多克隆抗体制备
多抗制备的基本流程
多抗制备的基本流程
多克隆抗体的制备，即多抗制备，是一种获取具有多种抗原决定簇抗体的方法。
基本流程如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备具有多种抗原决定簇的抗原。
这些抗原可以是蛋白质、多肽、糖、脂类等生物大分子或小分子。
2. 动物免疫：将制备好的抗原注射到动物体内，激发其免疫系统产生抗体。
常用的免疫动物有兔子、小鼠、大鼠等。
3. 收集血清：在免疫动物后，收集其血清。
血清中含有多种抗体，即多克隆抗体。
4. 抗体的分离和纯化：将收集的血清进行分离和纯化，以获得目标抗体。
常用的方法有离心、层析、电泳等。
5. 鉴定和评价抗体：通过酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫荧光等方法，对分离出的抗体进行鉴定和评价，确定其特异性和灵敏度。
6. 抗体应用：经过鉴定和评价后的多克隆抗体可应用于生物医学研究、诊断、治疗等领域。
需要注意的是，多克隆抗体的制备过程较为复杂，涉及多个环节，如抗原制备、动物免疫、血清收集等。
在实际操作中，需严格控制实验条件，以确保制备出的多克隆抗体具有较高的质量和应用价值。
多克隆抗体制备
多克隆抗体制备多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
【晶莱生物】具体实验步骤如下：1.兔子的准备挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.预采血（作阴性参照用）1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。
2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。
3.效价检测3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。
3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。
3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
多克隆抗体的原理及制作方法
多克隆抗体的原理及制作方法一、原理多克隆抗体是由针对多种不同抗原表位的抗体组成的混合物。
外源性抗原初次进入动物体内后，可引发机体初次免疫应答，即在抗原呈递细胞（antigenpresenting cell，APC）和T细胞的作用下，未成熟B细胞被激活分化为产生抗体的浆细胞，对于大多数可溶性蛋白抗原而言，动物注射后5～7天，血清中开始出现抗体，并在12天左右达到顶峰，然后逐渐下降。
初次免疫应答产生的抗体持续时间较短，亲和力也较低。
但是受抗原刺激的B细胞除了分化为抗体产生细胞外，还增殖形成大量记忆性B细胞，它们在实施加强免疫时被快速激活，加强免疫后抗体滴度迅速上升，并持续更长时间，抗体合成率也比初次反应增加几倍到几十倍，加强免疫后7～14天出现抗体的峰值。
由于记忆B细胞的存在，需要更少的抗原刺激即可引起再次免疫应答。
记忆B细胞是长寿细胞，因此，特异性抗体应答在最后一次加强免疫之后6个月到一年都会存在。
本节介绍用佐剂乳化的抗原免疫动物获得多克隆抗血清的方法。
该法可用于免疫家兔，小鼠、大鼠或地鼠，也可用于更大的动物如绵羊、山羊或马。
二、材料（一）动物选择根据需要可选择适当品系的家兔，小鼠，大鼠或地鼠等动物进行免疫获得抗体。
动物的选择取决于所需的抗血清量以及特异性抗原的物种来源和免疫动物物种之间进化上的差异。
家兔常被选作免疫动物，因为兔与人、兔与小鼠之间的遗传学差异大，而人和小鼠来源的蛋白是最经常被研究的对象。
每次获取25ml血清的采血量，对兔本身没有明显的损伤。
（二）抗原制备优质抗血清很大程度上取决于抗原的质量、纯度和数量。
常用纯化的抗原或部分纯化的抗原免疫动物，所用抗原往往是蛋白质或肽。
一般而言，细菌或病毒蛋白如血凝素或细菌包膜蛋白有很强的免疫原性，而哺乳动物蛋白如多肽类激素或细胞膜受体则免疫原性较弱。
有时也会用到与适当的蛋白质载体、细胞或细胞与组织提取物相交联的半抗原（多糖、核酸、脂类和小分子化学物质等）以增强半抗原的免疫原性，通过化学方法将半抗原连接到已知的免疫原性强的载体蛋白上，常用的载体蛋白有匙孔戚血蓝素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）等。
兔多克隆抗体的制备流程
兔多克隆抗体的制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 免疫原制备。
选择具有免疫原性的抗原，如蛋白质、多肽或多糖等。
大肠杆菌多克隆抗体的制备和检测
一、实验目的
• 1、学习掌握凝集反应原理与方法 、
二、实验原理
• 1、多克隆抗体 、 • 由多个克隆细胞产生的多种抗体的混合物 即多克隆抗体， 即多克隆抗体，也称第一代人工抗体 天然抗原
(多个抗原表位) 多个抗原表位)
三、实验器材
• 恒温培养箱、高速离心机 恒温培养箱、 • 大肠杆菌、生理盐水、载玻片、家兔等 大肠杆菌、生理盐水、载玻片、
四、实验内容与步骤
• 1、抗原的制备 、 • 大肠杆菌菌悬液→60℃水浴 →稀释达 稀释达9 大肠杆菌菌悬液 ℃水浴1h 稀释达 亿个/毫升 毫升→无菌检查 亿个 毫升 无菌检查 • 2、免疫血清的制备 、 • 家兔耳缘静脉注射免疫 • 采血制备血清 • 3、凝集反应 、
机体
