琼脂打孔法抑菌圈试验
犊牛腹泻沙门菌抗菌药敏感性试验与中药体外抑菌试验
Abstraci: In order to determine the bacteriostatic effect of 15 antikactrial drugs and 22 traditional Chinese medicines on Salmo nella diarrhoea in calves in Hebei，13 strains of Salmonella diarrhoea in calves were tested for tOeir resistance to the 15 antibactrial drugs by K-T disc method. 22 traditional Chinese medicines such as gallnut and schisandra chinensir were extracted by traditional watf decoction method and tested by agaf drilling metOod. The minimum inhibitom concentration ( MIC) and minimum bactericidal concentation ( MBC) of traditional Chinese medicine were determined by modified double dilution plate metOod. The results showed that 13 Sahonella strains were muPi-msistant to antibactrial drugs . They were highly resistant to tmicocin，oxyttracycline，sulfa methoxazole and compound sinomenine. The resistance rate was 100%. The resistance rates of the other 11 antibacterial drugs were 30. 77% - 92. 31%. The sensitivity mte to amikacin was the highest with 69. 23% . Among 22 kinds of traditional Chinese medi cine ，8 kinds of traditional Chinese medicine had bacteriostatic effect on 13 Salmon£Ua strains. The order of bacteriostatic intensity from strong to weak was gallnut，schisandra chinensir，black plum，terracotta chebula，ligustrum lucidum，pomevranate peel，sapphire wood and scutlPriv baicalensis. Among tOem，gallnut had the best effect in this study，MIC and MBC were both 7. 81 -31. 25 mg/ mL. The results showed tOat 13 strains of Salmonella, had high resistance to antibacterial drugs，while some traditional Chinese medi cines had good bacteriostatic effect on Salmonella. This study provibed a scientific basis for clinical application of antibacterial drugs and traditional Chinese medicine in tOe treatment of calf diarrhea caused by Salmonelli.
琼脂打孔法抑菌圈试验
琼脂打孔法抑菌圈试验琼脂打孔法（琼脂打孔抑菌圈实验）⼀、试验原理利⽤抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显⽰其抑菌作⽤。
试验通过抑菌圈⼤⼩以判断其是否具有抑菌能⼒。
本试验适⽤于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。
