肠道致病菌的分离与鉴定
肠道病原菌分离与鉴定二
肺炎球菌对小白鼠的传染试验
实验动物的接种 1．首先将两种菌悬液做涂片，革兰色染色和镜检，以便与后 述死亡动物尸体的细菌学检查结果对比。 2．用消毒好的注射器，按无菌操作法抽取菌悬液后，再用无 菌镊子夹一灭菌棉花纸包，将针头刺入棉花纸包内，排出注射 器内的气体，然后将注射器平置于试管架上。 3．固定小白鼠：用右手轻拖鼠尾，使其爬行于金属网盖上， 再突然用左手拇食两指抓紧小白鼠颈项部及两耳，将鼠体搜入 手掌中，再用左手无名指和手掌夹住小白鼠尾根，以无名指和 小指夹住其左腿。
肠道病原菌分离与鉴定二
肥达氏反应结果观察
试验管自第1管看起，如有凝集(阳性反应)时则于管底呈圆片状、边缘 不整齐的凝集物，轻轻摇动，可见凝块或颗粒浮起，上清透明或有不同 程度的混浊。其凝集的强弱可用“+~++++”号表示如下： “++++” 细菌全部凝集，液体澄清，有大片状，边缘不整齐的凝集块。 “+++” 细菌绝大部分凝集，液体有轻度混浊，凝集块较小些。 “++” 细菌部分沉淀于管底，液体半澄清，凝集块呈颗粒状。 “+” 细菌仅少量凝集，液体混浊。 “-” 不凝集，液体混浊与对照管相似。
记录结果并判定凝集效价。通常以能产生明显凝集(++)的血清最大稀释 倍数做为该血清的凝集效价。
结果分析
首先应了解当地正常人效价，一般凝集价超过正常凝集价才有诊断意 义。
真正的伤寒病人O凝集素出现常较H凝集素为早，存在于血清内时间 较短；H凝集素产生较慢但效价较高，存在时间较长，可达数年。
肠道致病菌检验与鉴定
于伤寒沙门氏菌的分离
如果你喜欢它，那么享受它。不喜
27
欢，那么避开它。避不开，那么改
DHL上的菌落
BS上的菌落
SS上如果的你喜菌欢落它，那么享受它。不喜
28
欢，那么避开它。避不开，那么改
（二）、检验操作关键点
1、增菌：使待检菌复壮，抑制杂菌生长，提高检出率。
前增菌：用于加工过的食品，37℃，4~8h 或18~24h，长有杂菌。 增菌培养基：增菌液一般用MM和SC两种，如可能是伤寒沙门
氏菌用TTB，用42℃培养。
如果你喜欢它，那么享受它。不喜
26
欢，那么避开它。避不开，那么改
2、平板分离
四、 致病性
（一）、致病物质 1、内毒素：能引起机体发热，白细胞减少，低血糖，
血压降低，严重者休克。 2、外毒素：对小肠粘膜细胞具有物殊毒害作用，引起
腹泻。如果你喜欢它，那么享 Nhomakorabea它。不喜
5
欢，那么避开它。避不开，那么改
（二）、所致病疾 1、伤寒和副伤寒 2、食物中毒 3、细菌性痢疾
如果你喜欢它，那么享受它。不喜
如果你喜欢它，那么享受它。不喜
8
欢，那么避开它。避不开，那么改
第二节、沙门氏菌检验
一、概况 （一）沙门氏菌的发现与食物中毒 （二）沙门氏菌的命名
根据所致疾病命名 根据菌的发现地区命名 以发现者的名字命名 （三）沙门氏菌的抵抗力 60 ℃ 30′可杀死
如果你喜欢它，那么享受它。不喜
9
欢，那么避开它。避不开，那么改
三、抗原类型
肠道杆菌的分离鉴定
300
≤13
14~16
≥17
≤28
－
≥29
≤12
13~14
≥15Байду номын сангаас
≤12
13~14
≥15
≤11
12~14
≥15
≤13
14~22
≥23
≤15
16~20
≥21
≤12
13~16
≥17
七、肠道杆菌血清学鉴定
原理：细菌作为颗粒性抗原在相应抗体作用下可形成肉 眼可见的凝集颗粒。
可疑菌落 -阴性
可疑菌落 +阳性
标本
SS培养基
②
①
P
N ③
Name time 小辫法
④ 分区划线法
注意：每划完一个区进行下一区之前取菌环要灭菌
粪便标本接种： 标本：1）病人粪便（阳性标本）； 2）正常人粪便（阴性） 培养基：SS平板 操作：将SS平板上分两个区，分别接种病人和正 常人标本。 要求：使用正确的画线方法，必须培养出单个菌落以备后续实
氨苄西林
AM
ATCC25922 金黄色葡萄球菌
10
ATCC25923
大肠埃希氏菌
庆大霉素
GM
ATCC25922 金黄色葡萄球菌
10
ATCC25923
链霉素
S
大肠埃希氏菌 ATCC25922
10
金黄色葡萄球菌
红霉素
E
ATCC25923 肺炎链球菌
15
ATCC49619
磺胺甲基异 噁唑
SMX
金黄色葡萄球菌 ATCC25923
葡磷胨水 （绿色盖） E.a
葡磷胨水 （绿色盖） E.coli
肠道微生物的分离与鉴定方法
一、有益菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，柔嫩梭菌，丁酸梭菌，芽孢杆菌（枯草、地衣）。
5种有害菌：大肠杆菌，沙门氏菌，产气荚膜梭菌，空肠弯曲杆菌。
