PCR引物设计及软件使用技巧
引物设计的原则以及常见引物设计软件的使用
450-500 P.E.
# range. ——p70,oligo7 manual
三 常用软件使用方法
4.Beacon Designer8
与primer premier6界面类似，增加了设计引物的种类，可用于设
计各种实时定量的引物和探针，分子信标等。
三 常用软件使用方法
4.Beacon Designer8
一 前言
如何设ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ引物？
遵循引物设计的原则 设定引物的一些参数 利用引物设计软件搜索，评价引物
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二 引物设计原则
1.引物的长度
引物的长度一般选择在18-27个碱基之间，过长和过短都会降 低引物结合效率。
2.引物的Tm值
引物的Tm值一般选择在55-65℃之间，上下游引物之间Tm相差 不宜超过4℃。 Tm值：两段互补的碱基序列解链50%时的温度 估算Tm=4*(G+C)num+2*(A+T)num
此外，Beacon Designer增加了标记外显子的选项，使得方便设计跨外 显子的引物，提高实时定量引物的特异性。 Locate exon + Junction Primer serach
三 常用软件使用方法
4.Beacon Designer8
导出引物信息为表格文件-Export Results
引物设计的原则以及
常见引物设计软件的使用
伏东科 20150618
目录
一 前言 二 引物设计原则 三 常用软件使用方法
四 常见问题
一 前言
什么是引物？
引物（primer），又称引子，是一小段单链DNA或RNA，用来作 为DNA复制的起始点（终点）。
《2024年利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究》范文
《利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究》篇一一、引言随着分子生物学技术的飞速发展，聚合酶链式反应（PCR）已成为实验室研究中不可或缺的技术之一。
PCR引物设计是PCR实验成功的关键步骤之一，其准确性直接影响到PCR的扩增效率和特异性。
因此，选择合适的引物设计软件对于PCR实验的成功至关重要。
本文将介绍如何利用PrimerPremier5.0软件进行PCR引物设计的研究。
二、PrimerPremier5.0软件简介PrimerPremier5.0是一款功能强大的引物设计软件，具有直观的用户界面和丰富的功能，可帮助研究人员快速设计高质量的PCR引物。
该软件支持多种PCR类型，包括常规PCR、实时荧光定量PCR等，可满足不同实验需求。
三、PCR引物设计流程1. 输入目标序列：打开PrimerPremier5.0软件，输入需要设计引物的目标序列。
目标序列可以是基因片段、cDNA等。
2. 设置引物参数：根据实验需求，设置引物的长度、GC含量、退火温度等参数。
PrimerPremier5.0软件会根据这些参数，自动筛选出符合要求的引物序列。
3. 设计引物：在软件中，通过设置不同的引物组合，生成多个潜在的引物序列。
这些引物序列的特异性和扩增效率可通过软件进行评估和预测。
4. 筛选引物：根据实验需求和引物评估结果，选择最合适的引物序列。
在选择过程中，需要考虑引物的特异性、扩增效率、引物间及引物与模板间的互补性等因素。
5. 验证引物：将设计的引物序列导入PCR实验中，进行验证。
通过PCR实验结果，评估引物的特异性和扩增效率。
四、PrimerPremier5.0软件的优势1. 直观的用户界面：PrimerPremier5.0软件具有直观的用户界面，使得用户可以轻松地完成引物设计过程。
2. 丰富的功能：该软件支持多种PCR类型，可满足不同实验需求。
同时，该软件还具有引物评估和预测功能，可帮助用户选择最合适的引物序列。
引物设计原则及设计软件详解
避免引物二聚体
避免引物之间形成二聚体，以减少对荧光信 号的干扰。
荧光标记
选择合适的荧光标记，以确保荧光信号的稳 定性和准确性。
引物效率
优化引物浓度和PCR反应条件，以提高扩增 效率和准确性。
案例四：测序引物设计
引物长度
测序引物长度一般为18-24个碱基， 过长或过短都会影响测序质量。
GC含量
GC含量应适中，以保证测序反应的 稳定性和准确性。
设计原理
Primer3基于引物设计的热力学原 理，结合序列特异性信息，通过 算法自动筛选符合用户需求的引 物对。
使用方法
用户需提供目标序列及引物设计 参数（如引物长度、GC含量等） ，软件将输出符合要求的引物列 表，供用户选择。
Oligo软件
Oligo概述
Oligo是一款专业的引物设计软件，适用于各种PCR实验需求，提 供高度自定义的引物设计选项。
设计原理
GeneFisher结合序列特异性信息和PCR反应原理，通过智 能算法设计具有高特异性、高效扩增能力的引物。
使用方法
用户需输入目标序列及相关参数（如引物长度、GC含量等 ），软件将生成符合要求的引物对，并提供详细的引物评
估信息。
其他引物设计软件
其他软件概述
设计原理及特点
使用方法
除了上述三款主流软件外，还有许多 其他优秀的引物设计软件可供选择， 如Primer-BLAST、PrimerExpress等 。
避免与其他序列的同源性
引物应尽量避免与其他已知序列 具有同源性，以减少非特异性扩 增的可能性。
02
引物设计原则详解
特异性原则
引物特异性
确保设计的引物能够特异性地与目标 序列结合，避免与非目标序列的交叉 反应。
如何设计PCR扩增引物
如何设计PCR扩增引物1.找出这种细胞物种的PTN全长核苷酸序列2.采⽤primer premier 5.0软件设计引物设计应注意如下要点：● 1. 引物的长度⼀般为15-30 bp，常⽤的是18-27 bp，但不应⼤于38，因为过长会导致其延伸温度⼤于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进⾏反应[2]。
● 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较⾼，尤其是3’端相似性较⾼的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
● 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较⼤的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显⾼于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使⽤碱基A[3][4]。
另外，引物⼆聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。
5’端序列对PCR影响不太⼤，因此常⽤来引进修饰位点或标记物[2]。
