分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
酶联免疫斑点检测技术对结核性脑膜炎的诊断分析
酶联免疫斑点检测技术对结核性脑膜炎的诊断分析结核性脑膜炎是由结核分枝杆菌感染引起的一种病毒性脑膜炎，其症状包括头痛、发热、恶心、呕吐、抽搐等，严重时可导致神经系统和认知功能损伤。
因为该病的症状常常类似于其他病毒性脑膜炎症状，难以通过临床症状来确诊，因此需要靠特定的实验室检测方法进行诊断。
酶联免疫斑点检测技术（Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISPOT）是一种用于检测细胞因子、抗体、蛋白质等的生物分子的定量分析方法，其原理是通过特定的抗体捕获被检分子，进行显色反应并计数，从而得出样品中所含目标分子的浓度。
这种技术可以用于检测具体的细胞因子、蛋白质等分子，对于结核性脑膜炎的诊断也有很高的应用价值。
在酶联免疫斑点检测技术中，将患者血清样本与结核分枝杆菌特异性抗原结合，使得与该菌感染相关的蛋白质或抗体形成复合物，然后通过酶标记的特异性二抗捕获复合物并显色。
若样品中含有结核分枝杆菌特异性抗体，则会形成具有分子特异性的抗体斑点，否则则不会有这些斑点。
因此，结核性脑膜炎患者的血清样品所形成的斑点数量越多，就越可以证明该患者存在结核分枝杆菌感染的可能性。
酶联免疫斑点检测技术有许多的优势。
首先，该技术有很强的特异性和灵敏度，可以精确地检测出异物样本中特定的分子。
其次，该技术操作简单、快捷，样本数量也可以灵活调整。
此外，该技术可以在早期诊断结核性脑膜炎疾病，有很高的临床应用价值。
但是，该技术也存在一些问题。
首先，人体有时会出现假阳性反应，导致并不表示其真实感染结核分枝杆菌，这需要通过配合其他临床方法来确定是否为真实感染。
此外，该技术的检测结果可能受到患者病情、抗体水平等因素的影响，需要在检测前进行充分的预处理和准备。
总的来说，酶联免疫斑点检测技术在结核性脑膜炎的诊断中有很高的应用价值。
虽然该技术还有一些问题需要解决，但已经成为了现代医疗技术的一种重要手段，为临床医生提供准确的疾病诊断和治疗建议。
elispot的原理及应用
Elispot的原理及应用1. Elispot是什么Elispot（enzyme-linked immune spot assay）是一种用于测定单个细胞的分泌功能的实验技术。
它通过检测分泌细胞在特定条件下产生的细胞因子或细胞分泌物的分泌量，来评估细胞的免疫反应。
Elispot被广泛应用于免疫学、肿瘤学、感染病学等领域的研究和诊断。
2. Elispot的原理Elispot基于细胞分泌物的分泌原理进行测定。
其原理主要包括以下几个步骤：1.准备ELISPOT板：将特定抗体或刺激物涂覆在固相支持体上，形成抗原或刺激物捕获层。
常用固相支持体有多孔膜、96孔板等。
2.加样细胞：将待测细胞或其他产生细胞分泌物的细胞加入到ELISPOT板中，使其与抗原或刺激物接触。
3.细胞刺激：经过一定的培养条件和时间，刺激细胞产生分泌物。
4.分泌物检测：将细胞移除，用特异性抗体标记待测细胞分泌物中的目标分子，形成复合物。
5.免疫反应可见化：通过酶标法或荧光法，使复合物与ELISPOT板上的底物发生反应，产生可观察的斑点。
3. Elispot的应用Elispot技术广泛应用于以下领域：3.1 免疫学研究Elispot可以用于研究多种细胞因子的产生情况，如干扰素γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等。
它可以检测单个细胞的分泌情况，并通过对不同细胞类型进行比较，揭示免疫细胞的功能和相互作用。
3.2 肿瘤学研究Elispot可以评估肿瘤特异性T细胞的活性和功能。
通过使用与肿瘤相关的抗原刺激细胞，可以检测肿瘤特异性T细胞的分泌情况，进而评估免疫治疗的效果和抗肿瘤免疫应答的强度。
3.3 感染病学研究Elispot在感染病学研究中起到重要作用。
通过检测特定感染病原体的抗原刺激下，细胞分泌物的产生情况，可以评估免疫应答的强度和类型，并且可以用于疫苗开发和新药筛选等领域。
3.4 自身免疫性疾病研究Elispot可以用于评估自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等）患者的自身免疫反应。
酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用
提供 ， 脑脊液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） 平 ≥５０ ｃｐｅ／ ｌ 断 为 阳 ＢＤ Ａ（ Ｃ 水 ０ ｏ ｉ ｍ 判 ｓ