4种二、厌氧菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，产气荚膜梭菌，丁酸梭菌，柔嫩梭菌。
5种需氧菌：芽孢杆菌。
1种兼性厌氧菌：大肠杆菌，沙门氏菌。
2种注：境中生长最好。
最适温度为37～42℃。
在正常大气或无氧环境中均不能生长。
肠道正常菌群中95%以上为专性厌氧菌，兼性厌氧菌和需氧菌在正常菌群中所占比例较少。
三、一般检测菌株包括厌氧菌中的双歧杆菌、拟杆菌、优杆菌、消化性球菌、乳杆菌及梭菌。
需氧菌中的肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌，及酵母菌等。
四、无氧环境的简易操作：1、方法来自文献《健康羊驼粪球中主要正常菌群的分离与初步鉴定》采用干燥器培养，1m3空间用焦性没食子酸10g、10%氢氧化钠溶液l00mL，按比例取10%的氢氧化钠液置于干燥器皿底部，然后放置2到3个略高于液面的青霉素小瓶，再按比例称取焦性没食子酸用纸包好，放在圆柱上。
继而放上隔板,将接种完毕的培养基放于隔板上，同时放美蓝指示剂一管。
盖上缸盖并用石蜡封闭。
再轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸掉人氢氧化钠液中，反应后，干燥器内无氧，美蓝指示剂由蓝变白。
置于温箱37℃培养24一48h观察结果。
2、方法来自文献《健康猪肠道菌群的分离培养与耐药性分析》后者先拧紧瓶盖,放入密封性较好的玻璃罐(用凡士林封口)，通过蜡烛燃烧法制作简易厌氧装置。
五、CO2培养箱不可代替无氧培养箱厌氧箱一般是组合气体90%氮气+5%氢气+5%二氧化碳，厌氧箱里面培养的微生物都是厌氧微生物；而二氧化碳培养箱里面是5%二氧化碳+95%空气，里面是有一部分氧气的。
一般的研究认为严格厌氧菌的培养环境中O2的浓度必须小于1000ppm（千分之一），更严格的环境是小于300ppm（万分之三），本实验室CO2培养箱CO2浓度范围为280-2000ppm，所以CO2培养箱是不能用来培养严格厌氧菌。
大肠杆菌的分离鉴定
大肠杆菌的分离鉴定
大肠杆菌是一种重要的肠道细菌，对于科学家和医生来说具有重要的研究和治疗价值。
分离和鉴定大肠杆菌的方法有许多种，本篇文章将介绍几种比较常见的方法。
1. 感染部位样本的获得
首先需要获得感染部位的样本，可分为分泌物、血液、尿液、粪便等。
获得样本的方
法可以根据不同部位进行取样，比如粪便可以通过肛门插入取样器进行获取。
2. 抗生素筛选
将样本接种于相应的富营养基质，对其中加入多种抗生素。
根据对应的扩散系数，只
有大肠杆菌具有生长优势，因此只有大肠杆菌能够在抗生素的存在下继续生长。
3. 纯化
从上面的富营养基质中挑选具有脐带颜色和形态特征的菌落，将其在富营养基质上进
行纯化。
纯化后的大肠杆菌能在多种富营养基质上进行生长即可分离。
4. 经典分离法
包括肉汤琼脂平板法、 MacConkey琼脂平板法、格拉莫琼脂平板法、 EMB琼脂平板法等一系列基本细菌检测方法。
1. 化学特性法
常用方法有氧化氨酸特性试验、熏蒸酸特性试验、脱氧氮碱试验、醛类试验等。
通过
观察变化与发色的差异，以及其化学反应程度来判断是否为大肠杆菌。
通过观察菌落形态、革兰染色阳性反应、运动情况、气体代谢情况等特性判断是否为
大肠杆菌。
可采用比色相比法、蛋白溶液胶片法、氧测定法、etc。
3. 抗原性鉴定
通过采用血相似抗原、鞭毛抗原、菌体抗原等抗原进行抗血清试验，来确定是否为大
肠杆菌。
人体肠道中多雷拟杆菌的分离与鉴定
１ ２ 方法
１ ２ １ 粪便样品的采集和预处理 选择 ４ 位 １ 个月内
没有药物、 抗生素、 益生菌使用史的健康成人作为研究
对象ꎬ 其中男性 ２ 人、 女性 ２ 人ꎮ 研究对象自行采集晨
起第一次排出的新鲜粪便中间段没有接触空气和地面的
序列比对ꎬ ＮＧ０１ 菌株与 Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉ １７５ 的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 相似度达到 ９８ ９６％ ꎮ 结论: 分离得到的 ＮＧ０１ 菌株在细菌
形态、 培养特性、 生理生化反应结果符合拟杆菌属特征ꎮ
关键词: 肠道菌群ꎻ 多雷拟杆菌ꎻ 分离鉴定ꎻ １６Ｓ ｒＲＮＡ 测序
肠道菌群是人体肠道微生物区系的重要组成部分ꎬ
第８ 期
苏晓明等: 人体肠道中多雷拟杆菌的分离与鉴定
６３
图 １ ＮＧ０１、 ＮＧ０２ 血平板菌落形态
２ ２ 菌体形态观察及革兰氏染色镜检
ＮＧ０１ 和 ＮＧ０２ 菌液于显微镜下镜检如图 ２ 所示ꎬ 均
呈小棒杆状、 无芽孢、 排列无规则ꎬ 常单独存在ꎬ 少见
群集ꎮ 革兰氏染色后ꎬ 菌体镜检结果呈红色ꎬ 如图 ３ 所
