未知肠道杆菌的分离鉴定程序
肠道杆菌的分离鉴定
300
≤13
14~16
≥17
≤28
－
≥29
≤12
13~14
≥15Байду номын сангаас
≤12
13~14
≥15
≤11
12~14
≥15
≤13
14~22
≥23
≤15
16~20
≥21
≤12
13~16
≥17
七、肠道杆菌血清学鉴定
原理：细菌作为颗粒性抗原在相应抗体作用下可形成肉 眼可见的凝集颗粒。
可疑菌落 -阴性
可疑菌落 +阳性
标本
SS培养基
②
①
P
N ③
Name time 小辫法
④ 分区划线法
注意：每划完一个区进行下一区之前取菌环要灭菌
粪便标本接种： 标本：1）病人粪便（阳性标本）； 2）正常人粪便（阴性） 培养基：SS平板 操作：将SS平板上分两个区，分别接种病人和正 常人标本。 要求：使用正确的画线方法，必须培养出单个菌落以备后续实
氨苄西林
AM
ATCC25922 金黄色葡萄球菌
10
ATCC25923
大肠埃希氏菌
庆大霉素
GM
ATCC25922 金黄色葡萄球菌
10
ATCC25923
链霉素
S
大肠埃希氏菌 ATCC25922
10
金黄色葡萄球菌
红霉素
E
ATCC25923 肺炎链球菌
15
ATCC49619
磺胺甲基异 噁唑
SMX
金黄色葡萄球菌 ATCC25923
葡磷胨水 （绿色盖） E.a
葡磷胨水 （绿色盖） E.coli
分离鉴定粪便中的大肠杆菌的实验流程
分离鉴定粪便中的大肠杆菌的实验流程鉴定粪便中的大肠杆菌是一项十分重要的实验，它可以帮助我们评估肠道健康状况，检测是否存在致病性大肠杆菌的感染，对于疾病的防控具有重要意义。
下面，我将详细介绍一下分离鉴定粪便中的大肠杆菌的实验流程。
我们需要准备实验所需的材料和试剂。
材料包括培养皿、接种环、培养基等，而试剂包括洗涤剂、生理盐水、大肠杆菌特异性培养基等。
在实验开始前，我们需要确保实验器具和培养基无菌，并且消毒实验台面和使用的工具，以避免外界微生物的干扰。
我们需要进行样品的处理和制备。
取一定量的粪便样品，并将其进行振荡或均匀搅拌，使其中的微生物均匀分布。
我们将取一小部分样品进行稀释，目的是为了在培养皿上获得适当的菌落数，方便观察和鉴定。
接着，我们把经稀释处理后的样品加入到培养基中，使细菌能够在适宜的温度下进行培养。
大肠杆菌通常在37摄氏度下培养，因此我们需要将培养皿放入恒温箱中，在一定的时间后进行观察。
在培养的过程中，我们需要定期检查培养皿的状态，观察是否有典型的大肠杆菌形态的菌落出现。
除了观察菌落形态之外，我们还可以利用生化试剂进行鉴定。
通过添加特定的生化试剂，如甲酚红葡萄糖琼脂培养基、大肠杆菌的IMViC生化试剂等，可以帮助我们鉴定大肠杆菌。
这些试剂可以根据大肠杆菌的代谢特点，进行色素反应或气体产生反应，从而帮助我们确认目标菌株的身份。
我们需要进行进一步确认。
在鉴定出大肠杆菌后，我们可以利用进化树分析等生物信息学方法，对其遗传特征进行分析，以确保其准确性。
我们还可以进行致病性检测，通过PCR等分子生物学技术检测目标菌株是否携带致病因子，从而评估其致病性。
通过以上的实验流程，我们可以较为准确地分离鉴定粪便中的大肠杆菌。
这项实验的结果将为我们提供重要的信息，有助于评估肠道健康状况，及时发现致病性大肠杆菌的感染，为疾病的预防和控制提供重要依据。
化脓性球菌、粪便标本肠道致病菌鉴定流程
化脓性球菌、粪便标本肠道致病菌鉴定流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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分离大肠杆菌的方法
分离大肠杆菌的方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是微生物学研究中的重要模式生物。
