鸭1型甲肝病毒亚型VP 3基因的克隆与原核表达-论文
鸭肝炎病毒Ⅰ型VP3基因的克隆及原核表达
鸭肝炎病毒Ⅰ型VP3基因的克隆及原核表达刘家森;甘一迪;姜骞;孟庆文;韩凌霞;司昌德;刘娣;曲连东【期刊名称】《中国兽医科学》【年(卷),期】2008(38)7【摘要】参照鸭肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ)的基因组序列设计并合成了1对引物。
通过RT-PCR方法扩增获得了DHV-Ⅰ病毒161/79/V结构蛋白VP3基因,并将VP3基因片段插入pGEX-6p-1表达载体,转化E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS。
SDS-PAGE分析表明,经用0.1mmol/LIPTG于16℃诱导表达后,菌体裂解产物有特异的、分子质量约52ku的目的蛋白条带。
Western-blotting检测表明,表达产物与DHV-Ⅰ阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。
【总页数】4页(P587-590)【关键词】鸭肝炎病毒Ⅰ型;VP3基因;克隆;原核表达【作者】刘家森;甘一迪;姜骞;孟庆文;韩凌霞;司昌德;刘娣;曲连东【作者单位】黑龙江省农业科学院博士后工作站;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物中心【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6;Q786【相关文献】1.Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备 [J], 顾玲玲;朱善元;成大荣;左伟勇;洪伟鸣;蔡树东;王安平2.番鸭细小病毒 VP3基因的原核表达及多克隆抗体的制备 [J], 吴萌;成大荣;朱善元;吴海涛;左伟勇;王安平3.新型鸭细小病毒VP3基因克隆与原核表达 [J], 经美;王建昌;崔元;李晓轩;陈萍;王金凤;侯绍华;孙继国;袁万哲4.Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的克隆与原核表达 [J], 廖俊伟;张小飞;黄显明;毛火云;尹秀凤;刘大伟;魏建忠5.Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的克隆及原核表达 [J], 李露;程英杰;李传峰;陈宗艳;孟春春;何后军;刘光清因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株VP1基因克隆、原核表达及抗原性分析
鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株VP1基因克隆、原核表达及抗原性分析向毅勇;罗薇;靳艳玲;刘内生;刘群;龙虎【摘要】应用巢氏PCR(nested-PCR)扩增出1型鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株结构蛋白VP1基因片段,将VP1克隆到pMD18-T载体上,测序结果为714bp,GenBank登录号:GU363950.对MY株VP1基因编码蛋白的主要抗原位点进行预测,aa208-aa222氨基酸区段表现很高的亲水性、抗原指数和表面可及性.VP1经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后克隆至pET32a(+)原核表达载体,获得重组质粒pET-VP1,转入BL21 PLyss(DE3)细胞中,IPTG诱导后SDS-PAGE检测结果表明,在大肠杆菌中表达了1个相对分子质量为47 ku的融合蛋白.Western blotting分析结果表明,该重组蛋白可与鸭肝炎标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)012【总页数】6页(P68-73)【关键词】鸭肝炎;原核表达;SDS-PAGE;Western blotting【作者】向毅勇;罗薇;靳艳玲;刘内生;刘群;龙虎【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041;中国科学院成都生物研究所,成都,610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041【正文语种】中文【中图分类】Q781型鸭病毒性肝炎是由1型鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus 1,DHV 1)引起的雏鸭急性死亡的传染病,主要侵害4周龄内的雏鸭,死亡率高,是危害养鸭业最为严重的传染病之一(辛朝安,2003)。
DHV 1为小RNA病毒科成员(Cornelia,2005),病毒粒子呈球形或类球形,核衣壳20面体对称,无囊膜,胞浆内繁殖,具有不分节段的单股正链RNA(蔡宝祥,2001),病毒基因组只含1个开放阅读框,编码3种结构蛋白(VP1、VP0、VP3)和9种非结构蛋白(Tseng等,2007)。
Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒3C基因在昆虫细胞的表达与检测精品文档5页
Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒3C基因在昆虫细胞的表达与检测鸭甲型肝炎病毒（duck hepatitis A virus，DHAV）主要侵害4周龄之内雏鸭，引起一种急性高度接触致死性烈性传染病，以角弓反张和肝脏病变为主要特征，1周龄以内的雏鸭病死率接近100%，严重危害我国养鸭业。
DHAV可分为3种血清型，分别为DHAV-Ⅰ（经典的DHV-Ⅰ）[1]、DHAV-Ⅱ（新发现于台湾的血清型）[2]、DHAV-Ⅲ（新发现于中国和韩国的血清型）[3-4]，3个血清型之间存在明显的差异，无交叉免疫性。
目前，我国DHAV-Ⅰ流行较普遍，对养鸭业危害最大。
DHAV-Ⅰ为小RNA病毒科的成员，具有小RNA病毒的基本结构，整个基因组分为3个部分：5′非编码区（untranslated region，UTR），1个编码多聚蛋白的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）和3′非编码区（3′UTR），3′UTR之后是poly（A）尾。
ORF编码的聚合蛋白分为1个结构蛋白区（P1）和2个非结构蛋白区（P2、P3），结构蛋白P1在病毒自身编码的蛋白酶的作用下可以水解成VP0、VP1、VP3 3种衣壳蛋白；P2区可以裂解为2A1、2A2（2A3）、2B、2C 4种或5种非结构蛋白；P3区又可以裂解为3A、3B、3C、3D 4种非结构蛋白。
其中3C蛋白是一种蛋白水解酶，在多聚蛋白的水解以及病毒的复制、形成过程中发挥重要作用[5-6]。
本研究利用杆状病毒/昆虫细胞系统表达DHAV-Ⅰ 3C基因，为3C蛋白的开发应用奠定了基础。
1材料与方法1.1载体、菌株和毒株DHAV-Ⅰ SH株由中国农业科学院上海兽医研究所惠赠；感受态细胞DH10Bac、DH5α、杆状病毒转移载体pFastBac1、含有目的基因的重组质粒pET-3C均由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室制备并保存。
1.2工具酶和试剂转染试剂Cellfectin Ⅱ Reagent购自Invitrogen公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、pfu DNA聚合酶购自Fermentas公司；FITC标记的羊抗鸭IgG购自KPL公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Amp）、卡那青霉素（Kan）、四环霉素（Tet）、庆大霉素（Gen）购自Sigma公司；昆虫细胞培养基Sf-900 Ⅱ SFM（serum free medium）购自GBICO公司；其他试剂均为国产分析纯级。