⼆、试验器材、化学试剂及菌种培养⽫、试管、5uL～50uL 微量移液器，100uL～1000uL微量移液器以及配套的枪头、10mL离⼼管、游标卡尺、涂布棒、麦⽒⽐浊管、电动混合器、⽔浴锅、超净⼯作台、⾼压灭菌锅、⿎风⼲燥箱、⽣化培养箱、电热炉营养琼脂培养基、PBS缓冲液、⽆菌⽔、95%⼄醇。
菌种：溶⾎性链球菌、溶⾎性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、⽩喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、⼤肠杆菌三、试验步骤1、实验⼯器具准备及灭菌在锥形瓶中配置营养琼脂培养基，⽤电热炉加热煮沸⾄澄清状态，盖好塞⼦，同PBS 缓冲液、⽆菌⽔、配套枪头、涂布棒、离⼼管⼀同放⼊⾼压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。
将培养⽫⽤⽜⽪纸包好和试管⼀起放⼊⿎风⼲燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。
实验前超净⼯作台及操作室使⽤前需⽤紫外灯杀菌30min以上。
2、倒培养⽫将培养基及培养⽫放置到60℃后开始倒培养⽫，培养基使⽤前摇匀，每个培养⽫倒15～20mL左右，倒好后⽔平静置⾄完全凝固。
3、菌悬液的制备从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加⼊5mL 的PBS缓冲液将斜⾯上，在⼿掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒⼊试管中轻轻摇匀。
吸取1mL 的菌液加⼊到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进⾏5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌悬液或106CFU/mL左右的孢⼦悬浮液（对⽐0.5麦⽒⽐浊管），将选好的菌悬液⼗倍系列稀释后选第⼆⽀试管（即浓度约为106/CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的孢⼦悬浮液）进⾏试验。
4、试验菌的接种⽤移液枪吸取浓度为 106cfu/mL 试验菌悬液0.1mL ，将其接种到已经倒好的营养琼脂培养⽫内，⽤涂布棒涂布均匀（注意涂布棒每次使⽤后在酒精灯下灭菌，涂布时动作轻不要刮破培养基），盖好培养⽫。
中药方剂对金葡菌的体外抑菌效果观察
中药方剂对金葡菌的体外抑菌效果观察作者：李永慧尹学永孔庆山张志强吴同磊朱晓芳来源：《健康周刊》2018年第02期【摘要】目的：探讨中药方剂对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果；方法：试验采用水提法提取中草药的有效成分，琼脂平板打孔法和微量二倍稀释法分别测定中草药对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径和最小抑菌浓度及杀菌浓度。
结果：黄柏、黄芩、黄连、大黄、苦参这5味中草药及复方制剂对金黄色葡萄球菌均有较强抑制作用。
结论：中药方剂具有一定的抑菌作用，为临床用藥和方剂研制提供重要理论参考。
【关键词】中药方剂；金黄色葡萄球菌；抑菌试验；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， S. aureus）简称金葡菌，是皮肤创面感染的主要致病原，约占发病总数的二分之一，近年来，随着合成及半合成抗菌素的增多和广泛使用，临床分离金葡菌多重耐药情况日益严重，为此，及早覆盖创面，对预防和治疗创面感染，促进创面愈合具有重要意义。
但医院感染专家呼吁不要在创面外用抗生素，以避免造成大量耐药性菌株的产生。
现代药理学证实了许多中草药具有清热解毒、杀菌、抑菌等作用，且抗菌谱广、不良反应少、耐药性小，能控制感染，有效地促进伤口愈合，为此，发挥中药的治疗优势将成为重要课题[1-2]。
本研究在多剂传统中药组方的基础上筛选出了抗菌作用较强的单味中药并组方，其体外抑菌疗效如下。
1 材料与方法1.1培养基与仪器设备普通的营养琼脂，购自北京陆桥技术股份有限公司；营养肉汤培养基，购自青岛高科园海博生物技术有限公司。
G1040WS-立式自动压力蒸汽灭菌器购自致微（厦门）仪器有限公司；无菌工作台购自北京亚泰科隆仪器技术有限公司；冰箱，青岛海尔特种电冰箱有限公司；隔水式恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；常规的试剂与仪器等由河北省科技师范预防兽医学重点实验室提供。