分离大肠杆菌是许多实验室中常见的操作，这里将介绍几种常用的分离方法。
1.无菌技术准备在进行分离大肠杆菌之前，必须保证实验环境的无菌。
操作前要用75%乙醇对操作台面进行消毒，使用无菌培养皿和试管，并佩戴无菌手套。
2.样品采集从目标样品中采集含有大肠杆菌的样品。
常见的样品类型包括食品、水样、粪便等。
采集样品时要注意避免污染，使用无菌容器收集样品。
3.预处理样品将采集到的样品进行预处理，以提高大肠杆菌的分离效率。
常用的预处理方法包括：(1) 粪便样品：将粪便样品稀释于无菌生理盐水中，通过离心操作去除大部分固体颗粒。
(2) 食品样品：将食品样品加入适量的无菌生理盐水中，进行均匀搅拌。
(3) 水样：直接使用无菌容器收集水样，避免污染。
4.选择培养基根据实验需要选择适合分离大肠杆菌的培养基。
常用的培养基包括营养琼脂糖平板（Nutrient Agar Plate）、MacConkey琼脂糖平板（MacConkey Agar Plate）等。
这些培养基含有适合大肠杆菌生长的营养物质，并可以通过某些特殊成分选择性地抑制其他细菌的生长。
5.涂布法涂布法是最常用的分离大肠杆菌的方法之一。
具体操作步骤如下：(1) 取一支无菌的鉴别环，将其蘸取预处理后的样品。
(2) 将鉴别环均匀地涂布在培养基平板的表面上。
(3) 使用无菌铁环或无菌玻璃杆均匀涂布，以保证样品的均匀分布。
(4) 将涂布好的培养基平板放置在恒温培养箱中，以适当的温度（通常为37摄氏度）进行培养。
6.滤膜法滤膜法是一种通过滤膜来分离大肠杆菌的方法。
具体操作步骤如下：(1) 准备无菌滤膜和滤膜培养基。
(2) 将预处理后的样品滤过滤膜，将滤膜放置在滤膜培养基平板上。
(3) 将滤膜培养基平板放置在恒温培养箱中进行培养。
7.生物化学试验分离大肠杆菌后，需要进行进一步的鉴别和确认。
标本中未知细菌的分离和鉴定
结论：现象与论点、 结论：现象与论点、论据
浓汁标本可疑菌药敏实验结果
药品名称
抑菌圈直径
结论： 结论：
咽拭子
分离培养 血平板） （血平板）
革兰染色
革兰染色
胆汁溶菌试验 奥普托辛试验
荚膜染色 石炭酸复红单染） （石炭酸复红单染）
？
粪便标本
SS平板 SS平板
结果观察
1、菌落观察 2、形态学观察
（二）生化反应 触酶试验： 触酶试验： H2o2
氧化氢酶
H2o + o2
(-) (+)
菌种：可疑菌落 菌种： 试剂：3%过氧化氢 试剂：3%过氧化氢 方法： 方法：见右图 结果： 结果：见右图
甘露醇实验
甘露醇生化反应管
药敏实验
浓汁标本可疑菌生长现象及生化反应结果 观察
玻片凝集试验
粪便标本可疑菌生长现象及生化、 粪便标本可疑菌生长现象及生化、血清反 应结果观察
SS平板 SS平板 生长现象 形态学 特 征 单糖发酵试验 血清学试验
葡萄糖 乳糖
结论：现象与论点、 结论：现象与论点、论据
粪便标本可疑菌药敏实验结果
药品名称
抑菌圈直径
结论： 结论：
二、标本中未知肠道感染细菌 的分离鉴定程序
脓血便、 脓血便、肛拭子
标本 SS平板,EMB平板 SS平板,EMB平板 平板 选择/ 选择/鉴别培基
克氏双糖铁培养基, 克氏双糖铁培养基, 动力-靛基质动力-靛基质-尿素 半固体琼脂培养基
血清学鉴定 生化反应
玻片凝 集试验
设计性实验
临床标本中病原菌的分离与鉴定
3.尿 3.尿 标本： 标本：尿液 培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、 培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、 动力-靛基质动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基 其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等 其他：革兰染液、靛基质试剂、 4.