酶联免疫斑点技术介绍
酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用
提供 ， 脑脊液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） 平 ≥５０ ｃｐｅ／ ｌ 断 为 阳 ＢＤ Ａ（ Ｃ 水 ０ ｏ ｉ ｍ 判 ｓ
性 ， ５ ０ｃｐｅ ｍ 判 断 为 阴 性 。 检 测 结 果 使 用 Ｐｉ ５０软 ＜ ０ ｏｉ ／ ｌ ｓ ｒｍ ． ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组 间率 的比较采用卡方
特 异 性 ｒ 扰 素 （Ｆ —） 平 可 以 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 的 干 ＩＮ ｒ 水
断为 阳性 ， 抗 原 检 测 结 果 为 阴性 ， 果 判 断 为 阴 性 ； 有 ３种 结 所 脑 膜 脑 炎 病 例 均 常 规 行 脑 脊 液 Ａ Ａ、 脊 液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） Ｄ 脑 Ｂ Ｄ Ａ（ Ｃ
检测 。脑脊 液 Ａ Ａ使 用 酶 标 法 进 行 检 测 ， 据 国 内 同行 Ｄ 根 ２０ ０４年对脑脊 液 Ａ Ａ在结 核性脑 膜脑 炎 中研 究 的标准 Ｊ Ｄ ， 脑脊液 Ａ Ａ１８Ｕ Ｌ判断为 阳性 ， ８Ｕ Ｌ判断为阴性 ； Ｄ ＞ ／ ＜ ／ 脑脊
液 Ｔ —Ｎ Ｂ Ｄ Ａ荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应 试剂 由达 安 基 因有 限 公 司
选 非 结 核 性 脑 膜 脑 炎 病 例 均 通过 临床 治 疗 转 归 及 实 验室 检 查 最终确诊 。
方 法
所 有 病 例 均抽 取 乙 二 胺 四 乙 酸 （ Ｄ Ａ） 凝 血 ５ｍ ， ＥＴ 抗 ｌ送
实 验 室 行 Ｅｉ ｏ检 测 。检 测 结 果 根 据 斑 点 数 量 设 定 ， 一 反 ｌｐ ｔ ｓ 每
术 在 结 核 性 脑 膜脑 炎 中 的应 用 价 值 。
临 床 资 料
、
果
在 ７ 例 结 核 性 脑 膜 脑 炎 的 诊 断 中 ，ｌｐ ｔ 性 者 ４ ３ Ｅｉ ｏ 阳 ｓ ５
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
固相酶联免疫斑点技术
固相酶联免疫斑点技术固相酶联免疫斑点技术，听起来是不是有点高大上？它就是个帮助我们检测各种物质的好帮手。
想象一下，你在厨房里做饭，随手把各种调料都放进锅里。
这个技术就像是把你的调料品分类，帮你找出锅里究竟有什么。
很酷吧！不过，咱们今天不聊做饭，而是来聊聊这个小家伙。
固相酶联免疫斑点技术，咱们可以把它简称为ELISAD。
这个名字虽然长得像外星人，但它的原理其实非常简单。
就像你在学校里做的实验，往显微镜底下看看细胞。
它利用了一种叫抗体的东西，专门识别目标物质。
你可以把抗体想象成个非常挑剔的朋友，只有看到自己喜欢的东西才会欢呼雀跃。
哦，对了，这个过程可有趣了，简直就像在举办一场盛大的聚会。
你知道吗，这个技术的关键在于“固相”这个词。
也就是说，它需要把目标物质固定在某个地方。
就像钉子钉在墙上一样，稳稳当当地呆在那里。
这样一来，抗体就能方便地找到它们的“朋友”，然后通过一系列反应，给你展示结果。
简直像是一场寻宝游戏，越找越有趣。
再说说检测的过程。
想象一下，你的朋友们都来了，大家一起来参加这个聚会。
每个人都有自己的名字，抗体的名字就是它们识别的目标。
如果你想知道锅里有多少盐，抗体就像个侦探，带着放大镜一一查看。
检测出来的结果，就像是聚会结束后的成绩单，让你一目了然。
哇，真是个聪明的办法！而且这个技术的应用范围可广了，简直是无所不能。
医学、环境监测、食品安全，哪儿都能看到它的身影。
比如，检测血液里的病原体，确保咱们的身体健康。
这就像是找个医生给你做体检，提前发现问题，早早处理。
谁不想健康长寿呢？想想看，等你老了，还能和孙子孙女一起追逐打闹，那多好啊！说到这里，不得不提一下，固相酶联免疫斑点技术还有个好处，就是操作相对简单。
没那么复杂，就像做个蛋炒饭，火候掌握得当，就能出奇迹。
它不需要太多设备，就像是家里简单的厨具，也能搞定一桌好菜。
快速的反应时间也让它在急诊和研究中倍受青睐。
想想看，当你急需结果时，它能像闪电一样给你答案，真是太贴心了！技术再好也难免有些小缺陷。
酶联免疫斑点法的操作方法
酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。
下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。
一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。
- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。
- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。
- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。
- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。
- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。
- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。
2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。
- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。
二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。
- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。
- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。
- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。
2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。
3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。
- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。
4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。
- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。
5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。
酶联免疫斑点技术(ELISPOT)及其应用研究进展
者方 面 具有 ９％ ９ 的符 合 率 。当 比较 Ｔ Ｔ方 法和 自 Ｓ
建 Ｅ ＩＰ Ｔ方 法 时发现 ， ６ 的 Ｔ Ｔ阳 性 受试 者是 ＬＳ Ｏ ３％ Ｓ Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ阴性 ， ２ 的 Ｔ Ｔ阴 性 受 试 者 是 Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ Ｌ ＳＯ １％ Ｓ ＬＳ Ｏ 阳性 。另 外 ， ８ 的 Ｅ ＩＰ Ｔ Ｍ Ｔ阴性 受 试 者 是 ７％ ＬＳ Ｏ— Ｐ Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ Ｂ Ｇ阳 性 ， 这 些 人 中 大 部 分 都 接 种 过 Ｌ ＳＯ —Ｃ
胞 中检 出 １ 分 泌待 检 Ｃ 个 Ｋ的细 胞 ， 其灵 敏 度 非 常 高 。 为其 使用 了识 别 Ｃ 子 中 ２ 不 同表 位 因 Ｋ分 个 的 ２种 单克 隆抗 体 ，因而 这种 方 法有 着 高度 的特
异性 ［。 过显 色 反应 ， ５通 ］ 在细 胞 分泌 可溶 性 蛋 白的 相应位 置 上显 现清 晰 可辨 的斑 点 ，可 直接 在 显 微 镜下 人工 计数 ，或通过 Ｅ ＩＰ Ｔ分 析 系 统对 斑 点 Ｌ ＳＯ
领 域 。本 文介 绍 了 Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ的原 理 和特 点 ，对 Ｅ ＩＰ Ｔ的应 用 研 究进 展 进行 了综述 。 Ｌ ＳＯ ＬＳＯ 关 键 词 ：酶联 免疫 斑 点 （Ｌ Ｓ Ｏ 应 用 Ｅ ＩＰ Ｔ 中 图分 类 号 ：￥ ５ ． ＋ ８ ２ ４３ 文 献 标 识 码 ：Ａ
进 行计 数 ， 进行 高通 量 筛选 ， 率远 远 高 于其他 检 效
测 方法 ［。Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ自创 立 至今 ２ ６ ＬＳＯ ］ ０多 年来 不 断发
Ａ ｓ ｙＥ ＩＰ Ｔ 技术 是利 用预 先包 被好 抗 原或抗 ｓａ ，ＬＳ Ｏ ） 体 的微量 板从 单细 胞 水平 检测 特异 性 抗 体分 泌 细 胞或特异 性细胞 因子 （ｙｏ ｉｅＣ） ｃ ｔｋ ｎ，Ｋ 分泌细 胞 的免 疫 学检测技 术 。 ９ ３年 ，ｅｇ ｉｋ 和 Ｃ ｅｋｎ ｋ １８ Ｓ ｄｗ ｃ ｔ ｚｒ ｉｓ ｙ 嘲 等根据 酶 联免疫 吸 附试验 （Ｌ Ｓ） Ｅ ＩＡ 的基 本原 理 结