● 4. 引物序列的GC含量⼀般为40-60%，过⾼或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太⼤[2][5]。
● 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种⽅法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使⽤的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。
● 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的⾃由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选⽤3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），⽽5’端和中间ΔG值相对较⾼的引物。
引物的3’端的ΔG值过⾼，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。
●7. 引物⼆聚体及发夹结构的能值过⾼（超过4.5kcal/mol）易导致产⽣引物⼆聚体带，并且降低引物有效浓度⽽使PCR反应不能正常进⾏[8]。
●8. 对引物的修饰⼀般是在5’端增加酶切位点，应根据下⼀步实验中要插⼊PCR产物的载体的相应序列⽽确定。
引物设计及PCR技巧
一．PCR引物设计的原则引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补；其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。
必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp（20bp左右），但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC 最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
另外，上下游引物所对应模板位置序列的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
《2024年利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究》范文
《利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究》篇一一、引言PCR（聚合酶链式反应）是现代分子生物学领域中常用的一种技术，广泛应用于基因克隆、基因表达、突变检测等研究领域。
而PCR引物设计作为PCR实验的关键步骤，直接影响到实验的成败和结果的准确性。
随着计算机技术的飞速发展，利用软件进行PCR引物设计已经成为研究者的得力助手。
本文将详细介绍如何利用PrimerPremier5.0软件进行PCR引物设计，并探讨其在实际研究中的应用。
二、PrimerPremier5.0软件简介PrimerPremier5.0是一款功能强大的引物设计软件，它可以根据用户提供的DNA序列信息，自动设计出合适的PCR引物。
该软件具有界面友好、操作简便、引物设计精确等特点，深受广大研究者喜爱。
三、PCR引物设计的基本原则在进行PCR引物设计时，需要遵循一定的原则，以确保引物的特异性和有效性。
主要包括以下几点：1. 引物长度：一般控制在18-27bp之间，过短可能导致特异性降低，过长则可能增加实验难度。
2. 引物序列：应选择与模板序列高度互补的序列，以增加PCR的特异性。
3. 退火温度：应选择合适的退火温度，以保证PCR反应的稳定性和重复性。
4. 避免二级结构：引物设计时应尽量避免形成二级结构，以减少非特异性扩增的可能性。
四、利用PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的步骤1. 打开PrimerPremier5.0软件，导入待设计的DNA序列。
2. 设置引物设计的参数，包括引物长度、GC含量、退火温度等。
3. 进行引物设计。
软件将根据设定的参数，自动在DNA序列中寻找合适的引物。
4. 查看和分析引物结果。
软件将显示所有设计的引物及其相关信息，如位置、长度、GC含量等。
研究者可以根据实际需要选择合适的引物。
5. 导出引物信息。
将选定的引物信息导出，用于PCR实验。
五、PrimerPremier5.0在PCR引物设计中的应用PrimerPremier5.0软件在PCR引物设计中具有广泛的应用。
Primer premier 5.0设计pcr引物
1.安装软件Primer premier5.0。
程序下载：Primer Premier 5.0 /Soft/2005/114.htm 2.程序中双击打开3.点FILE---NEW—DNA SEQUENCE如图所示。
4.输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。
5.选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏6.选中OK键，分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶7.选中primer图标，点S图标，edit primer,开始设计正义链。
8.软件默认引物为25个碱基9.可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7－9个碱基，保留16－18个配对即可10．在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入HIND III酶切位点及TTA保护碱基，完成后点analyze，认为可以后点OK。
11.选中左上角A图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。
如图，选中EDIT PRIMERS图标，开始设计反义链。
12.从3端删除7－9个碱基同正义链。
13.将酶切位点加在5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入BamH I酶切位点及CGC3个保护碱基。
完成后点analyze，认为可以后点OK。
14.最后分析结果如图，反义链的FALSE PRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也可以不考虑，主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。
GC含量不应超过60％15.该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印16.如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示。