粪便 4.粪便 标本：肛门拭子 标本： 培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、 培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、 动力-靛基质动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基 其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、 其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺 菌多价血清、玻片等 菌多价血清、
肠道杆菌
原理与结果判断
• 用已知抗原检测未知抗体的试管凝集 反应。 • 以出现 ++ 凝集的血清最高稀释倍数为 该血清抗体效价 • H≥1:160 、O ≥ 1: 80； H甲或H乙≥ 1: 80 有诊断意义
H抗体与O抗体的性质及意义
H抗体 — IgG 出现晚，维持时间较长；
O抗体 — IgM出现早，维持时间较短。
形 态 实 验 学
--肠道杆菌
实验内容
1. 录象：肠道杆菌 2. 肠道杆菌的鉴定程序及示教物 3. 操作：肥达反应
肠道杆菌（enteric bacilli）
是一大群寄居在人
和动物肠道中生物
学形状近似的G－杆
菌。如：
• 非肠道致病菌
（大肠杆菌）
• 肠道致病菌
（伤寒杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌等）
肠道杆菌的鉴定程序
消毒灭菌——种类和方法
划线分离——目的和方法
细菌生化反应
一、糖发酵试验
由于细菌各自具有不同的酶系统，故对糖(醇)
类的分解能力不尽相同。
产酸产气 — 指示剂变色，小倒管内有气泡；
以㊉表示 产酸 — 指示剂变色；以＋表示 不能分解 — 指示剂不变色；以－表示
二、硫化氢试验 某些细菌能分解培养基中含硫氨基酸，产生
操作：肥达反应（试管凝集反应）
• 器材：试管6支/人，试管架1个/2人， 吸管1支/人，标签1个/人 • 伤寒杆菌H菌液 伤寒杆菌O菌液 甲型副伤寒杆菌H菌液 乙型副伤寒杆菌H菌液 • 待检病人血清 (1:10稀释)
倍比稀释法
生理盐水
待检血清(1:10)
0.5(弃) * 1 2 3 4 5 6 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 /
肠道病原菌的分离与鉴定
高压蒸汽灭菌器
(二)普通琼脂培养基
材料:肉水、蛋白胨、氯化钠、琼脂、无菌平皿、 灭菌试管、三角烧瓶等。
方法
1．按上记数量把肉水、蛋白胨、氯化钠和琼脂 放到三角烧瓶中,加热溶化。
2．用纸测酸碱度,用10％碳酸氢钠校正pH 为7.2左右。
3．15磅高压蒸气灭菌20～30min。
4．趁热将溶化的培养基倒入灭菌平皿内,每个平 皿倒入约15ml,凝固后即成普通琼脂平板培养基; 如趁热将培养基倒入灭菌试管内,再将试管斜放试 验台上,凝固后即成普通琼脂斜面培养基。
(三)血液琼脂培养基
有些细菌其营养要求较高,在普通琼脂培养基上生长 不良,可用血液琼脂培养基进行培养。 材料
① 普通琼脂培养基
② 血液(脱纤维羊血或兔血) 方法
1．加热溶化普通琼脂培养基。 2．待冷至50℃左右时,加入无菌的脱纤维血液,混匀(注 意勿使产生泡沫)。 3．分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养 基。
方法
本实验四人一组,每人取6只小试管,排成一列,计四列为一 完整试验。分别标明每列管号和诊断菌液如“O”、 “OH”、“PA”、“PB”。按下表先向每管加生理盐水 0.5ml,再加10倍稀释病人血清0.5ml于第l管,做顺序的等 倍稀释,最后加入等量的诊断菌液,充分混匀,置37℃ 2~4h, 再放室温24小时后观察结果。