对Ⅰ型鸭肝炎病毒3D基因克隆及其原核表达的研究
对Ⅰ型鸭肝炎病毒3D基因克隆及其原核表达的研究孔留五;康艳梅;何逸民;罗玉均;潘全会;张桂红【期刊名称】《四川畜牧兽医》【年(卷),期】2009(36)2【摘要】根据Genbank中的I型鸭肝炎病毒全基因序列,应用Primer 5.0分析软件设计合成了扩增I型鸭肝炎病毒3D基因的一对引物,用该特异性表达引物体外克隆I型鸭病毒性肝炎病毒3D基因,构建重组表达质粒pET32a-3D,将此重组质粒转化到受体菌RossetaⅡ(DE3)中进行诱导表达.SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明,诱导4 h后表达量达到最高.表达产物大小约为70 Ku,表达蛋白能与I型鸭病毒性肝炎阳性血清产生特异性免疫反应.【总页数】3页(P25-27)【作者】孔留五;康艳梅;何逸民;罗玉均;潘全会;张桂红【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S858.32【相关文献】1.Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因克隆与序列分析 [J], 任邵娜;袁生;蒲文珺;彭巧丽;王辉;陈志伟;张浩吉;李国清2.Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1、3D基因克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 孔留五;罗玉均;张桂红;陈建红;徐小芹;廖明;康艳梅;何逸民3.Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因克隆及其原核表达 [J], 孔留五;康艳梅;何逸民;李小康;潘全会;张桂红4.鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株VP1基因克隆、原核表达及抗原性分析 [J], 向毅勇;罗薇;靳艳玲;刘内生;刘群;龙虎5.新Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1和3D蛋白的原核表达及鉴定 [J], 孟凡依;殷秀辰;李刚;陈玉环;张云;刘明;冯新畅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒的构建
Ｉ 型鸭肝 炎病毒 ）Ｐ 基 因， 隆到质粒 ｐＣ 表 达盒的多克隆位点 Ｋｎ 与 Ｘａ 之 间， Ｖ１ 克 ＴＬ ｐＩ ｂＩ 构建含 Ｌｃ 及 ＶＩ 因的转 ａＺ Ｐ 基 移栽体质 粒 ｐ－ Ｌ Ｖ Ｉ Ｔ Ｃ －Ｐ 。将此转移 载体 与鸭瘟 病毒 ＣＫ Ｅ 株共转 染鸡胚成 纤维细胞 （Ｅ） 经蓝斑克 隆筛选 和纯 －Ｃ 毒 ＣＦ， 化 ， 了遗传 性状稳定的表达 Ｉ 获得 型鸭 甲肝病毒 Ｖ １ 因的重组鸭瘟病毒 。 Ｐ基 关键词： 甲肝病毒 ； 鸭 鸭瘟病毒；Ｋ基 因；Ｐ 基 因； 鸭瘟 病毒 Ｔ ＶＩ 重组 中图分类号 ：８ ２６ ９ ０８ Ｓ ５ ．５ ：７ 文献标识码 ： 文章编号：０ ５ ９４ ２ １ ）６ ０ ２ －１ Ａ １０ — ４ Ｘ（０ ０ ０ — ０ ８ ４ ４
ｂ ａ ｓ ｏ ｉｅ ｔ ｎ ｗｉ ｅ ｔｉｔ ｎ ｅ ｚ ｍｅ ｎ ｅ ｓ ｒ ｄ ｎｔ ｄ ｌ ｏ ｅ Ｔ ｙ ｍｅ ｎ ｆ ｄ ｇ ｓｉ ｔ ｒ ｓ ｃ ｏ ｎ ｙ ａ ｄ ｔ ｎ ｉ ｅ ｔ ｉ ｏ ｍｉ ｄ ｅ ｆ ｔ Ｋ ｅ ｅ ｂ ｉ ｉ ｇ ｌ ｓ ｄ ｐ Ｌ． ｉ ｇ ｏ ｈ ｒ ｉ ｈ ｎ ｅ ｈ ｇ ｎ ，ｏ ｔｎ ｎ ｐ ａ ｍｉ ＴＣ Ｕｓ ａ ｎ ｈ ｒ ｒ ｓ ｎ ｓ ｄ ａ ｃ ｒ ｉｇ ｔ ｔ ｙ ｅ Ｉ ｄ ｃ ｅ ａｉ ｉ ｔ ｅ ｐ ｍｅ ｙ ｔ ｅ ｉｅ ｃ ｏ ｄ ｎ ｅ ｔ ｐ ｕ ｋ ｈ ｐ ｔ ｓ ｖ ｒ ｓ ＶＰ ｇ ｎ ｅ ｕ ｎ ｅ ｐ ｂ ｉ ｅ ｎ ｂ ｎ ，ｔ ｅ ｉ ｓ ｈ ｚ ｏ ｈ ｉ ｔ ｕ １ ｅ ｅ ｓ ｑ ｅ ｃ ｕ ｌ ｈ ｄ ｉ Ｇｅ ｅ ａ ｋ ｈ ＶＰ１ ｅ ｅ ｓ ｎ ｇ ｎ Ｗａ ｍｐ ｉ ｅ ｒ ｍ ｅ ｐ ａ ｍｉ － ｓ ａ ｌ ｄｆ ｉ ｆ ｏ ｔ ｌｓ ｄ Ｔ ＶＰ１ ｓ ｅ ｌｔ ｄ ｃｏ ｅ ｎ ｏ ｂ ｔ ｅ ｅ ｔ ｅ ｐ ｌｃ ｏ ａ ｉ ｒ ｄ Ｘｂ ｌ ｏ ｌｓ ｄ ｈ ａ ｔｍｐ ａｅ ａ ｌ ｎ ｄ ｉ ｔ ｅ ｗｅ ｎ ｔ ｏ ｙ ｌ ｎ ｌ ｓ ｅ Ｋｐ ａ ａ ａ ｆｐ ａ ｍｉ ｎ ｈ ｈ ｔ ｎ ｐ ＣＬ ｔ ｕ ｏ ｔ ｉ ｉｇ ｔ ｅ ｐ ＣＬ ＶＰ１ ｌ ｓ ｄ ｗｉ Ｌ ｃ ａ ｄ Ｔ ， ｈ ｓ ｂ ａｎ ｈ Ｔ － ｎ ｐ ａ ｍｉ ｔ ｈ ａ Ｚ ｎ ＶＰ１ ｅ ｅＴ ｅ ｏ ｓ ｕ ｔｄ ｔ ｎ ｆ ｒ ｖ ｃｏ ｗａ ｃ ｔ ｎ ｆｃ ｅ ｏ ｇ ｎ ． ｈ ｃ ｎ ｔ ｃｅ ｒ ｓｅ ｅ ｔ ｒ ｒ ａ ｓ ｏｒ ｓｅ ｔ ｄ ｎ ａ
鸭甲肝病毒VP1蛋白主要抗原域的原核表达及间接ELISA方法的初步建立
． 中国农 业 科学 院 上海 兽医 研究 所 ，上 海 ２ ０ ０ ２ ４ １ ） （ １ ． 山 东 出入境 检验 检 疫局 ，青 岛 ２ ６ ６ ０ ０ ２ ； ２
摘 要 ：根据 已发表 的鸭 甲肝病毒 （ Ｄ ｕ ｃ ｋ ｈ ｅ ｐ ａ ｔ ｉ ｔ ｉ ｓ Ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ，Ｄ ＨＡ Ｖ）疫 苗株 Ａ６ ６ 株基 因组序列 ，利用 生物 学分析软件Ｄ ＮＡＳ ｔ ａ ｒ 进
原 性。 以该蛋 白作 为 包被 抗原 ，成 功建 立 了检测ＤＨＡ ｖ － １ 的间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ方法。该 方法具有 良好 的特异性 、敏感性和 重复性 ，为 ＤＨ Ａ Ｖ的快速诊 断、流行 病学调查和免疫鸭群 的抗体检 测提供 了快速 实用的检 测手段 。
关键 词 ：鸭 甲肝病毒 ；ＶＰ １ ；抗原域 ；间接Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 中图分类号 ：￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ ９ ． ６ 文献标志码 ：Ａ 文章编号 ：１ ６ ７ ４ — ６ ４ ２ ２（ ２ ０ １ ５）０ ２ — ０ ０ ０ ７ － ０ ８
行 ＶＰ １ 蛋 白的 二 级 结 构 和 抗 原 域 预 测 ，确 定其 主要 抗 原 域 （ ｍａ ｊ ｏ ｒ ａ ｎ ｔ ｉ ｇ ｅ ｎｄ ｏ ｍａ ｉ ｎ ｏ ｆ Ｖ Ｐ１ ， ＶＰ １ Ｍ ），设 计 并 合 成 一 对 可扩 增ＶＰ １ Ｍ
的特异性 引物 。Ｐ Ｃ Ｒ扩增 获得 长为３ ２ ７ ｂ ｐ 的ｖＰ １ Ｍ基 因片段 。将ＶＰ １ Ｍ基 因片段 定向 克隆＿ ￣ － ｐ Ｇ Ｅ Ｘ一 ４ Ｔ ＿ １ 表 达载体 中 ，鉴 定正确 后进 行Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱 导表达 ，获得 了以 包涵体 为主的重组 蛋 白。重组蛋 白纯化后 ，经过Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 检测表 明重组蛋 白具有 良好 的抗
Ⅰ型鸭肝炎病毒vp3基因的截短表达及鉴定