性 ， ５ ０ｃｐｅ ｍ 判 断 为 阴 性 。 检 测 结 果 使 用 Ｐｉ ５０软 ＜ ０ ｏｉ ／ ｌ ｓ ｒｍ ． ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组 间率 的比较采用卡方
特 异 性 ｒ 扰 素 （Ｆ —） 平 可 以 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 的 干 ＩＮ ｒ 水
断为 阳性 ， 抗 原 检 测 结 果 为 阴性 ， 果 判 断 为 阴 性 ； 有 ３种 结 所 脑 膜 脑 炎 病 例 均 常 规 行 脑 脊 液 Ａ Ａ、 脊 液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） Ｄ 脑 Ｂ Ｄ Ａ（ Ｃ
检测 。脑脊 液 Ａ Ａ使 用 酶 标 法 进 行 检 测 ， 据 国 内 同行 Ｄ 根 ２０ ０４年对脑脊 液 Ａ Ａ在结 核性脑 膜脑 炎 中研 究 的标准 Ｊ Ｄ ， 脑脊液 Ａ Ａ１８Ｕ Ｌ判断为 阳性 ， ８Ｕ Ｌ判断为阴性 ； Ｄ ＞ ／ ＜ ／ 脑脊
液 Ｔ —Ｎ Ｂ Ｄ Ａ荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应 试剂 由达 安 基 因有 限 公 司
选 非 结 核 性 脑 膜 脑 炎 病 例 均 通过 临床 治 疗 转 归 及 实 验室 检 查 最终确诊 。
方 法
所 有 病 例 均抽 取 乙 二 胺 四 乙 酸 （ Ｄ Ａ） 凝 血 ５ｍ ， ＥＴ 抗 ｌ送
实 验 室 行 Ｅｉ ｏ检 测 。检 测 结 果 根 据 斑 点 数 量 设 定 ， 一 反 ｌｐ ｔ ｓ 每
术 在 结 核 性 脑 膜脑 炎 中 的应 用 价 值 。
临 床 资 料
、
果
在 ７ 例 结 核 性 脑 膜 脑 炎 的 诊 断 中 ，ｌｐ ｔ 性 者 ４ ３ Ｅｉ ｏ 阳 ｓ ５
ELISPOT工作原理
ELISPOT工作原理关键信息项：1、 ELISPOT 技术的定义2、涉及的实验材料和设备3、实验操作步骤4、数据采集与分析方法5、技术的优势和局限性11 ELISPOT 技术的定义ELISPOT（EnzymeLinked Immunospot Assay），即酶联免疫斑点检测技术，是一种用于检测和定量单个细胞分泌特定蛋白质的免疫学方法。
111 原理概述ELISPOT 基于细胞分泌的蛋白质能够在细胞周围的固相载体上形成可见斑点的原理。
当被检测的细胞受到特定刺激后，会分泌特定的细胞因子或抗体等蛋白质。
这些分泌的蛋白质会被预先包被在固相载体（通常是微孔板）上的特异性抗体捕获。
112 与其他技术的比较与传统的 ELISA（酶联免疫吸附测定）方法相比，ELISPOT 能够检测单个细胞的分泌水平，而 ELISA 则是对细胞群体分泌的总和进行测量。
12 涉及的实验材料和设备121 固相载体通常使用 96 孔或 384 孔的微孔板，表面经过特殊处理以增强抗体的吸附。
122 捕获抗体针对待检测的细胞因子或蛋白质的特异性抗体，用于包被微孔板。
123 检测抗体与捕获抗体识别不同表位的另一种特异性抗体，通常与酶标记物结合。
124 酶标记物如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等，用于催化显色反应。
125 显色底物根据所使用的酶标记物选择相应的显色底物，产生可见的斑点。
126 细胞培养相关试剂包括培养基、血清、刺激剂等。
127 细胞分离和制备设备如离心机、移液器等。
13 实验操作步骤131 微孔板包被将捕获抗体稀释至适当浓度，加入微孔板中，在适当条件下孵育，使抗体吸附在微孔板表面。
132 封闭用封闭液封闭微孔板上未结合抗体的位点，以减少非特异性结合。
133 细胞接种将处理好的细胞悬液加入微孔板中，在特定条件下培养。
134 刺激根据实验目的，加入适当的刺激剂，诱导细胞分泌目标蛋白质。
135 孵育在适当的温度和时间条件下孵育，使细胞分泌的蛋白质被捕获抗体捕获。
ELISPOT技术应用简介
具体操作流程及常见问题
◆ 操作流程演示
◆ 常见问题小结
13
第一天
第二天
1 2 3 4 5 6 7
PVDF膜酒精浸润 PBS洗涤三次 预包被可 加包被抗体过夜 以省去的 步骤 PBS洗涤三次 封闭，室温2小时 PBS洗涤三次 加入细胞和刺激物孵育过夜
无 菌 操 作
第三天
8 去除细胞，PBST4℃十分钟后洗涤三次 9 加检测抗体，室温孵育1.5小时 10 PBST洗涤三次 11 加SAP室温孵育1小时 12 PBST洗涤三次 13 加入 BCIP/NBT显色 14 计数，结果分析