肠道病原菌的分离与鉴 定
培养基的制备及常用培养基 细菌的培养法
EMB培养基的制备 肠道病原菌的分离与鉴定(一) 血清学检测-肥达氏反应
培养基的制备
(一)肉汤培养基 材料:鲜牛肉、蛋白胨、氯化钠、pH试纸、10％碳酸氢钠、试
管、三角烧瓶、蒸馏水等。 方法
1．将新鲜牛肉500g切碎或搅碎,加水1000ml,放4℃冰箱或冷处 浸泡过夜,然后煮沸30min,放凉,使残余的脂肪凝固,再用绒布或 滤纸过滤,将滤液补足为原量。 2．1000ml肉水中加入蛋白胨 10g、氯化钠5g,加热溶解。 3．用精密pH试纸测酸碱度,用10％碳酸氢钠校正pH为7.2左右。 过碱时,可用10％醋酸校正之。 4．分装于试管中或三角烧瓶中,15磅(121℃)高压蒸气灭菌20～ 30min。
大肠杆菌的分离鉴定
大肠杆菌的分离鉴定
大肠杆菌是一种重要的肠道细菌，对于科学家和医生来说具有重要的研究和治疗价值。
分离和鉴定大肠杆菌的方法有许多种，本篇文章将介绍几种比较常见的方法。
1. 感染部位样本的获得
首先需要获得感染部位的样本，可分为分泌物、血液、尿液、粪便等。
获得样本的方
法可以根据不同部位进行取样，比如粪便可以通过肛门插入取样器进行获取。
2. 抗生素筛选
将样本接种于相应的富营养基质，对其中加入多种抗生素。
根据对应的扩散系数，只
有大肠杆菌具有生长优势，因此只有大肠杆菌能够在抗生素的存在下继续生长。
3. 纯化
从上面的富营养基质中挑选具有脐带颜色和形态特征的菌落，将其在富营养基质上进
行纯化。
纯化后的大肠杆菌能在多种富营养基质上进行生长即可分离。
4. 经典分离法
包括肉汤琼脂平板法、 MacConkey琼脂平板法、格拉莫琼脂平板法、 EMB琼脂平板法等一系列基本细菌检测方法。
1. 化学特性法
常用方法有氧化氨酸特性试验、熏蒸酸特性试验、脱氧氮碱试验、醛类试验等。
通过
观察变化与发色的差异，以及其化学反应程度来判断是否为大肠杆菌。
通过观察菌落形态、革兰染色阳性反应、运动情况、气体代谢情况等特性判断是否为
大肠杆菌。
可采用比色相比法、蛋白溶液胶片法、氧测定法、etc。
3. 抗原性鉴定
通过采用血相似抗原、鞭毛抗原、菌体抗原等抗原进行抗血清试验，来确定是否为大
肠杆菌。
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肠道杆菌的血清学试验（玻片凝集试验）
材料
1. 菌种：伤寒杆菌培养物、痢疾杆菌培养物 2. 伤寒杆菌的诊断血清，志贺菌诊断血清、载玻片、生理盐水 方法
生理盐水 血清
革兰染色
革兰染色
胆汁溶菌试验 奥普托辛试验
荚膜染色 （石炭酸复红单染）
尿液
离心沉淀 1500转，10分钟
分离培养 （EMB平板）
革兰染色
革兰染色
克氏双糖铁斜 面培养基
动力-靛基质-尿素半 固体琼脂培养基
观察结果
观察结果
观察结果
完成靛基质试验
肛门拭子1/2
EMB平板
克氏双糖铁斜 面培养基
动力-靛基质-尿素半 固体琼脂培养基
标本中未知肠道感染细菌
的分离鉴定程序
脓血便、肛拭子 标本 SS平板,中国兰,EMB平板 选择/鉴别培基
克氏双糖铁培养基, 动力-靛基质-尿素 半固体琼脂培养基
血清学鉴定
生化反应
玻片凝 集试验
标本中未知病原性球菌
的分离鉴定程序
直接涂片染色镜检：观察细菌形态、排列、染色性
标本 观察菌落性状、溶血性、色素 涂片、染色、镜检 挑取可疑菌落 生化反应测定 纯培养 致病性测定 涂片染色镜检
其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等
4.粪便 标本：肛门拭子 培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、 动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基 其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺 菌多价血清、玻片等