序: ①９４ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎꎻ ②９４ ℃ 变性 ３０ ｓꎻ ③５５ ℃ 退
火 ３０ ｓꎻ ④７２ ℃ 延申 １ ｍｉｎꎻ ⑤将上述 ３ 个步骤循环 ３０
次ꎻ ⑥最后在 ７２ ℃ 延伸 ５ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ 反应结束后ꎬ 取 ５
μＬ 反应液在 ６０ Ｖ、 ９０ ｍｉｎ 条件下进行 ５％ 琼脂糖凝胶电
氧化酶试纸、 厌氧培养袋、 厌氧产气包、 氧气指示剂ꎬ
中国海博生物技术有限公司ꎻ ＴＩＡＮａｍｐ Ｂａｃｔｅｒｉａ ＤＮＡ Ｋｉｔ
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定.pptx
DHL上的菌落
BS上的菌落
SS上的菌落
3、五项生化试验
1、需氧或兼性厌氧，最适温度37℃， PH7.2~7.4。
(沙门氏菌（红色）侵入人体细胞
• 2、对营养要求不高，在普通培养基生长良 好，37 ℃，24h，能形成菌落中等大小，直 径2～3mm，圆形或卵形，表面光滑湿润， 无色半透明，边缘整齐的菌落
• 3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长， 无菌膜。
1、肠热病：伤寒与副伤寒病，为慢性发热的菌血病。 由伤寒与副伤寒菌引起，潜伏期7~20天
2、急性肠胃类：主要症状：头痛、发热、恶心、呕吐、 腹泻、出冷汗、及全身不适，病程2~3天
3、败血病：高烧、寒战、厌食、局部发炎、由猪霍乱沙 门氏菌等引起
四、微生物检验
（一）、基本步骤（程序） 检样→增菌（前增菌）→分离培养→生化
中也有用小写字母a、n、x等表示。
4、表面抗原：
沙门氏菌K抗原有三种：Vi、M、5抗原、
Vi抗原位于菌体的最表层，包围了O抗原，可阻碍O抗原的血清 学凝集试验。破坏Vi抗原：60℃ 30′，100 ℃ 5′
含有Vi 抗原的沙门氏菌： 伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌
三、沙门氏菌食物中毒
•
F群----O11
•
E群----O3
•
E2群----O3、 O10族
•
E3群----O3、 O15
•
E4群----O1 、O3 、O19
3、H抗原（鞭毛抗原）
耐热性差：60℃15′或酒精处理可破坏
沙门氏H抗原有两种： 第1相：特异相，用英文小写字母表示a、b、c……z
z1~z55 第2相：非特异相，用阿拉伯数字表示1、2、3……其
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
肠道致病菌的分离与鉴定
一、实验目的
(1)掌握肠道致病菌的分离、鉴定的主要步骤
(2)掌握平板划线分离法
(3)掌握玻片凝集试验的操作方法以及实际意义
二、实验材料
(1)实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、
(2)实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基(EMB、克氏双糖铁培养基(KIA)、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基
三、实验流程
(1)肠道致病菌的分离
①待测标本的制作：把接种环放置于点燃的酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌的接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水的试管中，混匀。
②细菌的分离接种：用接种环取适量配置好的细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMBt养基。
将培养基置于37C培养18~24小时。
(2)肠道致病菌的纯化
①单菌落接种：从已培养待测细菌的EMB培养基上用已灭菌的接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37 C培养18~24小时。
②待测细菌的初步判断：取出已纯化培养待测细菌的KIA培养基，
观察现象，初步断定该细菌是致病菌或是非致病菌。
（3）肠道致病菌的鉴定
①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管
内的小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌的接种针取已培养的KIA 培养基上的培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37 C培养18~24小时。