Ⅰ型鸭肝炎病毒vp3基因的截短表达及鉴定罗玄;张海涛;尹秀凤;黄显明;靳宇田;张小飞;潘玲【摘要】根据Ⅰ型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus type Ⅰ,DHV-Ⅰ) A66株vp3基因序列,设计了一对扩增vp3截短基因(-468bp)的特异性引物,将vp3截短基因与表达载体pET-32a(+)连接,构建了vp3截短基因的重组表达质粒pET-VP468.pET-VP468转入表达菌E Coli Rosetta-gami(DE3)pLysS中,使用IPTG诱导表达融合蛋白Trx-VP468.Trx-VP468经过Ni-NTA亲和层析柱和DEAE-Sepharose阴离子柱纯化,SDS-PAGE电泳结果表明,pET-VP468在大肠杆菌中表达了一个相对分子量约为36kDa的蛋白,免疫印迹试验表明Trx-VP468得到了正确表达.该结果为VP3蛋白的免疫学功能研究奠定了基础.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2012(020)003【总页数】5页(P17-21)【关键词】Ⅰ型鸭肝炎病毒;vp3基因;截短;克隆表达【作者】罗玄;张海涛;尹秀凤;黄显明;靳宇田;张小飞;潘玲【作者单位】安徽农业大学动物科技学院,合肥230036;南京天邦生物科技有限公司,南京211102;南京天邦生物科技有限公司,南京211102;南京天邦生物科技有限公司,南京211102;南京天邦生物科技有限公司,南京211102;安徽农业大学动物科技学院,合肥230036;南京天邦生物科技有限公司,南京211102;南京天邦生物科技有限公司,南京211102;江苏省农科院兽医研究所,南京210014;安徽农业大学动物科技学院,合肥230036【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6;Q78I型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1,DHV-1)是引起雏鸭急性高度致死性传染病的病原，早在1949年美国学者Levine首次分离并报道了DHV[1]，但直到最近几年，才有学者陆续完成了DHV全基因组序列测定[2-4]。
新型鸭细小病毒VP3基因克隆与原核表达
动物医学进展,２０１８,３９(６):２０Ｇ２３P r o g r e s s i nV e t e r i n a r y Me d i c i n e 新型鸭细小病毒V P ３基因克隆与原核表达㊀收稿日期:２０１７Ｇ０９Ｇ０４㊀基金项目:河北省高校百名优秀创新人才支持计划(S L R C ２０１７０３９);国家重点研发计划项目(２０１７Y F D ０５００８０６)㊀作者简介:经㊀美(１９９２－),女,河北三河人,硕士,主要从事预防兽医学研究.ә同等贡献作者.∗通讯作者经㊀美１ә,王建昌２ә,崔㊀元１,李晓轩１,陈㊀萍１,王金凤２,侯绍华３,孙继国１,４,袁万哲１,４∗(１．河北农业大学动物医学院,河北保定０７１００１;２．河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心,河北石家庄０５００５１;３．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京１００１９３;４．河北省兽医生物技术工程技术研究中心,河北保定０７１００１)㊀㊀摘㊀要:应用P C R 方法扩增新型鸭细小病毒(N D P V )V P ３基因,将其克隆至原核表达载体p Q E １中,获得重组质粒p Q E １ＧV P ３.重组质粒p Q E １ＧV P ３经优化诱导表达后,通过S D S ＧP A G E 对表达产物进行分析并利用H i s 标签抗体对表达的蛋白进行W e s t e r nb l o t 鉴定.结果表明,N D P V V P ３蛋白在２５ħ㊁I P T G 浓度为１．０mm o l /L 经诱导５h ,可获得最大诱导表达量,表达蛋白的分子质量约为６０k u,主要以不溶性包涵体形式存在.纯化复性后,可获得浓度为５．１６５m g/m L 及纯度为９７％的V P ３蛋白.获得的重组菌p Q E １ＧV P ３以及高纯度的V P ３蛋白,为进一步研究N D P V 检测方法和新型疫苗奠定了基础.㊀㊀关键词:鸭细小病毒;V P ３;原核表达中图分类号:S ８５２．６５文献标识码:A 文章编号:１００７Ｇ５０３８(２０１８)０６Ｇ００２０Ｇ０４㊀㊀２０１４年１１月以来,我国山东㊁河北和安徽等地商品肉鸭群发生了以雏鸭发育迟缓㊁上下喙萎缩㊁舌头外伸为特征的疾病,养殖户俗称为 鸭长舌病 或 鸭大舌病 .该病多发生于１０日龄~３０日龄的肉鸭,发病率为５％~１０％,患鸭后期瘫痪,不愿活动,部分患鸭因无法进食而死亡[１Ｇ２].大多数患鸭出栏体重较健康鸭降低２０％~３０％,严重者仅为正常体重的５０％.患鸭在抓捕㊁屠宰过程中胫骨等易发生骨折.根据其临床表现,该病又被称为 鸭短喙Ｇ侏儒综合征.目前已经确定该病的病原为新型鸭细小病毒(N o v e l d u c k p a r v o v i r u s ,N D P V )[１Ｇ２].N D P V 与鹅细小病毒的亲缘关系较近,具有相似的基因组组成与结构.全基因组中包含２个主要的开放阅读框(O R F ),左侧O R F 编码非结构蛋白N S １和N S ２,右侧O R F 编码结构蛋白V P １㊁V P ２和V P ３[３].其中,V P ３蛋白是N D P V 的主要衣壳蛋白,含有病毒主要的抗原表位成分,是主要的保护性抗原,能诱导机体产生具有中和作用的抗体[４].本研究对新型鸭细小病毒S D 株的V P ３基因进行了克隆,对其原核表达条件进行了探索和优化,为进一步研究N D P V 抗体检测方法和新型疫苗奠定基础.１㊀材料与方法１．１㊀材料N D P V ＧS D 株由本实验室分离并保存;２ˑT r a n s T a qH i F iP C RS u p e r M i x Ⅰ㊁E x n a s e T M Ⅱ和５ˑC EⅡb u f f e r 购自武汉品生科技有限公司;E a s yP u r eV i r a lD N A /R N A K i t 购自北京全式金生物技术有限公司;R o s e t t a ２(D E ３)p L y S s ㊁T o p １０感受态和琼脂糖凝胶D N A 回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;６ˑH i s ,H i s ＧT a q M o n o c l o n a l A n t i b o d y 购自P r o t e i n t e c h 公司;N i ＧA g a r o s eH i s 标签蛋白纯化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司.１．２㊀方法１．２．１㊀引物设计㊀根据G e n B a n k 上登录的S D L C ０１株基因序列(G e n B a n k :K T ００１２０３),应用P r i m e r ５．０软件设计１对特异性引物,在引物序列中引入５ᶄl i n k e r 和３ᶄl i n k e r,便于后续与表达载体的重组反应.引物序列如下:上游引物P １:５ᶄＧG G G T C CA G CG G CG C T G G A T C CA T G G C A G A G G G AG G A G G CG G Ｇ３ᶄ;下游引物P ２:５ᶄＧC G C T C C A C TG C CT C CT G C A G CC T A C A G A T T T T G A G T T A G A T A Ｇ３ᶄ.