根癌农杆菌介导的真菌转化

根癌农杆菌介导的真菌转化

(一) 农杆菌电击感受态制备及电击转化

A 感受态的制备

1) 将农杆菌菌液划线于YEB平板（50 μg/ml kana），28℃，36-48h。

2) 挑单菌落至3ml YEB试管（50 μg/ml kana）中，28℃，200rpm 培养过夜。

3) 转1ml至50ml YEB中，28℃，200rpm培养至OD600=0.8。

4) 于4℃，5000rpm，10min收集菌体。

5) 用50mL 10%的甘油（去离子水配置，湿热灭菌）洗沉淀3次（4℃，5000rpm，10min），

洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。

6) 重悬于1ml 10%甘油中（约1011个细胞/ml），可立即使用，或分装为每管50μl，液氮速

冻后，-80℃保存备用。

B 电击转化

1) 将1μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至无菌预冷的电击杯中。

2) 将电击杯放入电转化仪的电极之间，16kv/cm，5ms。

3) 取出电击杯，迅速加入200-300μl YEB（不加抗生素），并将混合液转入EP管中。

4) 于28℃，220rpm，2-3h。

5) 将50-100μl菌液涂布于YEB平板（50μg/ml car和50 μg/ml kana）上，于28℃培养2-3

天后，挑斑鉴定。

(二) 农杆菌化学感受态制备及化学法转化

A . Competent Cells

1)Inoculate a single colony to 5 ml LB

2)Grow at 28℃ to log phage,shaking at 250rpm

3)Inoculate 2ml of the culture to 50 ml LB medium and grow to OD600=0.5 ca. 8 hours

4)Chill on ice for 10 minutes

5)Spin down the cells by centrifugation at 3000g(8000rpm) for 10 minutes at 4℃

6)Resuspend cells in 1 ml of 20 mM CaCl2

7)Aliquots into 0.1 ml ,then freeze in liquid nitrogen , and store at -80 ℃

B Plasmid Transformation

1)Thaw competent cells on ice.

2)Add 1 μg plasmid (5μl) to the competent cells and mix well.

3)Freeze in liquid nitrogen for 5 min.

4)Heatshock at 37℃ for 5 min.

5)Add 1 ml LB and grow at 28℃ for 3 hr with shaking at 150 rpm.

6)Spread cells onto LB plates containing an appropriate antibiotic and incubate at room

temperature for 2-3 days.

(三）农杆菌介导的真菌转化

1 将已转入目的质粒的农杆菌接种于4mlYEB液体培养基（50μg/ml car和50 μg/ml kana）中，于28℃摇床中220rpm过夜培养（16-20h）。

2 将培养液12000rpm, 3min，并用IMAS液体重悬菌体至OD660=0.1-0.15，体积约为10-15ml （一般用50ml三角瓶）。

3 于28℃摇床220rpm培养6-7h。

4 制备真菌孢子悬液，浓度105-106/ml（制备方法参见（四））。

5 将上述农杆菌菌液100μl和孢子悬浮液100μl混匀，涂布于IMAS平板（涂板后要将其风干至未见明显水纹为止），25℃共孵育2天。

6 用3-5ml无菌水洗涤共孵育2d后的培养物，将充分混匀的洗涤物200μl涂布于M-100平板（200μg/ml PPT和300 μg/ml cef）上，适当风干后，放入25℃培养，5-6d后挑选生长比较大的菌落于48cell SDAY板。

7 培养3-4天，再将48cell SDAY板中的菌丝转接到小平板（直径6cm，贴有玻璃纸）上，3d后抽提基因组验证是否转化成功。

(四）孢子悬液的制备（现配现用）

1 从培养约14d的PDA平板上刮取适量的孢子粉到1.5ml无菌的0.05%Tween-20中，涡旋分散。

2 用脱脂棉过滤除去菌丝，滤液收集于1.5ml EP管中，12000rpm，3min收集孢子。

3 去上清，用1ml无菌水重悬孢子，12000rpm，2min，再次收集孢子。

4 再用适量的无菌水重悬孢子，血球计数板计算孢子数目，并将孢子悬液调到105-106/ml。

(五）相关培养基配方

1 YEB培养基

蔗糖0.5%（w/v）

细菌用酵母提取物0.1%（w/v）

细菌用蛋白胨1%（w/v）

MgSO4.7H2O 0.05%（w/v）

121 C灭菌20min，固体加入1.5%琼脂粉

2 培养基母液（Stock solutions）

2.1 2.5×MM salts for IM 1L

K2HPO4 3.625g

KH2PO4 5.125g

MgSO4.7H2O 1.25g

NaCl 0.375g

CaCl2.2H2O (w/v) 0.165g

FeSO4.7 H2O (w/v) 0.0062g

(NH4)2 SO4 (w/v) 1.25g

Dissolve each salt one at a time, do not autoclave. Store at room temperature. Final solution typically contains a small amount of white precipitate.

2.2 M-100 trace element solution

H3BO3 30mg

MnCl2. 4H2O 70mg

ZnCl2 200mg

Na2MoO4. 2H2O 20mg

FeCl3. 6H2O 50mg

CuSO4. 5H2O 200mg

ddH2O To 500ml final volume

2.3 M-100 Salt solution

K2HPO4 16g

Na2SO4 4g

KCl 8g

MgSO4.7 H2O 2g

CaCl2 1g

M-100TraceElementSolution 8ml

ddH2O To 1L final volume

3 Media and plates

3.1 1M MES

称9.762gMES，溶于约40ml ddH2O中，然后用5M KOH调pH值至5.3，最后定容到50ml，并过滤灭菌。

3.2 10mM AS

称0.0981gAS，溶于约40ml DMSO中，然后用5M KOH调pH值至8，最后定容到50ml，并过滤灭菌。

3.3 Induction Medium (Liquid)

Ingredients For 200ml medium

1 X MM salts 80ml of 2.5 X MM

10mM Glucose 0.36g

5‰ Glycerol 1ml

ddH2O To 188ml final volume

Autoclave. Cool to 50 ℃,then add:

40mM MES 8ml of 1M stock

200μM AS 4ml of 10mM AS

Note that there is twice as much glucose in the liquid induction medium than the induction medium plates.

3.4 Induction Medium plates:

Ingredients For 200ml medium

1 X MM salts 80ml of 2.5 X MM

10mM Glucose 0.18g

5‰ Glycerol1ml

ddH2O To 188ml final volume

1.5%Agar 3g

Autoclave. Cool to 50 ℃, then add:

40mM MES 8ml of 1M stock

200μM AS 4ml of 10mM AS

3.5 M-100 plates with 300μg/ml Cefotaxime and 200μg/ml PPT

Ingredients For 1000ml medium

M-100 salt solution 62.5ml

Glucose 10g

KNO33g

ddH2O To 1000ml final volume

1.5%Agar 15g

After autoclaving and cooling the medium until it is just warm to the touch, add 3 ml 100 mg/ml Cefotaxime and appropriate volume of PPT ( depending on concentration of commercial stock).