1.2 菌株来源及鉴定试验菌株为秦皇岛第二医院检验科分离、纯化和鉴定，命名为JP-1（临床分离株），金葡菌（标准株）ATCC 25923由扬州大学朱国强教授惠赠。
中药研究常用三种体外抑菌方法的比较
１０ ｌ在石 棉网上 加热 使其 溶 解后 ，２ ，０分钟 高 压蒸 ０ｍ ， １１ ２ 汽灭菌 ， 备用。Ｌ Ｂ药物 固体 培养 基 的制备 ： ９支 １ｍｌ 取 ５ 试
打孑 法 ： 菌 圈 直 径 ≥２ ｒ 为 极 敏 ， 菌 圈 直 径 在 ｌ Ｌ 抑 ０ｍ ａ 抑 ５
接 茵方 法、 结果判定等 ） 进行 了优 化。结果 ： 药物 固体培养基连 续稀释 法较其 它两方法相 比 ， 感性 高 ， 敏 重
复性好 。结论 ： 药物 固体培养基连 续稀释 法更 适于中药抑菌作用的研 究。
主 题 词 细 菌／ 物 作 用 对 比研 究 药
许 多中药具有较好 的体外抑菌作用 ， 中药抑菌又很少对
球 菌为实验菌株 ， 对研 究 中应用 最多 的打 孔法 、 体培养基 液
连续稀 释法和固体培养基连续稀 释法进行 了 比较。
１ 材 料 与 方 法
个／ 金黄色葡萄球 菌菌液 ３ ｌ加到制备好 的无菌 Ｌ ｍｌ ｍ， Ｂ琼脂
培养基上 ， 轻晃 动 ， 轻 待菌 液完全 均匀覆 盖后静 置 １分 再
病 原菌产生抗药性 ， 因此近年来人们在 中药抑菌方面研究 较 多。涉及 的研究 方法不外 乎 两大方面 ： 是连续 稀释 法 ， 一 具
管 ，０个直径 ３ ｍ的小培养皿 ； ３ ｃ 在其 中的 ８支试 管中依次加 入上述 ８个不同浓度的黄连水 煎液 ｌｍ ， ９管为对 照管 ， Ｏ ｌ第 加入 １ ｍ 稀释液 （ ０ｌ 蒸馏水 ） 。然后 ９支试管 按 １３中固体 培 ． 养基配 方 比例 依 次 准确 加 入 酵 母 提 取 物 ０ ０ ｇ 蛋 白胨 ．５ 、 ０ １、ａ１ ．５ ． ｇＮ Ｃ ０ ｇ及琼脂粉 ０ ２ ， ０ ． ｇ 隔水加热 ， 使各组 分充分溶 解并混匀后 ， 高压灭菌 ， 常规倒 板 ， 每管 培养基倒 ３个板 （ 为 重复板 ） 用于 ＭＩ 的测定 。 ， Ｃ值 １４ 抑 菌试验 ． 琼脂平板扩散 法¨ （ 打孔法 ） 取 １Ｘ１ ： ０
8种中草药对大肠杆菌的体外抑菌试验_向双云
10
8 种中草药对大肠杆菌的体外 MIC 测定结果 黄芩 + + ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 黄连 － － － + ++ ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ 黄柏 + + ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 鱼腥草 穿心莲 五味子 － + － － － + ++ ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ + ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ － － － + + ++ +++ ++++ ++++ ++++ 连翘 － + ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 艾草 － － － － + + + ++ +++ ++++ ++++
微生物菌种选育实验指导
《微生物菌种选育实验》是一门涉及食品理化分析、微生物学实验且由学生自行设计实验方案的综合性、设计性实验课程，集中三周时间开课。
一、实验目的通过本环节训练，加深对发酵工程上游技术中菌种筛选的认识；学会常规选种方法；掌握微生物诱变育种的方法；掌握常规工业微生物菌种保藏法；树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。
二、实验内容实验一工业微生物菌种分离根据一定的生产目的如产酶、产酸、产酯等，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如曲药、酸乳、土壤中筛选出高产适宜的菌株。
1、分离培养基的配制2、无菌器材的准备3、菌悬液的制备4、接种5、培养6、初步鉴定(1) 菌落形态(2) 个体形态7、斜面接种培养实验二工业微生物菌种复筛通过摇瓶培养对实验一所得的菌株的生产性能进行精确的定量测定。
1、发酵培养基的配制；2、目的菌株的摇瓶培养；3、发酵液的生理活性测定。
实验三微生物的诱变育种用紫外线对实验一所得的高产菌株进行诱变，并测定诱变后的菌株的生产能力。