诱发多个B 诱发多个B细 胞克隆活化
产生多种针对不同表位的 相应抗体—多克隆抗体 相应抗体 多克隆抗体
2、凝集反应 、
• 颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞 颗粒性抗原（ 与相应抗体结合， 等）与相应抗体结合，在有电介质存在的 条件下，经过一定时间， 条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的 凝集小块。 凝集小块。 • 参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称 参与凝集反应的抗原称为凝集原 凝集原， 凝集素。 为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝 集反应两类。 集反应两类。
多克隆抗体制备提高效价流程
多克隆抗体制备提高效价流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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多克隆抗体的制备ppt课件
多克隆抗体的制备
根据化学基团不同，连接方法主要有以下几类：
带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐 法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与 载体羧基缩合。
带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化 学方法如琥珀酸酐法、O-羧甲基、羟胺法等方法将之转变为带有羧基 的
半抗原衍生物后才能与载体连接。
带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法， 生成带有羧基的半抗原衍生物。
多克隆抗体的制备
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多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备及 抗体活性测定
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多克隆抗体的制备
主要内容
• 多克隆抗体制备的基本原理 • 多克隆抗体制备的操作步骤 • 抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断
多克隆抗体的制备
原理
1、克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞 分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中， 如无发生突变其基因是完全相同的。
选择性沉淀：
选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境， 如：
核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法
多克隆抗体的制备 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；
超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小
的抗原物质进行滤筛。 电泳
多克隆抗体的制备
精分离
层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析
改变抗体类型，使产生抗体由IgM型转变为IgG型；
多克隆抗体名词解释
多克隆抗体名词解释多克隆抗体是指由多个B细胞克隆所产生的抗体，能够针对同一种抗原的多个不同的位点进行识别和结合。
与单克隆抗体相比，多克隆抗体具有更高的亲和力和更广泛的抗原识别能力。
多克隆抗体因其独特的特性被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程等领域。
多克隆抗体的制备过程通常包括以下几个步骤：首先，通过免疫动物（如小鼠、兔子等）免疫目标抗原，以激发其免疫系统产生抗体。
接着，从免疫动物体内采集血清，其中包含了众多的B细胞克隆所产生的不同抗体。
再经过一系列的加工和处理，如离心、加热灭活等，最终得到多克隆抗体产品。
多克隆抗体具有以下几个优点：首先，多克隆抗体能够识别和结合抗原的不同位点，从而提高抗原的检测敏感性和特异性。
其次，多克隆抗体可用于大规模和复杂多样的抗原检测，覆盖范围广，适用性强。
此外，多克隆抗体的制备工艺相对简单，成本较低。
然而，多克隆抗体也存在一些局限性。
首先，多克隆抗体的制备过程中可能会产生一些非特异性的抗体，从而降低了其特异性和纯度。
其次，多克隆抗体在不同免疫动物体内可能会产生批次差异，导致其品质和稳定性存在一定的波动。
此外，多克隆抗体由于来源于免疫动物，可能存在个体差异和免疫相容性问题。
为了克服多克隆抗体的局限性，科学家们也不断努力进行研究和改进。
例如，通过筛选和优化制备过程，可以提高多克隆抗体的特异性和纯度。
此外，还可以利用单克隆抗体技术将多克隆抗体中特异性较高的成分筛选出来，以获得更具特异性和统一性的抗体产品。
综上所述，多克隆抗体是一种能够针对同一种抗原的多个不同位点进行识别和结合的抗体。
多克隆抗体具有广泛的应用价值，但也存在一些局限性。
