝杆菌后,只有小部分可引起急性疾病过程,大部分则由于机体形成有效的免疫应答,阻止疾病的发展而成为无临床症状的潜伏感染状态[1]。
控制结核病的一个重要措施,就是筛查出潜在性结核感染者并进行预防性治疗。
有鉴于此,近年来该病的早期诊断成为一个研究热点[2]。
免疫斑点(enzyme link immunospot,ELISPOT)试验的理论基础是当结核菌致敏的T淋巴细胞再次遭遇人型结核分枝杆菌抗原时,可在体内产生体外抗原诱导的干扰素-γ(INF-γ)[3]。
目前,国内外已开展了多项ELISPOT检测分泌INF-γ的研究,但各家结果不尽相同。
本研究旨在客观评价ELISPOT在潜伏结核快速诊断中的临床应用价值,结果报告如下。
1 资料和方法1.1 纳入标准潜伏结核患者,痰涂片结核分枝杆菌阴性;以结核分枝杆菌培养为金标准;检测早期分泌抗原-6(early-secreted antigenic target 6,ESAT-6)的ELISPOT试验。
1.2 排除标准纳入对象合并可导致免疫力下降的疾病,如HIV/AIDS;病例数＜30例的研究;未设对照组的研究;结果中没有报告且通过计算不能得到四格表原始数据的研究。
1.3 文献检索及资料收集1.3.1 检索词tuberculosis, latent, Mycobacterium tuberculosis, interferon-gamma, ELISPOT, T-cell response, ESAT6, interferon gamma assay, sensitivity, specificity,结核,潜伏,结核分枝杆菌,干扰素-γ,酶联免疫斑点试验,T细胞应答,早期分泌抗原-6,干扰素-γ释放试验,敏感性,特异性。
1.3.2 检索策略参考《The Bayes Library of Diagnostic Studies and Reviews》制定检索策略,检索词分目标疾病和诊断准确性指标两大部分,并根据具体数据库调整,所有检索采用主题词[MEDLINE (MeSH),EMATGE ( EMTREE) ]与自由词相结合的方式,所有检索策略通过多次预检索后确定。
1.3.3 数据库检索PubMed (1966~2009-08、EMBASE (1974~2009-08)、Cochrane library (2009年第3期)。
中国生物医学文献数据库(1978~2009-08)、中国期刊全文数据库(1979~2009-08)、中文科技期刊数据库(1989~2009-08)、中国重要会议论文全文数据库(2000~2009-08)、中国学术会议论文全文数据库(1998~2009-08)。
1.3.4 手工检索检索创刊至今的《中华检验医学杂志》、《检验医学》、《临床检验杂志》、《上海医学检验杂志》、《中华微生物学和免疫学》、《中华结核和呼吸杂志》、《中华流行病学杂志》等相关杂志7种。
1.4 文献筛选两名研究者独立阅读所获文献题目和摘要,在排除明显不符合纳入标准的研究后,对可能符合纳入标准的研究阅读全文,以确定是否真正符合纳入标准。
两位研究者交叉核对纳入研究的结果,对有分歧而难以确定其是否纳入的研究,通过讨论或由第三位研究者决定。
1.5 资料提取按照预先设计的资料提取表,一位研究者提取和录入资料,另一位核对,如遇意见不一致,双方讨论解决或由第三者判断,缺乏的资料通过电话或信件与作者联系予以补充。
提取的主要资料包括:作者、发表年代、国家、试验方法、是否盲法、纳入样本数、参考标准与此法比较所得结果(灵敏度、特异性、优势比、似然比等)。
1.6 质量评价根据Whiting等[4]制订的QUADAS量表14条标准评价文献质量(该量表为评价诊断性试验准确性文献质量的工具)。
每一条标准以“是”、“否”、“不清楚”评价,“是”为满足此条标准,“否”为不满足或未提及,部分满足或者从文献中无法得到足够信息的计为“不清楚”。
QUADAS量表是从偏倚、变异、报告质量三方面对纳入的每篇文献逐条进行评价,找出各种偏倚和变异产生的原因。
1.7 统计分析用Meta-Disc软件(version 1.4)进行试验数据的统计学处理。
对可提取四格表数据的文献,合并灵敏度、特异性、阳性似然比、阴性似然比、诊断性试验比值比,并进行异质性分析(Q检验,P),绘制ROC。
2 结果2.1 文献检索结果初检得到相关文献共84篇,经阅读题名及摘要后,排除了描述性研究、综述、动物试验等文献50篇,对筛选出的文献详细阅读全文,又排除了未设立对照等不符合纳入标准的文献28篇,最终纳入文献6篇。
2.2 纳入研究基本特征纳入研究基本特征见表1。
合并SEN为93.9% [95% CI(90.9%-96.2%)],Heterogeneity chi-squared =4.16,P= 0.526;合并SPE为66.2% [95% CI(62.4%-69.8%)],Heterogeneity chi-squared = 64.95,P= 0.000。