1、单细胞(或单孢子) 悬液的制备；2、致死曲线的测定；3、诱变处理；4、初筛；5、复筛；6、菌种保藏。
三、实验要求1．学生自行设计具体实验方案，在教师指导下由学生自主完成实验。
2．实验结束后，要求学生完成一篇微型小论文。
论文的撰写应本着实事求是的原则，对所做实验过程和数据进行认真、严格的记录和处理，并进行独立分析，不得抄袭他人的数据。
四、考核办法1、考核内容：实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等。
2、考核办法：按照实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等内容综合考核学生，得到学生该门实验课程的成绩。
成绩考核采用优秀、良好、中等、及格、不及格五级记分制。
3、考核标准：以实际操作技能和分析解决问题的技能为主，实验考核内容各单项所占分数比例为实验方案20%、实验态度10%、操作技能40%、实验报告30%。
微生物菌种选育概述微生物的菌种对进行微生物工作来讲是非常重要的。
没有“种”无法进行微生物的科学研究；没有良种，不能进行发酵工业的生产。
8种滇产中草药体外抑菌活性筛选
［ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ： Ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍ ｉ ｎ ｅ ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｌ ａ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｅ ｔ ｈ ａ ｎ ｏ ｌ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ ８ Ｃ ｈ ｉ －
Ｃｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｈｅ ｒ ｂ ａ ｌ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｙｕ ｎ ｎ ａ ｎ
Ｄ Ｉ Ｎ Ｇ Ｙ ａ ｎ ｊ ｉ ａ ｏ ， Ｚ Ｕ Ｏ Ｇ ｕ ｏ ｙ ｉ ｎ ｇ “， Ｈ Ａ Ｏ Ｘ ｉ ａ ｏ ｙ ａ ｎ
（ Ｊ ．Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆＰ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ，Ｇ ｕ ｉ ｙ ａ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ， Ｇ ｕ ｉ ｙ ａ ｎ ｇ ５ ５ ０ ０ ０ ４ ， Ｇ ｕ ｉ ｚ ｏｕ ｈ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ； ２ ．Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ
第３ ８卷
第 ２期 ２ ０ １ ３ 年４ 月
贵 阳 医 学
院 学 报
Ｖ０ １ ． ３ ８ Ｎｏ ． ２
２ ０１ ３ ． ４
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＧＵＩ ＹＡＮＧ ＭＥＤＩ ＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ ・Fra bibliotek论著 ・
８种 滇产 中草药 体 外 抑 菌 活 性 筛 选 水
ＭＢ Ｃ在 ６ ４～１ ０ ２ ４ ｍ ｇ ／ Ｌ 。结论 ： 罗汉松 、 箭 根薯 等对 ＭＲ Ｓ Ａ菌株 以及 白色念 珠菌均有有 较好 的抑制作 用 ， 表 现 出广谱抗 菌活性。
［ 关键 词 ］中草药； 抑菌活性 ； 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
15味中药抑制幽门螺杆菌的体外实验
15味中药抑制幽门螺杆菌的体外实验
姜成;鄢春锦;刘蔚雯;张学敏
【期刊名称】《福建中医药大学学报》
【年(卷),期】2003(013)006
【摘要】探讨15味中药对幽门螺杆菌的抑制作用.采用打孔法测定抑菌圈直径,琼脂稀释法测定每味中药的最小抑菌浓度(MIC)值.结果表明15味中药中5味抑菌直径大于20 mm,4味10～20 mm,5味小于10mm,一味无抑菌作用;MIC值与抑菌圈的走势基本相符;黄连对幽门螺杆菌的抑制作用最强.