酶联免疫斑点技术 -回复
酶联免疫斑点技术-回复酶联免疫斑点技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用于测定抗原或抗体的高度敏感和特异性的实验方法。
本文将详细介绍ELISA的原理、步骤和应用。
一、ELISA的原理ELISA技术基于抗原与抗体之间的特异性相互作用。
ELISA通常使用多孔板作为试剂的固相载体，先在孔板上固定特定抗原或抗体，再根据需要加入待测样品和检测抗体。
通过特异性抗原-抗体反应的信号产生，可以对待测物进行定量或定性分析。
ELISA有两种基本的原理：直接ELISA和间接ELISA。
1. 直接ELISA：直接ELISA是利用特异性抗体与待测物发生直接的非共价相互作用。
在这种方法中，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。
如果待测物包含目标抗原，它将与特异性抗体结合，并固定在多孔板上。
然后，加入适量的检测抗体，该抗体被标记有一种酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）。
最后，加入合适的底物，当酶与底物反应时，也就是产生了颜色，可以通过酶促反应的信号强度来确定待测物的浓度。
2. 间接ELISA：间接ELISA是通过待测物与特异性抗体结合，然后再加入检测抗体与该复合物结合。
首先，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。
如果待测物中含有目标抗原，它将与特异性抗体结合并固定在多孔板上。
然后，在充分洗涤去除未结合的物质后，加入标记有检测抗体的二抗。
这些二抗一般与小鼠、兔子等动物蛋白特异性抗体结合，并与待测物-抗体复合物发生特异性反应。
最后，如同直接ELISA，加入适当的底物来检测酶促反应。
以上是ELISA技术的两种基本原理，根据待测物的特性和实验需求，可以选择合适的方法进行分析。
二、ELISA的步骤ELISA方法通常包括固相处理、解离、检测抗体的加入、洗涤、底物发色反应和测定等步骤。
1. 固相处理：将特异性抗体固定在多孔板上。
根据需要，可以使用直接ELISA或间接ELISA的原理选择适合的抗体。
酶联免疫斑点技术及其在结核诊断中的研究进展
作者单位 ：北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研 究室 通讯作者 ：张宗德 ，电子信箱 ：ｚｄ １＠１３ｃ ｒ ｚ ４ ７ ６ ．ｏ ｎ
结核 病与 胸部 肿 瘤 ２０ ０ ８年 第 ４ 期 胞 。Ｅ ＩＰ 简 单 、 稳定 、灵 敏 ，不 受细 胞 Ｌ Ｓ ＯＴ 因子 代 谢等 因素 的 影 响 ，可 在单 细胞 水 平 检 测 淋 巴 细胞 对 特 异 性 抗 原 的 反 应 能 力及 计 数 特 异性 抗 原 刺 激 下 分 泌 性 淋 巴细 胞产 生 的 情 况 ，能够 比较 真 实 地 反 映 体 内 细胞 因子 的 水 平 ，Ｅ Ｉ Ｐ 现 已被 运 用 于 各 种疾 病 诊 断 和 Ｌ Ｓ ＯＴ 科 学研 究 中 。 Ｔ Ｔ 应 用 的纯 化 蛋 白衍生 物 （ｕｉｅ Ｓ所 ｐ ｒ ｉｄ ｆ ｐｏ ｉｄｒ ａｖｓ Ｐ ｒｔｎ ｅｉ ｔ ｅ，Ｐ Ｄ）是 存在于结 核分枝 杆 ｅ ｖｉ
产 生 多 种 细胞 因子 发 挥 免疫 效 应 ，其 中 Ｙ干 扰 素 （Ｆ Ｙ）是 最 为 关键 的细 胞 因子 。 因 ＩＮ—
此 ，检 ￣ ｌＮ— 水 平或 分 泌ＩＮ— ｇ Ｆ Ｆ Ｙ的 效应 Ｔ 细 胞 的水 平就可 以判 断是 否存在 结核 感染 。 Ｅ ＩＰ Ｔ 通 过 检测 分 泌 细 胞 因子 的细 ＬＳ 量 夹 ， Ｌ Ｓ Ｌ Ｓ ＯＴ ￣Ｅ Ｉ Ａ方 法 ：
结核 诊断 技 术 ，它是通 过抗 原特 异性Ｔ 巴细 淋 胞 反应 频 率 来 检 测结 核 感 染 患 者 的 细胞 免 疫
功能 。
１酶联免疫斑点技术的原理
结 核 病 的 免疫 学 机 制 主要 是 机 体 对结 核
２ ９５
敏 感度 均 为 ８ ％，健 康 成 人 中Ｐ Ｄ－Ｌ Ｓ ＯＴ ０ Ｐ Ｅ ＩＰ 的 敏 感 度为 ９ ％；英 国健 康 成 人 中两 种 肽 段 ８
ELISPOT技术简介及实验步骤
one spot
ELISPOT技术优点
• 高灵敏度：单个细胞水平检测，极低频的阳性细胞检
出率——百万分之一
• 高通量：每个研究人员每天可做上百样本的检测 • 冻存标本的检测 • 安全：无放射性污染 • 高性价比：一般细胞实验室即可进行。
ELISPOT应用
• 疫苗开发：评估疫苗效力，或疫苗注射路径影响 • 传染疾病研究：HBV-ELISPOT、TB-ELISPOT • 过敏机制探讨：IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与
双因子酶联斑点检测
IFN-
IL-4
IFN-/IL-4
双因子荧光斑点检测