预期扩增的片段大小约为１６５３b p,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.１．２．２㊀V P ３基因的扩增㊀利用E a s yP u r e V i r a l D N A /R N A K i t 提取鸭胚分离毒S D 株的总D N A ,以此D N A 为模板进行V P ３基因扩增.P C R 扩增体系为:上㊁下游引物(１０μm o l /L )各１μL ,P r i m e r ＧS T A R M a x (２ˑ)２５μL ,模板１μL ,加d d H ２O 补充至５０μL .P C R 反应条件:９８ħ１m i n ;９８ħ１０s,６０ħ１０s ,７２ħ５０s ,共３５个循环;７２ħ延伸２m i n .扩增产物经２０g /L 琼脂糖凝胶电泳后,利用琼脂糖凝胶D N A 回收试剂盒回收纯化目的基因.１．２．３㊀重组质粒p Q E １ＧV P ３的构建与原核表达㊀将V P ３目的基因与p Q E １载体按一定比例进行重组,测序正确的质粒被命名为p Q E １ＧV P ３.将阳性重组质粒p Q E １ＧV P ３转化至感受态细胞中,将重组菌于３７ħ培养至O D ６００n m 值约为０．６,加入I P T G ,使其终浓度分别为０㊁０．２㊁０．４㊁０．６㊁０．８㊁１．０㊁１．２㊁１．４mm o l /L ,诱导表达５h ,确定最适的I P T G 诱导浓度;在最适I P T G 诱导浓度下,分别诱导表达０㊁１㊁２㊁３㊁４㊁５㊁６㊁７㊁８h ,确定最佳的诱导时间;在最适I P T G 浓度和最佳诱导时间下,分别在２０ħ㊁２５ħ㊁３０ħ㊁３７ħ诱导,确定最佳诱导温度.菌液经超声波破碎后,收集上清和沉淀进行S D S ＧP A G E 检测.１．２．４㊀V P ３蛋白的纯化㊁复性及W e s t e r nb l o t 鉴定㊀用N i ＧA g a r o s e H i s 标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白,将纯化蛋白在含G S H ＧG S S G 的P B S 复性缓冲液中按１ʒ１稀释装入透析袋中,将透析袋放入复性缓冲液中按透析袋内外液体１ʒ２０的比例透析复性２４h ,用N a n o d r o p 测定复性蛋白的浓度和纯度.将纯化的蛋白经１２０g /LS D S ＧP A G E 电泳后转膜,用５０g/L 脱脂牛奶过夜封闭后,以１ʒ１００００稀释H i s 标签抗体室温孵育１h ,洗膜后D A B 避光显色.２㊀结果２．１㊀目的基因P C R 扩增结果经P C R 扩增的V P ３基因在大约１６００b p 处出现明显的目的条带,与预期的大小(１６５３b p )相符(图１).表达载体p Q E １在大约５４００b p 处有明显条带,与预期的大小(５４０７b p )相符(图２).M．D N A 标准;１．新型鸭细小病毒V P ３基因M．D N A M a r k e r ;１．N D P V V P ３g e n e图１㊀V P ３基因的P C R 扩增F i g ．１㊀P C Ra m pl i f i c a t i o no fV P ３g e ne M．D N A 标准;１．线性化载体p Q E １M．D N A M a r k e r ;１．l i n e a r i z e dv e c t o r p Q E １图２㊀表达载体p Q E １的P C R 扩增F i g ．２㊀P C Ra m p l i f i c a t i o no f e x pr e s s i o nv e c t o r p Q E １２．２㊀重组质粒p Q E １ＧV P ３的菌液P C R 鉴定重组质粒p Q E １ＧV P ３转入T o p １０菌株后,经菌液P C R 鉴定,在大约１６００b p 处有明显条带,大小与预期的１６５３b p 相符(图３).M．D N A 标准;１~８．pQ E １ＧV P ３基因M．D N A M a r k e r ;１Ｇ８:pQ E １ＧV P ３g e n e 图３㊀重组质粒p Q E １ＧV P ３的菌液P C R 鉴定F i g．３㊀M i c r o b i a l P C R i d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n t pl a s m i d p Q E １ＧV P ３２．３㊀表达产物的S D S ＧP A G E 分析S D S ＧP A G E 分析表明V P ３基因可得到表达,蛋白分子质量约为６０k u .V P ３蛋白在２５ħ㊁１．０mm o l /LI P T G 条件下诱导５h 获得最大表达量,而未诱导的菌样未出现条带(图４~图６).可溶性分析表明,重组蛋白以不溶性的包涵体形式存在于菌体中(图７).２．４㊀重组V P ３蛋白的纯化复性及W e s t e r nb l o t 鉴定分析㊀㊀经N i ＧA g a r o s e H i s 标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白,纯化的蛋白经含G S H ＧG S S G 的P B S 复性缓冲液透析复性,复性条带大小与预期目的条带相符(图８),用N a n o d r o p 测定复性蛋白的浓度为５．１６５m g/m L 和纯度为９７％.纯化后的目的蛋白经S D S ＧP A G E 后转移至硝酸纤维素膜上,进行W e s t e r nb l o t 检测(图９),约６０k u 处可见有一条明显的蛋白印迹带,由此说明表达的重组蛋白具有良好的反应原性.１２经㊀美等:新型鸭细小病毒V P ３基因克隆与原核表达M．蛋白分子质量标准;１．p E Q １ＧV P ３空质粒;２~９．p E Q １ＧV P ３质粒经１㊁２㊁３㊁４㊁５㊁６㊁７㊁８h 诱导M．P r o t e i n m o l e c u l a r w e i g h t M a r k e r ;１．pE Q １ＧV P ３p l a s m i d ;２Ｇ９．pE Q １ＧV P ３i n d u c e d i n１,２,３,４,５,６,７,８h 图４㊀不同时间p E Q １ＧV P ３诱导表达S D S ＧP A G E 检测F i g．４㊀S D S ＧP A G Ed e t e c t i o no f P E Q １ＧV P ３i n d u c e d i nd i f f e r e n t t i me M．蛋白分子质量标准;１~８．I P T G 浓度分别为０㊁０．２㊁０．４㊁０．６㊁０．８㊁１．０㊁１．２㊁１．４mm o lM．P r o t e i n m o l e c u l a r w e i gh t M a r k e r ;１Ｇ８．I P T G c o n c e n t r a t i o n s０,０．２,０．４,０．６,０．８,１．０,１．２,１．４mm o l r e s p e c t i v e l y图５㊀不同I P T G 浓度p E Q １ＧV P ３诱导表达S D S ＧP A G E 检测F i g．５㊀S D S ＧP A G Ed e t e c t i o no f P E Q １ＧV P ３i n d u c e d i n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f I P TGM．蛋白分子质量标准;１．２０ħ,２．２５ħ,３．３０ħ,４．３７ħM．P r o t e i nm o l e c u l a rw e i gh tM a r k e r ;１．２０ħ,２．２５ħ,３．３０ħ,４．３７ħ图６㊀不同温度p E Q １ＧV P ３诱导表达S D S ＧP A G E 检测F i g．