脓拭子
分离培养 （血平板）
革兰染色
革兰染色
触酶实验
血浆凝固酶实验
咽拭子
分离培养 （血平板）
底物
底物
底物 指示剂
分解葡萄糖＋乳糖 产生H2S＋铁盐
产酸（乳糖多，产酸多） FeS 培养基成黑色
上下层均为黄色
Double suger iron slant
4. 尿素培养基 组成：基础培基＋尿素＋酚红 底物 指示剂 原理： 有些细菌产生尿素酶 结
培基变红
培基不变色
（凝固酶、耐热核酸酶）
血琼脂平板
血液 脑脊液
肉汤增 菌培养
设计性实验
临床标本中病原菌的分离与鉴定
设计性实验
1.脓汁 标本：脓拭子 培养基：血琼脂平板 其他：3%H2O2、兔血浆、生理盐水、革兰染液、玻片等 2.痰 标本：咽拭子 培养基：血琼脂平板 其他：生理盐水、10%胆盐、革兰染液、玻片等
3.尿 标本：尿液 培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、 动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基
Urea slant
肥达试验(4人/组)
材料：病人未知血清：1#，2#，3#
菌液：O、H、PAH、PBH（已知Ag）
每组1块多孔板，标记 每人2支吸管
1 O Ag
2
3
4
5
6
H Ag
PAH PBH
方法
1 NS（ml） 未知血清 (1:10) 菌液(摇匀) (4种，1种/人) 0.5 0.5
1:20
观察结果
观察结果
完成靛基质试验
玻片凝集试验
培养基原理
1. EMB平板（伊红美蓝琼脂培养基）
组成：无糖培养基＋乳糖＋伊红＋美蓝
底物 指示剂、抑菌剂 原理：
细菌 分解 乳糖
结果： 分解乳糖细菌
产酸：伊红＋美蓝
菌落变黑，有金属光泽
紫黑/紫红
不分解乳糖细菌
菌落无色、半透明（粉色）
EMB agar
2. 靛基质试验（吲哚试验）
弃0.5ml于消毒缸
2 0.5 0.5
1:40
3 0.5 0.5
1:80
4 0.5 0.5
1:160
5 0.5 0.5
1:320
6 0.5
0.5
1:40
0.5
1:80
0.5
1:160
0.5
1:320
0.5
0.5
1:640 (阴性对照)
37℃水浴过夜
肥达试验
H凝集：絮状，以疏松大团沉于管底 O凝集：颗粒状，以坚实凝片沉于管底 凝集程度的判定以“＋”、“－”号表示
组成：蛋白胨水＋色氨酸
原理： 某些细菌有色氨酸酶 试剂 玫瑰吲哚（红色） 分解 色氨酸 吲哚（无色）＋柯氏
结果：液面形成玫瑰红色
吲哚试验
3. 克氏双糖铁斜面培养基反应试验 组成：无糖培基＋1份葡萄糖＋10份乳糖＋铁盐＋酚红 营养 原理： 只分解葡萄糖 产酸（葡萄糖少，产酸量少）
上层氧化 呈红色 下层缺氧 不氧化 呈黄色
1:80 1:160 ++ +++ + ++ ++ -
肥达反应
1 2 3 4 5
O
H PAH PBH PCH
1:160
1:320 1:40 伤寒
1:320
1:80 1:80 伤寒早期
1:160
1:80 1:320 1:80 副甲
1:40
1:80 1:80 1:40 1:40 阴性
1:40
1:320 1:320 1:320 回忆反应／疫苗接种
＋＋＋＋
＋＋＋ ＋＋
上清完全透明，细菌全部形成凝集块
细菌绝大多数凝集，液体有轻度混浊 50％细菌形成凝集，液体半澄清
＋
－
仅少数细菌凝集，液体比较混浊
液体均匀混浊，无凝集（沉于管底，形成圆 形沉淀，边缘整齐）
肥达试验
以呈现＋＋凝集的血清最高稀释度作为该血清的凝集效价
1 1:40 O H PAH PBH ++++ ++++ ++ + 2 3 4 1:320 ++ 5 1:640 6 对照 -