IFN-
IL-13
IFN-/IL-13
多色荧光斑点检测
IFN-
IFN-/TNF-/IL-10
TNF-
IL-10
BioRreader 读板
BioReader 3000
BioReader 5000
BioReader 4000
8.ELISPOT技术服务
ELISPOT 全国用户培训 ELISPOT 试剂开发服务
3.试剂的准备
*预包被ELISPOT技术
™ 预包被ELISPOT 试剂盒
6.实验室质控
*ELISPOT质控技术
冻干多价非特异性刺激物 PHA和PMA/IMC ELISPOT细胞质控品
PBMC-SPOTTM细胞
F肽特异性刺激肽
1
B2
1.1
22
69
2,818
6,715
Real Plate B3
1.2
30
77
3,466
11,915
Real Plate D5
12.2
65
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酶联免疫斑点技术介绍一、ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。
在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。
每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞，这些细胞被称为斑点形成细胞（Spots forming cells SFCs）。
统计膜上的斑点的数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的频率。
其实验原理如下所示：1.特异性的单克隆抗体包被在培养板的孔底部；2.封闭所能结合单瓣的其他部位；3.加入细胞及以及刺激物培养，阳性细胞分泌细胞因子，被细胞下方的单克隆抗体捕获；4.移出细胞，洗涤；5.加入生物素标记的第二抗体（和双抗体夹心法ELISA类似）；6.加入酶标链霉亲和素；7加入显色底物，在酶的催化分解下，产生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；8.斑点计数（可以人工计数，也可以使用自动的读板仪来计数），数据处理，结果分析。
2. ELISPOT的发展历史ELISPOT方法从创立至今已经有20多年的历史了。
1983年，在地球南北两个半球地理位置相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立的创立了这项技术。
一个研究小组位于澳大利亚西部的柏斯Peth，牵头人是当时正在当地Margaret女王医院儿童医学研究所攻读博士学位的Jonathon D. Sedgwich （Sedgwick JD et. al., 1983）。
另一个研究小组位于北欧瑞典城市哥德堡Gothenburg，带头人是哥德堡大学医学微生物系的学者Cecil C. Czerkinsky （Czerkinsky CC et. al., 1983a）。
前者开创ELISPOT方法是为了研究B淋巴细胞分泌IgM抗体的情况（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）；而后者除了用于研究B淋巴细胞分泌抗体的情况（Czerkinsky CC et. al., 1983b; 1983c），还应用于大肠杆菌分泌肠毒素（Czerkinsky CC et.al., 1983a）和成纤维细胞分泌纤维连接蛋白（Czerkinsky CC et. al., 1984）的研究中。
虽然研究的对象不一样，但是该实验技术所涉及的原理以及方法步骤和我们现在的标准ELISPOT几乎完全相同。
这二十多年来，ELISPOT基本技术并没有什么重大变化，但是技术进步一直没有停顿，实验材料的改进了，实验灵敏度与重复性提高了，实验应用领域也拓宽了。
1) 底板材质的改进ELISPOT技术从创立之初，检测底板都是使用的普通塑料板，它的蛋白吸附能力差，因此实验的灵敏度有限。
1985年，Moller SA和Borrebaeck CA 将膜板引入ELISPOT中（Moller SA et. al., 1985），检测的也是分泌抗体的阳性B细胞。
他们引入的是硝酸纤维素膜，获得了远远优于塑料板的结果。
1995年，荷兰Utrecht大学免疫研究所的Schielen P团队（该团队后来挂靠Utrecht大学，创办了荷兰U-Cytech公司，成为世界上顶级的ELISPOT试剂盒生产商之一）把一种更优于硝酸纤维素膜的PVDF膜也被引入了ELISPOT检测中（Schielen P et. al., 1995）。
做过Westernblot的人都知道，PVDF膜比硝酸纤维素膜有更优的蛋白吸附性质，更加精细的显色条带分辨率。
因此，PVDF的引入是继硝酸纤维素膜之后，ELISPOT 底板材料的又一次重大突破（McCutcheon M et. al., 1997）。