取出并观察记录现象。
（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）
②动力检查：用已灭菌的接种针取KIA培养基上的培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37 C 培养18~24小时。
取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基
中，并观察记录现象。
（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）
③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌的接种环分别取KIA培养基上的培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。
（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻摇动玻片，经
1~2min观察两格中有无凝集现象。
注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧的酒精灯附近进行实验操作。
四、实验结果与分析
（1）EMB培养基现象与分析：
①培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面有细菌明显蔓延生长。
②分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基中的物质并产出硫化氢气体，由于培养基中含铁，因而硫化氢能够与其结合成硫化铁，出现黑色现象；而上部因重力含铁量较少，产生的硫化氢气体又部分挥发，只有少部分能够与少量铁结合，故产生的现象不明显，上部仍呈现红色。
（2）生化鉴定现象与分析：
①葡萄糖发酵管：管内培养基指示剂由紫色变成黄色，其内可见细菌有明显生长现象，无气泡产生。
分析：培养基指示剂由紫色变成黄色，说明该细菌能够分解葡萄糖并产酸但不产气，使得指示剂内化学物质发生颜色改变。
②乳糖发酵管：管内培养基指示剂颜色不发生改变，仍为紫色，有明显细菌生长现象，无气泡产生。
分析：培养基指示剂不发生颜色改变，说明该细菌能分解乳糖但不能产酸也不产气，使得管内指示剂无明显现象。
③甘露醇发酵管：管内培养基指示剂由紫色变成黄色，其内可见细菌有明显生长现象，无气泡产生。
分析：培养基指示剂由紫色变成黄色，说明该细菌能够分解甘露醇并产酸但不产气，使得指示剂内化学物质发生颜色改变。
（3）动力检查现象与分析：
①尿素培养基：管内培养基指示剂颜色无明显变化，但有明显气泡产生，有明显细菌生长现象。
分析：管内培养基指示剂无明显颜色改变，说明该细菌不能分解尿素，但培养基中其他物质成分可以使细菌分解产气，因而产生气泡。
②蛋白胨水：管内指示剂颜色无明显变化，有明显细菌生长现象，无气泡产生。
加入靛基质（吲哚）试剂后不出现玫瑰红色。
分析：加入靛基质指示剂后不呈现玫瑰红色，说明该细菌不能分解培养基中的色氨酸产生靛基质，因而靛基质指示剂不能与之发生化学反应，出现颜色变化。
③半固体培养基：管内指示剂颜色无明显变化，有明显细菌沿穿刺线扩散生长现象，无气泡产生。
分析：细菌能够沿穿刺线生长，说明该细菌有鞭毛，能运动，有助于鉴别细菌种类。
（4）血清学鉴定现象与分析：
①现象：通过玻片两边对比，在加有伤寒杆菌诊断血清的第二个格子中周围液体清澈，有明显凝集现象；另一格液体表面浑浊，无凝集现象。
②分析：第二格中加入伤寒杆菌诊断血清出现凝集现象，说明接种细菌应为伤寒杆菌，二者特异性结合产生抗原抗体复合物，因而呈现凝集现象；而第一格中未加入伤寒杆菌诊断血清，接种细菌无相应抗体，不能产生抗原抗体复合物，所以不呈现凝集现象。
综上：
由此判断：该细菌应为乙型副伤寒杆菌。
五、实验总结
本次实验所需材料较多，实验流程较复杂，需要动手操作的步骤较频繁，因而在实验过程中需要多加注意操作方法。
①在实验进行前应熟悉掌握实验的操作步骤及流程，了解实验操作的方法，以便实验的顺利进行。
②实验应在无菌操作下进行，如可在燃烧的酒精灯附近进行细菌接种（注意酒精灯安全，切勿灼烧自己或是实验仪器，防止事故的发生）。
③细菌的培养应在适宜的环境下进行，避免外界环境影响细菌的生长繁殖（由于实验室已配备培养箱，故出现问题不大，由于实验室操作者较多，须做好相应的标记）。
④从EMB中挑选单菌落接种时注意不要挑选其他菌落进行接种，防止
多种细菌共同出现，影响实验结果。
⑤实验过程中注意操作安全，切勿使细菌沾染自己，如不慎出现细菌沾染，应及时用清水洗净。