1 2 3
人血分离 PBMC 方案
小鼠脾脏 淋巴细胞 分离方案
小鼠、大 鼠、兔子 血液淋巴 细胞 分离方案
40
厂家
产品编号 AS1114544 AS1114545 用途 主要成分 密度 渗透压 AS1019818
产品名称 LymphoprepTM 分离液（即 用型） （也称之为淋巴细胞分离液）
规格
MABTECH ELISpot技术 应用简介
任东 莱兹技术部
1
ELISpot原理、优势及应用
主 要 内 容
具体操作步骤 常见问题总结
技术的改进
参考文献
2
Mabtech 公司是世界首家研发和生产ELISpot 试 剂盒的公司，为广大科研和临床用户提供稳定的 高质量的产品，包括人类、非人灵长类、大鼠、 小鼠等种属的T淋巴细胞因子和B细胞分泌抗体检 测产品，其中非人灵长类试剂盒是科研人员首选 之品。
36
爱恨交加的 血清培养基
血清这一生物制品，含有 许多未知成分，以及受着 动物个体差异的影响
实验需要血清
细胞孵育离 不开血清 实验要避开 血清干扰
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
酶联免疫斑点技术
酶联免疫斑点技术摘要:介绍了酶联免疫斑点技术(ELISPOT)的发展历程，检测原理及应用方面的相关内容。
关键词：酶联免疫斑点技术；免疫检测技术随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。
在研究免疫应答机制时, 以往人们常用酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测体液中游离的细胞因子(CK) 或抗体, 但由于游离的循环抗体或CK 半衰期不同, 使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合, 而不能确切地反应体内抗体及CK 水平。
80 年代中期, Sedgw ick、Ho lt 和Czerk in sky 等根据ELISA 技术的基本原理, 建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点(ELISPOT) 技术, 因其具有较高的特异性和敏感性, 目前正被国内外广泛应用, 对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
1.ELISPOT技术的发展史1.1溶血空斑技术.80 年代初用于检测抗体形成细胞, 是对细胞免疫学的重要方法学贡献, 可从单细胞水平研究抗体的产生。
但该方法不够灵敏。
另外, 许多抗原决定簇与红细胞表面耦联困难, 使该方法应用受到限制。
1.2细胞ELISA.以酶标记物取代放射标记定量细胞表面分子, 因微量板内有细胞的存在将会产生较高背景。
另外, 细胞需固定于平板上, 也会引起非特异性结合, 产生假阳性结果。
固定还会引起一些细胞表面抗原的破坏而影响检测的敏感性。
1.3ELISPOT.由于上述原因, 1983 年两个研究小组分别在瑞典和奥地利同时报道了另一抗体分泌细胞的检测技术, 即ELISPOT。
1988 年, 首次用该方法检测CK IFN-γ分泌细胞, 目前已多用此方法检测CK, 其技术方法亦在逐步更新。
多年来作者实验室已用该方法检测重症肌无力及多发性硬化患者外周血的CK 分泌细胞, 共计数百例, 并发表论著数篇, 总结了一些方法学方面的经验。
ELISPOT技术简介及实验步骤
one spot
ELISPOT技术优点
• 高灵敏度：单个细胞水平检测，极低频的阳性细胞检
出率——百万分之一
• 高通量：每个研究人员每天可做上百样本的检测 • 冻存标本的检测 • 安全：无放射性污染 • 高性价比：一般细胞实验室即可进行。
ELISPOT应用
• 疫苗开发：评估疫苗效力，或疫苗注射路径影响 • 传染疾病研究：HBV-ELISPOT、TB-ELISPOT • 过敏机制探讨：IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与
双因子酶联斑点检测
IFN-
IL-4
IFN-/IL-4
双因子荧光斑点检测
IFN-
IL-13
IFN-/IL-13
多色荧光斑点检测
IFN-
IFN-/TNF-/IL-10
TNF-
IL-10
BioRreader 读板
BioReader 3000
BioReader 5000
BioReader 4000
8.ELISPOT技术服务
ELISPOT 全国用户培训 ELISPOT 试剂开发服务