合并诊断比数比为40.289 [95% CI(15.11-107.46)],Heterogeneity chi-squared = 16.99,P= 0.005。
表1纳入研究基本特征文献序号作者及发表年份资料来源真阳性假阳性假阴性真阴性试验设计是否盲法文献质量[5]Lee et al., 2006韩国83204111101[6]Goletti et al., 2006意大利2113219101[7]Janssens et al., 2007瑞士571271183101[8]Kang et al., 2007韩国5939534102[9]Soysal et al., 2008土耳其8020740102[10]Zhao et al., 2009中国403347101注:试验设计栏1表示病例对照研究,0表示横断面研究;是否盲法栏1表示盲法,0表示非盲法;文献质量栏按QUADAS量表由低至高分为1~3级2.3 Meta分析结果2.3.1 异质性检验在诊断试验中,引起异质性的主要原因有阈值效应和非阈值效应。
前者可通过ROC平面图来估计,当存在阈值效应时,灵敏度和特异度呈负相关(或灵敏度与1-特异度呈正相关),其结果在ROC曲线平面图上呈“肩臂状”点分布,反之则无。
本研究的ROC平面图示ROC曲线不呈“肩臂状”分布(见图1)。
非阈值效应可通过森林图和Cochran-Q检验来评价,本研究合并诊断比之比森林图示Cochran-Q=16.99,df=5,P=0.0045,表明存在非阈值效应引起的异质性(见图2)。
图1 ROC平面图图2 合并诊断比之比森林图2.3.2 合并统计量通过计算灵敏度对数与(1-特异度)对数的spearman相关系数,发现b与0差异无统计学意义(P=0.2525),提示ROC曲线对称。
拟合ROC曲线,同时给出AUC=0.9658,SE(AUC)=0.0229,Q=0.9123,SE(Q)=0.0353(见图3)。
图3 拟合ROC曲线图3 讨论潜伏结核感染是宿主感染结核杆菌后的一种亚临床状态,而大多数的活动性结核是未经治疗的潜伏感染的结核杆菌重新激活所致。
潜伏结核患者因痰涂片镜检反复阴性易延误早期诊断和及时治疗,有效识别及治疗潜伏结核患者是防治结核的重要策略。
据我国第四次全国结核流行病学抽样调查显示,65 %～75 %的患者为痰涂片阴性[11]。
临床上用于判断潜伏结核分枝杆菌感染的经典方法是结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST),即皮内Mantoux试验以及PPD试验,但TST也存在难以克服的缺陷。
首先,特异性不够好,对于卡介苗(BCG)作为常规接种疫苗的国家,TST的阳性或者弱阳性结果很可能是由BCG接种引起的,同时不能除外非结核分枝杆菌感染;其次,TST对潜伏性结核分枝杆菌感染的敏感性一般,对于免疫抑制者结果更是难以确定[12]。
血清学方法检测结核抗体敏感性,特异性均不高,且与患者的营养状况及免疫功能相关。
PCR(痰结核杆菌聚合酶链反应)具有快速,敏感性高,特异性强,但是假阳性高约20%~30%[13]。
目前潜伏结核诊断的金标准是结核分支杆菌培养,特异性强,敏感性较低且耗时较长,给临床及时诊断结核病带来困难。
结核菌可诱导强烈的细胞免疫反应,因此,检测结核菌特异T淋巴细胞可作为检测感染的一种新途径。
ESAT-6是由结核菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白,只存在于结核菌群(包括人型分枝杆菌、牛型分枝杆菌和洲型分枝杆菌)及其他几种致病性分枝杆菌,如堪萨斯分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、海分枝杆菌中,是T淋巴细胞的靶抗原,能诱导皮肤迟发型超敏反应并刺激胸水T淋巴细胞产生IFN-γ[14]。
大量研究表明[15,16],结核特异性抗原分泌IFN-γ的T淋巴细胞可作为结核菌感染的一种可靠标志物。
ELISPOT方法通过定量检测患者的全血/外周血单核细胞在结核菌特异性抗原刺激下释放IFN-γ的水平,该试验较为成熟,其对应的方法和试剂盒先后被美国FDA批准应用于临床,CDC也专门为其制定了使用指南[17]。
通过分析纳入本研究的文献后,主要有如下发现:(1)采用ELISPOT检测潜伏结核感染时,显示了较高的灵敏度,合并SEN为93.9% [95% CI(90.9%-96.2%)],Heterogeneity chi-squared = 4.16,P= 0.526;然而,该试验的特异性较低,合并SPE为66.2% [95% CI(62.4%-69.8%)],Heterogeneity chi-squared = 64.95,P=0.000,且各家报道之间存在异质性。
(2)通过拟合ROC曲线图给出,AUC=0.9658,Q=0.9123,且合并诊断比数比为40.289,提示ELISPOT具有高准确性,但SPE高度异质性,限制了该方法在诊断潜伏结核感染中应用。