【总页数】3页(P30-32)
【作者】姜成;鄢春锦;刘蔚雯;张学敏
【作者单位】福建中医学院现代医学部,福建,福州,350003;福建中医学院现代医学部,福建,福州,350003;福建中医学院药学系,福建,福州,350003;福建中医学院现代医学部,福建,福州,350003
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
【相关文献】
1.3味中药对解脲支原体体外抑制作用的实验研究 [J], 董海艳;周丽萍;王乐丹
2.11味中药对痤疮丙酸杆菌的体外抑制作用研究 [J], 陈静;林海英;杨霞卿;唐芳勇
3.八味中药及其复方对鸡大肠杆菌的体外抑制试验 [J], 鹿意;梁晓;秦志华;张启迪
4.三黄泻心汤三味药联合抗生素对幽门螺杆菌的体外抑菌实验研究 [J], 耿聪;李岩;姚鑫洁
5.15味中药对猪致病性大肠艾希氏杆菌的体外抑菌试验 [J], 谷新利;剡根强;商云霞
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琼脂打孔法（琼脂打孔抑菌圈实验）
一、试验原理
利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。
试验通过抑菌圈大小以判断其是否具有抑菌能力。
本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。
二、试验器材、化学试剂及菌种
培养皿、试管、5uL～50uL 微量移液器，100uL～1000uL微量移液器以及配套的枪头、10mL离心管、游标卡尺、涂布棒、麦氏比浊管、电动混合器、水浴锅、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、电热炉营养琼脂培养基、PBS缓冲液、无菌水、95%乙醇。
菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌
三、试验步骤
1、实验工器具准备及灭菌
在锥形瓶中配置营养琼脂培养基，用电热炉加热煮沸至澄清状态，盖好塞子，同PBS 缓冲液、无菌水、配套枪头、涂布棒、离心管一同放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。
将培养皿用牛皮纸包好和试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。
实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。
2、倒培养皿
将培养基及培养皿放置到60℃后开始倒培养皿，培养基使用前摇匀，每个培养皿倒15～20mL左右，倒好后水平静置至完全凝固。
3、菌悬液的制备
从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。
吸取1mL 的菌液加入到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌
悬液或106CFU/mL左右的孢子悬浮液（对比0.5麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管（即浓度约为106/CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的孢子悬浮液）进行试验。
4、试验菌的接种
用移液枪吸取浓度为 106cfu/mL 试验菌悬液0.1mL ，将其接种到已经倒好的营养琼脂培养皿内，用涂布棒涂布均匀（注意涂布棒每次使用后在酒精灯下灭菌，涂布时动作轻不要刮破培养基），盖好培养皿。
5、抑菌剂的配置
用分析天平准确称量1g样品于灭菌后的15mL离心管内，加入10mL溶剂（无菌纯水、95%乙醇等），摇匀使溶解（根据情况可使用电动混合器摇匀或放入水浴锅中加热使溶解）。
溶解后吸取上清液对倍稀释样品，可根据情况决定稀释几次，一般稀释6～10次。
若样品是液体，可直接对倍稀释。
6、添加抑菌剂
6.1在培养皿上打三个孔，用10～100uL的枪头打孔，打完孔用无菌针头将琼脂孔中的培养基挑出（打孔时一次打孔，不能转动枪头，以防琼脂圈裂缝，影响药液扩散以致抑菌圈不均匀，每次无菌针头挑完后都要酒精灯烧一下灭菌）。
各孔中心之间相距 25mm以上，与培养皿的周缘相距 15mm 以上。
用微量移液器吸取抑菌剂20uL 到琼脂孔内（三个孔为一组），盖好培养皿。
6.2 用不加抑菌剂的培养皿、加入配抑菌剂时的溶剂做阳性对照，用未接种菌的培养皿做阴性对照。
7、培养培养皿并观察抑菌效果
于37℃生化培养箱中正置培养，培养16h～18h 观察结果。
用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录。
注：每个培养皿做一个浓度，测量抑菌圈时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌圈进行。
测量其直径应以抑菌圈外沿为界。
四、试验结果
各浓度抑菌剂抑菌圈直径（mm）
阳性对照结果：
阴性对照结果：
五、评价规定
1、抑菌作用的判断:
抑菌圈直径小于或等于 7mm 者，判为无抑菌作用。
抑菌圈直径大于 7mm 者，判为有抑菌作用。
大于7mm小于10mm判为钝敏；大于10mm小于20mm判为中敏；大于20mm为高敏。
2、3次重复试验均有抑菌作用结果者，判为合格。
3、注意事项
(1)接种用细菌悬液的浓度应符合要求。
浓度过低，接种菌量少，抑菌圈常因之增大; 浓度过高，接种量过多，抑菌圈则可减小。
(2)应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌圈的大小。
(3)培养时间不得超过 18h。
培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌圈变小。
(4)抑菌圈直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。