６㊀S D S ＧP A G Ed e t e c t i o no f P E Q １ＧV P ３i n d u c e d i n d i f f e r e n t t e m pe r a t u re M．蛋白分子质量标准;１．诱导５h 的沉淀,２．诱导５h 的上清M．P r o t e i n m o l e c u l a rw e i gh t M a r k e r ;１．S e d i m e n t ai n d u c e di n５h ;２．S u pe m a t a n t i n d u c e d i n５h 图７㊀p E Q １ＧV P ３可溶性分析F i g ．７㊀S o l u b i l i t y a n a l ys i s o f p E Q １ＧV P３M．蛋白分子质量标准;１．目的蛋白M．P r o t e i nm o l e c u l a rw e i gh tM a r k e r ;１．I n t e r e s t p r o t e i n 图８㊀蛋白复性的结果F i g．８㊀T h e r e s u l t s o f p r o t e i n r e n a t u r a t i on M．蛋白分子质量标准;１．纯化蛋白M．P r o t e i nm o l e c u l a rw e i gh tM a r k e r ;１．P u r i f i e d p r o t e i n 图９㊀融合蛋白H i s 标签的W e s t e r nb l o t 鉴定F i g ．９㊀I d n t i f i c a t i o no f f u s i o n p r o t e i nH i s Ｇt a g b yW e s t e r nb l o t３㊀讨论水禽类细小病毒主要包括鹅细小病毒(G o o s ep a r v o v i r u s ,G P V )和番鸭细小病毒(M u s c o v y d u c k pa r v o v i r u s ,M D P V ),该病毒属于细小病毒科(P a r Ｇv o v i r i d a e )㊁细小病毒亚科(P a r v o v i r i n a e )㊁依赖细小病毒属成员[５].为单股线性D N A 病毒,全基因组长５０５０n t.其基因组主要包含左右２个开放性２２动物医学进展㊀２０１８年㊀第３９卷㊀第６期(总第３００期)阅读框,分别为N S 基因和V P 基因,阅读框两侧均有末端反向重复序列.细小病毒编码蛋白共５种,分别为V P １㊁V P ２和V P ３结构蛋白及非结构蛋白N S １和N S ２[６].V P ３蛋白在３种结构蛋白中数量最多,约占衣壳蛋白总量的８０％[７],其分子质量约为５８k u ,编码基因长度为１６０５n t .V P ３蛋白为抗原决定簇的主要成分,构成细小病毒的保护性抗原,说明V P ３蛋白具有良好的免疫原性.因此,V P ３蛋白是G P V 和M D P V 基因工程疫苗的首选靶基因[８].曾将本实验室分离的S D 株与M D P V 和G P V进行同源性分析,发现与G P V 有较近的亲缘性,核苷酸序列进行同源性比对结果可达９２．７％~９９．８％,而与M D P V 的同源性相对较低,在７９．８％~８４．４％之间.该分离株为鸭源G P V ,通过基因进化分析表明该分离株为G P V 的变异株[９].与G P V 比较,该毒株变异主要发生在３ᶄＧU T R 端,１６０Ｇ１７６与３０６Ｇ３２２n t 发生缺失(未发表).鉴于N D P V 所致疫病是一种新发现的鸭类传染病,本研究采用q R e x 重组酶体系方法,将V P ３基因克隆至原核表达载体p E Q １中,构建一种可高效表达蛋白的重组菌p Q E １ＧV P ３,并对其诱导表达条件进行优化,获得了在温度为２５ħ㊁１mm o l /L 的I P T G 浓度下诱导５h 的最大诱导表达量的方法.同时,本研究也对重组蛋白的可溶性进行了分析,发现重组的V P ３蛋白以不溶性包涵体的形式表达蛋白.经过纯化和复性可得到浓度为５．１６５m g /m L 的V P ３蛋白,其纯度可达９７％.在W e s t e r nb l o t 鉴定下,可见６０k u 处有明显的蛋白印迹条带.表明V P ３蛋白在原核表达系统中可高效表达,并且复性的蛋白具有良好的反应原性.获得的重组菌p Q E １ＧV P ３以及高纯度的V P ３蛋白,可用于建立N D P VE L I S A 检测方法以及开发新型疫苗.参考文献:[１]㊀宁㊀康,王㊀丹,王府民,等．樱桃谷北京鸭短喙和侏儒综合征的初步研究[J ]．中国兽医杂志,２０１５(１０):１０Ｇ１３,５０．[２]㊀袁万哲,崔㊀元,经㊀美,等．鸭短喙Ｇ侏儒综合征研究初报[J ]．中国动物保健,２０１６,１８(５):７３Ｇ７４[３]㊀Z a d o r i Z ,E r d e J ,N a g y J ,e t a l ．C h a r a c t e r i s t i c so f t h e g e n o m eo f go o s e p a r v o v i r u s [J ]．A v i a nP a t h o l ,１９９４,２３(２):３５９Ｇ３６４．[４]㊀Y i nX ,Z h a n g S,G a oY ,e t a l ．C h a r a c t e r i z a t i o n o fm o n o c l o n a l a n Ｇt i b o d i e s a ga i n s tw a t e r f o w lV P ３p a r v o v i r u s e s p r o t e i n [J ]．V i r o l J ,２０１２,(９):２８８．[５]㊀李㊀琦,李传峰,唐井玉,等．新型鸭细小病毒V P ３基因的原核表达及多克隆抗体的制备[J ]．中国兽医科学,２０１６,４６(６):７１７Ｇ７２２．[６]㊀黄㊀瑜,朱于敏,董世娟,等．雏番鸭细小病毒V P ３基因的原核表达及增殖病毒的检测[J ]．生物工程学报,２０１５,３１(１):６５Ｇ７４．[７]㊀W a n g C Y ,S h i e n H K ,S h i e nJ H ,e ta l ．E x p r e s s i o no f c a ps i d p r o t e i n a n dn o n Ｇs t r u c t u r a l p r o t e i n s o fw a t e r f o w l p a r o v i r u s e s i n E s c h e r i c h i a c o l i a n dt h e i ru s e i ns e r o l o g i c a la s s a y s [J ]．A v i a n P a t h o l ,２００５,３４(５):３７６Ｇ３８２．[８]㊀张㊀云,耿宏伟,郭东春,等．鹅和番鸭细小病毒全基因克隆与序列分析[J ]．中国预防兽医学报,２００８,３０(６):４１５Ｇ４１８．[９]㊀崔㊀元,王建昌,李玉保,等．鸭短喙Ｇ侏儒综合征及其病原的初步研究[J ]．中国预防兽医学报,２０１６,３８(５):３４８Ｇ３５１．C l o n i n g a n dP r o k a r y o t i cE x pr e s s i o n o fV P ３G e n e o fN o v e l D u c kP a r v o v i r u s J I N G M e i １,WA N GJ i a n Ｇc h a n g ２,C U IY u a n １,L IX i a o Ｇx u a n １,C H E NP i n g １,WA N GJ i n Ｇf e n g ２,HO US h a o Ｇh u a ３,S U NJ i Ｇgu o １,４,Y U A N W a n Ｇz h e １,４(１．