至今，PVDF膜几乎完全取代了NC膜（Weiss AJ 2005）。
“反者道之动”。
塑料板在被膜板取代之后，沉寂了许多年，现在又开始兴旺起来了（Ronnelid J et. al., 1997; Okamoto Y et. al., 1997）。
最著名的塑料ELISPOT板当数荷兰U-Cytech公司研发的透明板，已经成为了该公司的一大特色。
塑料ELISPOT板的重新兴旺有两个方面的原因：一方面是技术进步，在塑料材质的改进之后，板底吸附蛋白的能力已经比传统的塑料板有了很大提高，虽然还赶不上膜板，但是应付ELISPOT实验已经绰绰有余。
更高质量的抗体也有利于塑料板获得更好的ELISPOT结果。
另一方面归因于塑料板自身的优势，相对低廉的价格，简化的操作步骤，简短的实验时间都是塑料板的优势（Ronnelid J et. al., 1997）。
此外对于透明板，还可以在实验中随时观察细胞的状态与密度，这对新手是很重要的。
2) 检测内容的多样化在ELISPOT技术创立之初，主要用于检测B淋巴细胞分泌的抗体，包括各种类型的免疫球蛋白，包被的材料是特异性的抗原或者抗体的抗体（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）。
B细胞分泌的抗体一般的量比较大，容易检测，即使早期ELISPOT检测的灵敏度不够高，检测大量分泌的抗体还是不成问题的（Bjorkander J et. al., 1991; Ahlfors E et. al., 1991; Holmgren J et. al., 1992a）。
时至今日，ELISPOT检测还广泛地用来研究粘膜免疫中的抗体分泌情况（Holmgren J et. al., 2005）。
后来随着技术的进步，ELISPOT 检测的灵敏度有了大幅度的提高，以至于可以检测到痕量的细胞因子，于是它的主要应用就转移到检测细胞因子上来了（Czerkinsky C et.al,. 1988a; 1991; Hutchings PR et. al., 1989）。
现在各种常见细胞因子的检测都有了商业化的试剂盒，使用起来非常方面。
能商业化检测的细胞因子包括人类、小鼠、大鼠、猴子、猩猩的干扰素（γ-IFN）、白介素（IL-2，4，5，6，10，12等）、颗粒酶（Granzyme B）、肿瘤坏死因子（TNF-α）。
目前全球ELISPOT 试剂盒的主要供应商有：荷兰U-CyTech公司、瑞典Mebtech公司、法国Diaclone公司、美国BD Pharmingen公司和R&D公司。
他们的产品各有特点，其中荷兰U-CyTech公司的产品质优价廉，在国内市场居于主导地位。
3) 多细胞因子的检测通常的ELISPOT检测每个孔只检测一种细胞因子。
如果要在一个ELISPOT孔内同时检测两种或者两种以上的细胞因子，可以包被两种抗体以捕获两种细胞因子，然后用两种不同的酶联抗体以及显色剂显出两种斑点来。
早在1988年，Cecil C. Czerkinsky就提出并且实现了这种想法（Czerkinsky C et.al,. 1988b）。
但是，双色ELISPOT有一个与生俱来的弱点，那就是斑点分离的问题。
大家知道，斑点的混合色属于物理学上“颜料的三原色”问题，两种不同颜色的颜料如果以不同的比例混合，会出现一系列不同的表观颜色。
其中的细微差异，人的肉眼有时候都难于判断，何况是自动的读板仪。
所以，在双色ELISPOT斑点识别上，总会有些混色的斑点无法正确的识别与分类。
为了解决这个难题，人们想到了用荧光元及检测ELISPOT的方法（Ruedl C et. al., 1994; Sarawar SR et. al., 1994）。
不同颜色的荧光混合在一起，只要加一张滤光片，就可以精确的滤出目标荧光，而遮蔽掉其它颜色的荧光，荧光之间可以互不干扰。
这对于双因子，甚至多因子ELISPOT检测都是十分理想的手段（Gazagne A et. al., 2005）。
但是荧光ELISPOT检测目前还有不足之处。
由于荧光素直接偶联在抗体或者亲和素上，缺乏酶催化底物的那种放大作用，所以灵敏度还无法和化学显色的ELISPOT方法比较（Gazagne A et. al., 2005）。
此外，硝酸纤维素膜自身在激发下就会发荧光，所以不适合做荧光ELISPOT底板材料。
PVDF膜也有自身发荧光的问题，虽然不像硝酸纤维素膜那样严重，但是也会造成背景升高，信噪比下降的问题（Gazagne A et. al., 2005）。
荷兰U-Cytech公司已经发开出了新一代的荧光底板介质Hydrogel™，它既有很高的抗体吸附性质，又没有荧光背景。
Hydrogel™目前存在的唯一问题是保存起来不够稳定，限制了它的推广。
综上所述，多细胞因子检测是ELISPOT未来的一个发展方向，但在技术上还不够成熟，有待于改进。
二、ELISPOT的方法由于有商品化的试剂盒，ELISPOT操作本身已经大大简化。
目前的ELISPOT试剂盒按抗体的包被情况分为已包被板的和未包被板的两类。