3.试剂的准备
*预包被ELISPOT技术
™ 预包被ELISPOT 试剂盒
6.实验室质控
*ELISPOT质控技术
冻干多价非特异性刺激物 PHA和PMA/IMC ELISPOT细胞质控品
PBMC-SPOTTM细胞
F肽特异性刺激肽
1
B2
1.1
22
69
2,818
6,715
Real Plate B3
1.2
30
77
3,466
11,915
Real Plate D5
12.2
65
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特点：
❖斑点可持久保存并进行计数分析
❖易操作、有效、快速、灵敏度高
✓ 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 ✓ 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
❖样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分 析系统进行快速、客观的分析
❖
基
Coating Ab
本
包被培养孔
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
❖ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）
▪ 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即 ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子 的分泌情况；
▪ 用抗体原位捕获培养中的细胞分泌的细胞因子， 并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
❖双色ELISPOT结果示意图
蓝色：IFN-γ,红色：IL-2; 蓝色：IFN-γ,红色：IL-17
❖ ELISPOT
▪ B细胞杂交瘤的筛选 ▪ 化合物和药物免疫学反应的检测 ▪ 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 ▪ 靶向疫苗的质控
方 ▪ 自身免疫疾病的诊断和预后分析 法 ▪ 自身免疫疾病免疫治疗的监控 主 ▪ 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 要 ▪ 器官移植中排斥反应的预测 用 ▪ 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 途 ▪ 结核病的诊断
▪ 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
❖ ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图
细胞因子A
双抗体包被
❖双色ELISPOT原理
培养细胞 细胞因子B
包被抗体
Biotin-检测抗体
HRP-检测抗体 BCIP/NBT底物
AEC底物
碱性磷酸酶streptavidin
斑点形成
细胞因子A 细胞因子B
在倒置显微镜下观察结果
❖技术要点
▪ 预孵育的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液过黄） 会影响斑点的形成
▪ 提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞的干扰
▪ 加入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液
▪ 细胞孵育过程应保证ELISPOT培养板静置，CO2培 养箱应保证稳定，避免震荡
▪ 稀释抗体及GABA冻干粉时建议无菌操作，保存过 程避免细菌的污染以保证其效用
按实验设计 加入含或不含刺激剂的培养液 及一定数目细胞孵育20-24小时
去除细胞
非无菌
PBST洗板
加入生物素标记 的detector Ab
室温孵育2小时后，PBST洗板
加1小时后，洗板
加入显色剂I/II, 暗处室温孵育20-30分钟
去离子水清洗培养板 室温干燥后
孵育
活化的淋巴细胞可分泌细胞 因子与Coating Ab结合
洗除细胞，依次加入生物素 标记的抗细胞因子抗体及酶 标抗生物素抗体进行反应
加入酶底物显色形成斑点 （SPOT）
❖
基 本 操 作
脾 淋 巴 细 胞
单 核 细 胞 或
直 接 取 外 周 血
Coating Ab 包被培养板
无菌
40C过夜
每孔加入200ul培养基 封闭 室温孵育1小时