C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,A g r i c u l t u r eU n i v e r s i t y o f H e b e i ,B a o d i n g ,H e b e i ,０７１００１,C h i n a ;２．I n s p e c t i o na n dQ u a r a n t i n eT e c h n i c a lC e n t e r o f H e b e iE n t r y ＧE x i t I n s p e c t i o na n dQ u a r a n t i n eB u r e a u ,S h i j i a z h u a n g ,H e b e i ,０５００５１,C h i n a ;３．B e i j i n g I n s t i t u t e o f A n i m a lH u s b a n d r y a n dV e t e r i n a r y M e d i c i n e ,C h i n e s eA c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s ,B e i j i n g ,１００１９３,C h i n a ;４．H e b e iE n g i n e e r i n g a n dT e c h n o l o g y R e s e a r c hC e n t e r o f V e t e r i n a r y B i o t e c h n o l o g y ,B a o d i n g ,H e b e i ,０７１００１,C h i n a )A b s t r a c t :I n t h i s r e s e a r c h ,V P ３g e n eo fn o v e l d u c k p a r v o v i r u s (N D P V )w a sa m p l i f i e db y PC Ra n dc l o n e d i n t o t h e p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r p Q E １．T h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p Q E １ＧV P ３w a s o pt i m i z e d i n i n d u c e d e x p r e s s i o n c o n d i t i o n s ．T h e e x p r e s s e d p r o d u c t sw e r e a n a l y z e db y SD S ＧP A GE ．R e s u l t s s h o w e d t h a tV P ３p r o Ｇt e i no fN D P V w a s e x p r e s s e ds u c c e s s f u l l y i n p r o k a r y o t i c c e l l s ．T h e p r o t e i nc o u l do b t a i n m a x i m u me x pr e s Ｇs i o na t ２５ħa n d ６h o u rw h e n t h e c o n c e n t r a t i o no f I P T G w a s １．０mm o l /L ．T h em o l e c u l a rw e i gh t o f t h e e x Ｇp r e s s e d p r o t e i nw a s a b o u t ６０k u ,m a i n l y e x i s t e d i n t h e f o r mo f i n s o l u b l e i n c l u s i o nb o d y．A f t e r p u r i f i c a t i o n ,t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n a n d p u r i t y w e r e r e s p e c t i v e l y ５．１６５m g /m La n d ９７％．I n c o n c l u s i o n ,V P ３p r o t e i n o f N D P V w a s e f f i c i e n t l y e x p r e s s e d i n p r o k a r y o t i c c e l l s a n dw h i c h l a i d t h e f o u n d a t i o n f o r f u r t h e r s t u d y onN D ＧP Vd e t e c t i o nm e t h o d s a n dn e wv a c c i n e ．K e y wo r d s :D u c k p a r v o v i r u s ;V P ３;p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n ３２经㊀美等:新型鸭细小病毒V P ３基因克隆与原核表达。
鸭病毒性肝炎病毒VP3基因的克隆与表达
鸭病毒性肝炎病毒VP3基因的克隆与表达李峰;吴静;林树乾;于可响;马秀丽【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2008(000)008【摘要】提取鸭肝炎病毒RNA作为模板,进行RT-PCR扩增,得到723 bp的VP3基因,将纯化的VP3基因片段与pMD18-T载体进行连接,构建DHV VP3基因克隆重组质粒.然后定向插入到pET-32a(+)表达载体,筛选获得原核表达载体pET-32a-VP3.用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,VP3蛋白得到正确表达,其分子量为47.1 ku,表达的蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应.【总页数】4页(P14-16,20)【作者】李峰;吴静;林树乾;于可响;马秀丽【作者单位】山东省农业科学院家禽研究所/山东省禽病诊断与免疫防治重点实验室,山东,济南,250023;山东省农业科学院家禽研究所/山东省禽病诊断与免疫防治重点实验室,山东,济南,250023;山东省农业科学院家禽研究所/山东省禽病诊断与免疫防治重点实验室,山东,济南,250023;山东省农业科学院家禽研究所/山东省禽病诊断与免疫防治重点实验室,山东,济南,250023;山东省农业科学院家禽研究所/山东省禽病诊断与免疫防治重点实验室,山东,济南,250023【正文语种】中文【中图分类】Q785;S858.325.3【相关文献】1.海洋双RNA病毒(MABV)VP3基因的克隆与表达 [J], 林建国;胡瑛;王常高;蔡俊2.禽脑脊髓炎病毒VP3基因的克隆与表达 [J], 李涛;葛俊伟;关云涛;陈洪3.鹅细小病毒VP3基因的克隆与表达 [J], 邓尚龙;黄仁美;王生育;颜江华;江清银4.鹅细小病毒VP3基因和鹅副黏病毒F基因在重组禽痘病毒中联合表达 [J], 于志丹;王君伟;孙进华;藏玉婷;张雅为5.鸭病毒性肝炎卵黄抗体对鸭病毒性肝炎治疗效果研究 [J], 杨燚;任培森;崔红军;张永欣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鸭肝炎病毒Ⅰ型基因片段的原核表达及单克隆抗体的制备
ｃ ｍｂｎ ｎ ｕｉｎｐ ｏｅｎ ２ Ｄ ｏ ｏ ｗ ｓｏ ｔｉｅ ． ｈ ＡＬ ／ ｍｉ ｒ ｍｍｕ ｉｅ ｔ ｈｓｒ． ｏ ｉａ ｔ ｓ ｒ ｔｉ（ ０ｋ ｒｓ ） ａ ｂａｎ ｄ Ｔ ｅＢ Ｂ ｃ ｃ ｗｅｅｉ ｆ ｏ ｅ ｎｚ ｄ ｗｉ ｔ ｉ ｅ ｈ