同上输入目的基因片段，选SEARCH 图标，选择参数，一般选PCR primers---both—100至250个碱基，引物长短20＋/-2，search parametere中的参数可以不选，为默认设置。
点OK。
PCR引物设计及软件使用
GenBank DNA序列数据库拥有来自 47,000个物种的30亿个碱基
在“Search”搜索框 中选择“Nucleotide”
rfbE
检索结果中有很多无关菌，为查 找Ecoli.的rfbE基因带来麻烦
限制检索范围，将结果 锁定于待查目标
rfbE
Escherichia coli
基因序列长度
引物的修饰
5’端序列常用来引进修饰位点或标记物
导入同源序列
PCR模板及引物位置
上下游引物的性质
引物的二级结构
尽可能选取不形成二级结构的引物 选取二级结构能值较低的引物 （<4.5kcal/mol）
3. 引物与探针的设计
（2）探针的设计—分子信标
TM Utility v1.3
mfold
分子信标设计的原则
AGGTGAAGGTGGAATGGTNNNNNNNNNN CTGTACATAGGCAATATTGGNNNNNNNNN NCTTGTTCTAACTGGGCTAA
更多信息……
DnaSP 4.50.3 SNPHunter 1.75 G-InforBIO V1.89 Oligo 7.0 Beacon Designer 7.5 TGGE-STAR AutoDimer 1.0 MutaPrimer 1.0 PCR Analyzer 1.0 基因多态性分析软件 SNP（单核苷酸多态性）查找软件 基因组数据建库与分析软件 引物分析著名软件 荧光定量PCR分子信标及TaqMan探针设计软件 PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件 快速筛选二聚体引物软件 用于定点突变的引物设计软件 实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件 有名的在线引物设计程序 在线引物设计程序 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件
PCR引物设计技巧
PCR引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学研究的技术方法，它通过体外去合成DNA的方法，在温度循环条件下，通过DNA聚合酶酶的作用，将目标DNA序列扩增至数百万倍。
PCR引物是PCR反应核心的组分之一，引物设计的合理与否对PCR反应的成功与否有着至关重要的影响。
以下是一些PCR引物设计的技巧。
1.引物长度：引物的设计需要考虑到目标序列的长度，一般情况下，引物长度推荐在18-25个碱基对之间，过长的引物容易造成PCR效率低下，而过短的引物则可能引起非特异性扩增。
2.引物Tm值：引物的Tm值是指在PCR反应中引物与模板DNA的温度中断，即DNA链断裂的温度。
引物的Tm值应该在PCR反应的退火温度范围内，通常在50-65摄氏度之间，且引物对称Tm相差应小于1-2摄氏度，以保证引物的特异性。
3.引物GC含量：引物GC含量的选择与PCR反应的引物结合和扩增效率有关。
引物的GC含量推荐在40-60%之间，过高的GC含量可能造成引物之间的聚合作用过强，而过低的GC含量可能造成引物与模板DNA结合能够性不足。
4.引物序列重复：引物的序列应避免重复，以免在PCR过程中发生串联扩增。
同时，引物的序列也要尽量避免多次在基因组中出现的位置，以减少非特异性扩增的可能。
5.引物间的相互作用：在设计引物时，还需要考虑引物本身和引物与模板DNA之间的相互作用。
引物之间不应有相互结合的可能性，以免引物之间相互影响降低扩增效果。
同时，引物与模板DNA之间也不应有非特异性的结合，以免引发假阳性结果。
6.引物的特异性：引物的特异性是PCR反应的关键。
在设计引物时，需要通过引物序列的特异性比对和BLAST，确保引物只与目标序列相匹配，而不与其他非目标序列相结合。
7.引物的位点选择：在目标序列上选择引物时，推荐选择在非保守区域的位点，以增加扩增特异性。
此外，在设计引物时，也应避免选择在基因组中出现多个拷贝的区域，以防止在扩增过程中产生非特异性扩增。
PCR引物设计及相关软件
主要内容
背景（PCR反应,引物，引物的重要性） PCR引物设计原则 常用PCR引物设计软件 Primer Premier 5.0 介绍 Oligo 6.22 介绍 在线Primer3 介绍
PCR
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外 核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、 快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点； 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使 肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴 血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析 研究和检测鉴定。
一般要求：55℃-65℃。 计算：
– 对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据
Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
– 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从
“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物 设计软件最常用的计算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
引物（primers)
引物是人工合成的两段 寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 3’ 5’
Sense primer 5’
→
一条DNA模板链互补，
另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
Antisense primer
←
3’
引物的重要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。 PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不 与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求 DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引 物设计好坏与PCR结果密切相关。