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Ｃ Ｈ ＥＮ Ｇ Ｌｏ ｎｇ — ｆ ｅ ｉ ０， ＳＨ Ｉ Ｓ ｈａ ｏ — ｈ ｕａ ，Ｃ Ｈ ＥＮ Ｈ ｏ ｎｇ — ｍｅ ｉ ， Ｈ Ｕ Ａ ＮＧ Ｙｕ
成 员 Ⅲ 。鸭 甲型 肝 炎 是 由 １ 、２ 、 ３型 ３ 种 不 同 的 鸭
பைடு நூலகம்
甲肝病 毒 （ ＤＨＡＶ） 引 起 嘲 。 丁 春 宇 等 对 其 重
新 分 类和 命 名 ， 分为 ３个 不 同基 因 型 ， 即 Ｄ ＨＡＶ一 １ 、
收 稿 日期 ：２ ０ １ ５ —０ ４ 一Ｏ ｌ初 稿 ；２ ０ １ ５ —０ ５ —０ ８修 改 稿
福 建 农 业 学报 ３ ０ （ ５ ） ： ４ ２ ５ ￣４ ２ ９ ， ２ ０ １ ５
Ｆ ｕ ｊ ｉ ａ ｎ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ Ｊ ’ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ
文 章 编 号 ：１ ０ ０ ８ —０ ３ ８ ４（ ２ ０ １ ５ ）０ ５ —４ ２ ５ —０ ５
施 少 华 ， 陈红 梅 ，黄 瑜
（ １ ． 江 西 农 业 大学 动 物 科 学 技 术 学 院 ， 江西 南昌 ３ ３ ０ ０ ４ ５ ；２ ．福 建 省 农 业 科 学 院畜 牧 兽 医研 究 所 ， 福建 福 州 ３ ５ ０ ０ １ ３ ）
摘 要 ：参 照 鸭 １型 甲肝 病 毒 亚 型 （ ＤＨ Ａ Ｖ— ｌ ａ ） 的 基 因组 序 列 设 计 了 １ 对Ｖ Ｐ ３基 因 特 异 性 扩 增 引 物 ， 通过 Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ 方 法 扩 增 获得 了 ＤＨ Ａ Ｖ— ｌ ａ 结构蛋 白Ｖ Ｐ３ 基 因， 将纯化的 Ｖ Ｐ３ 基 因与 ｐ Ｅ Ａ Ｓ Ｙ Ｍ－ Ｔ Ｂ ｌ ｕ ｎ ｔ Ｚ ｅ ｒ ｏ Ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ Ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ 连接， 构 建
为 进 一步 研 究 ＤＨ Ａ Ｖ— ｌ ａ Ｖ Ｐ３蛋 白功 能 和 以 Ｖ Ｐ３ 蛋 白为抗 原 研 制 Ｄ ＨＡ Ｖ— ｌ ａ 诊 断 试 剂盒 奠 定 基 础 。
关 键 词 ：鸭 １型 甲肝 病 毒 亚 型 ；Ｖ Ｐ３ 基 因 ；克 隆 ；原 核 表 达
中图 分 类 号 ：Ｓ ８ ５ ２ ． ６ 文 献 标 识 码 ：Ａ
（ １ ．Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇｅ ｏ ｆ Ａｎ ｉ ｍａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｔｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ，Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｘｉ Ａｇｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ，Ｎａ ｎ ｃ ｈ ａ ｎ ｇ，
Ｊ ｉ ａ ｎ ｇｘ ｉ ３ ３ ０ ０ ４ ５，Ｃｈ ｉ ｎ ａ；２ ．Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ａｎ ｉ ｍａ ｌ Ｈｕ ｓ ｂ ａ ｎ ｄｒ ｙ ａ ｎ ｄ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ，
Ｆｕ ｊ ｉ ａ ｎ Ａｃ ａ ｄｅ ｍｙ ｏ ｆ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ，Ｆｕ ｚ ｈ ｏ ｕ，Ｆｕ ｊ Ｊ ａ ｎ ３ ５ ０ ０ １ ３ ，Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
鸭 甲 肝 病 毒 为 小
ＲＮ Ａ
病 毒 科
ＤＨＡＶ 一 ２ 、ＤＨＡＶ一 ３ ，其 中 ＤＨＡＶ 一 １为 传 统 的 １
型 ＤＨＶ、ＤＨＡＶ一 ２为 台 湾 型 ＤＨＶ、ＤＨＡＶ 一 ３为 韩 国型 ＤＨＶ。 目前 ，我 国流 行 的 Ｄ ＨＡＶ 主 要 有
（ Ｐ ａ ｃ ｏ ｒ ｎ ａ ｖ ｉ ｒ ｉ ｄ ａ ｅ ） 禽 肝 病 毒 属 （ Ａｖ ｉ ｈ ｅ ｐ ａ ｔ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ）
Ｖｅ ｃ ｔ ｏｒ ． Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏｍ ｂ ｉ ｎ ａ ｎｔ ｅ ｘｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏｎ ｐｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ，ｐＥＴ－ ３ ２ａ — ＶＰ３，ｗ ａ ｓ ｃ ｏ ｎｓ ｔ ｒ ｕｃ ｔ ｅ ｄ ｂｙ ｉ ｎｓ ｅ ｒ ｔ ｉ ｎｇ ｔ ｈｅ ｔ ａ ｒ ｇ ｅ ｔ ｇ ｅ ｎｅ ｆ ｒ ａ ｇｍ ｅ ｎｔ
ｉ ｎ ｔ ｏ ｐ Ｅ Ｔ一 ３ ２ ａ（ ＋ ）ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ａ ｎ ｄ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ Ｅｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ ＢＬ ２ １（ ＤＥ３ ）ｃ ｏ ｍｐ ｅ ｔ ｅ ｎ ｔ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ．Ｉ ｎ ｔ ｈ ｉ ｓ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ 。Ｓ ＤＳ － ＰＡＧＥ ａ ｎ ｄ Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ — ｂ ｌ ｏ ｔ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｅ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ＶＰ３ ，ａ ｐ ｐ ｒ ｏ ｘ ｉ ｍａ ｔ ｅ ｌ ｙ ４ ７ ｋ Ｄａ ｉ ｎ ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｍａ ｓ ｓ ，ｗａ ｓ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｅ ｄ ｈ ｉ ｇ ｈ ｌ ｙ ｉ ｎ Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｐ Ｅ Ｔ－ ３ ２ ａ — ＶＰ ３ ｗａ ｓ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ １ ． ０ ｍｍｏ ｌ・ＬＩ １ Ｉ Ｐ ＴＧ ａ ｔ ３ ７ ℃ ． Ｔｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｅ ｄ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｗａ ｓ ｒ ｅ ｃ ｏ ｇ ｎ ｉ ｚ ｅ ｄ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｌ ｌ ｙ ｂ ｙ Ａｎ ｔ ｉ — Ｈｉ ｓ Ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｍＡｂ ｓ ｈ ｏ ｗｉ ｎ ｇ ａ ｇ ｏ ｏ ｄ ｂ ｉ ｏ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ． Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ ：ｄ ｕ ｃ ｋ ｈ ｅ ｐ ａ ｔ ｉ ｔ ｉ ｓ Ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｔ ｙ ｐ ｅ ｌ ａ ；ＶＰ ３ ｇ ｅ ｎ ｅ ；ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ； ｐ ｒ ｏ ｋ ａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ
Ｄ ＨＡ Ｖ— ｌ ａ Ｖ Ｐ３ 基 因克 隆 重组 质 粒 ， 然后将 Ｖ Ｐ３ 基 因片 段 插 入 ｐ Ｅ Ｔ － ３ ２ ａ （ ＋） 表达载体 ， 转化 Ｅ ｃ ｏ ｌ ｉ Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 感 受 态
细胞 。 以 １ ． ０ ｍｍ ｏ ［ ・ Ｌ Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ于 ３ ７ ℃诱 导表 达 ， 经 Ｓ Ｄ Ｓ － Ｐ Ａ Ｇ Ｅ和 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 分析表 明 Ｖ Ｐ３ 基 因于 大 肠 杆 菌 中成 功表达， 其分 子量 为 ４ ７ ｋ Ｄ ａ ， 且表达的 Ｖ Ｐ ３蛋 白能够 与 Ａｎ ｔ ｉ － Ｈｉ ｓ Ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｍＡ ｂ 发 生 特 异性 反 应 ， 具 有 良好 的生 物 活 性 ，
黄 剑 梅 ，傅 秋 玲 ，傅光 华 ，等 ． 鸭 １ 型 甲肝 病 毒 亚 型 ＶＰ３基 因 的 克 隆 与 原 核 表 达 Ｆ － Ｊ ］ ．福 建农 业 学 报 ，２ ０ １ ５ ，３ ０（ ５ ） ：４ ２ ５ —４ ２ ９ ． ＨＵＡＮＧ Ｊ － Ｍ ，Ｆ Ｕ Ｑ— Ｌ ，Ｆ Ｕ Ｇ— Ｈ，ｅ ｔ ａ １ ．Ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ Ｐ ｒ ｏ ｋ ａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃ Ｅｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ＶＰ３ Ｇｅ ｎ ｅ ｏ ｆ Ｄｕ ｃ ｋ Ｈｅ ｐ ａ ｔ ｉ ｔ ｉ ｓ Ａ Ｖｉ ｒ ｕ ｓ Ｔｙ ｐ ｅ １ Ｓ ｕ ｂ ｔ ｙ ｐ ｅ［ Ｊ ］
传统的 １ 型 ＤＨＶ 和韩 国型 ＤＨＶ。 近 些年 ，Ｄ ＨＡＶ一 １的致 病 特 点 除 了引 起 肝 脏
作 者 简 介 ：黄 剑 梅 （ １ ９ ８ ８ 一） ，女 ，硕 士 研究 生 ，研 究 方 向 ：预 防 兽 医学 （ Ｅ — ｍａ ｉ ｌ ：ｈ ｊ ｉ ａ ｎ ｍｅ ｉ ｌ ０ ＠１ ６ ３ ． ｃ ｏ ｎ） ｒ ＊通 讯 作 者 ：黄 瑜 （ １ ９ ６ ５ 一） ，男 ，博 士 ，研 究 员 ，研 究 方 向 ：动 物 传 染 病 学 （ Ｅ — ｍａ ｉ ｌ ：ｈ ｕ ａ ｎ ｇ ｙ ｕ 一８ １ ５ ＠１ ６ ３ ． ｃ ｏ ｎ） ｒ 基 金 项 目 ： 国家 自然 科 学 基 金 项 目 （ ３ １ ４ ７ ２ ２ ２ ２ ） ；福 建 省 科 技 计 划 项 目—— 省 属 公 益 类 科 研 院所 基 本 科 研 专 项 （ ２ ０ １ ４ Ｒ１ ０ ２ ３ — ３ ） ；现 代 农 业 产 业 技 术 体 系 建 设 专项 （ Ｃ ＡＲＳ － ４ ３ ） ；福 建 省 自然 科 学 基 金 项 目 （ ２ ０ １ ５ Ｊ ０ １ １ １ ３ ） ；新 世 纪 “ 百 千 万 人 才 工 程 ” 国 家 级 人 选 科研补助资金 （ ＮＣ ＮＣ ＭＴ Ｐ Ｃ － ２ ０ ０ ９ ）
Ｆ ｕ ｊ ｉ ａ ｎ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ，２ ０ １ ５ ，３ ０（ ５ ） ：４ ２ ５ —４ ２ ９ ．
鸭 １型 甲肝 病 毒 亚型
３基 因 的克 隆 与原核 表 达
黄 剑 梅 ，傅 秋 玲 ，傅 光 华 ，万春 和 ，陈 翠腾 ， 陈 珍 ，程 龙 飞 ，
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｔｈ ｅ ＶＰ３ ｇ ｅ ｎ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｈ ｅ ｐ ａ ｔ ｉ ｔ ｉ ｓ Ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｔ ｙ ｐ ｅ １ ｓ ｕ ｂ ｔ ｙ ｐ ｅ（ ＤＨＡｖ． １ ａ ）ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｋｓ ｗａ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ｂ ｙ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｖ ｅ ｒ ｓ ｅ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｃ ｒ ｉ ｐ ｔ ｉ ｏ ｎ － ｐ ｏ ｌ ｙ ｍｅ ｒ ａ ｓ ｅ ｃ ｈ ａ ｉ ｎ ｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ（ ＲＴ— ＰＣ Ｒ）ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｏ ｎ ｅ ｐ ａ ｉ ｒ ｏ ｆ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｆ ｉ ｃ ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ｓ ｄ ｅ ｓ ｉ ｇ ｎ ｅ ｄ ａ ｃ ｃ ｏ ｒ ｄ ｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｐ ｕ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｅ ｄ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ｏ ｆ ＤＨＡＶ— ｌ ａ ． Ｔｈ ｅ ｔ ａ ｒ ｇ ｅ ｔ ＤＮＡ ｗａ ｓ ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ａ ｎ ｄ ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ｐ ＥＡＳ ＹＴ Ｍ－ Ｂｌ ｕ ｎ ｔ Ｚ ｅ ｒ ｏ Ｃｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