通过不断的研究和改进，科学家们正在努力提高多克隆抗体的质量和稳定性。
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③初次应答产生的抗体总量较低，维持时间也短，通常以 IgM 为主，且抗体的平均亲和力较低。
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再次应答(secondary response)
鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。
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免疫剂量
（1）延长抗原释放时间；
•
剂量：免疫（原2）合增适加剂抗原量的的表选面积定；应考虑抗原 性强弱、分（（子34））量佐增大剂强小能辅刺助和激T细免吞胞疫噬的细时作胞用间对；。抗原大的动处物理；
抗原剂量（（以5）蛋刺白激抗致敏原淋为巴准细胞）的约分0裂.和5～浆细1m胞g/
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鸡
鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白 质的抗体具有独特的优点。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可 保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏 条件下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和 单价的Fab或Fab′等片段。
机体再次接触相同的抗原时，体内产生抗体 的过程称为再次应答或回忆应答(anamnestic response)，主要特点为： ①潜伏期显著缩短，约为初次应答潜伏期的 一半； ②抗体含量大幅度上升，比初次应答多几倍 到几十倍，而且维持时间长； ③诱发再次应答所需的抗原剂量极小； ④再次应答产生的抗体主要为 IgG，而 IgM 很少，抗体的平均亲和精品课力件 高。如果再次应答
• 免疫次数：根据抗体效价要求确定（抗血 清滴度测定）
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免疫应答
机体免疫系统受到抗原刺激后，免疫细胞发生一系列变化，并产生一定 免疫效应的过程。
(一) 感应阶段(inductive stage) 称致敏阶段(sensitization stage)， 是抗原物质进入体内，抗原递呈细胞(APC)对其识别、捕获、加工处理和 递呈，以及抗原特异性淋巴细胞(T 细胞和 B 细胞)对抗原的识别阶段。 ( 二) 增生分化阶段(proliferative and differentiative stage) 又 称反应阶段(reactive stage)，是抗原特异性淋巴细胞识别抗原后活化， 进行增殖与分化，以及产生效应性淋巴细胞和效应分子的过程。T 细胞 增殖分化为淋巴母细胞，最终成为效应 T 细胞(或称致敏 T 细胞)，并 产生多种细胞因子；B 细胞增殖分化为浆细胞，合成并分泌抗体。一部 分 T、B 淋巴细胞在分化过程中成为记忆细胞(Bm 和 Tm)。在此阶段， 有多种细胞间的协作和多种细胞因子的参加。 (三) 效应阶段(effective stage) 此阶段是由活化的效应细胞(CTL 与 TD 或 TDTH)和效应分子(抗体与细胞因子)发挥细胞免疫效应和体液免疫 效应的过程。这些效应细胞和效应分子共同作用清除抗原异物。
多克隆抗体制备
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多克隆抗体的制备方法
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动物选择
一、选择制备多克隆抗体(抗血清)的动物种 类应考虑的要点: •需要制备的抗血清的质量; •供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种 系关系; •免疫动物产生的抗体特性（针对不同性质的 免疫原选用相应的动物）。
二、动物的年龄、性别和数量对抗体制备的 影响
只，小动物产约生0抗.体1～。使0.无6免mg疫/原只性。物如质变无成免有疫效的佐 剂可适当提免（高疫6）免原改；疫变剂抗体量的（产1生0类-2型0以倍及）产。生迟发
• 乳化：一般型抗变原态反与应免，疫并使佐其剂增体强。积比1:1混合。
首次免疫采用完全佐剂，加强免疫采用不
完全佐剂。
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免疫方式
• 注射途径：免疫注射的途径也很重要。一 般采用多点注射，一只动物注射总数约为 8～10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背 部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮 内易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价 有利
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免疫方式
• 间隔与免疫时间：第一次免疫后，因动物 机体正处于识别抗原和b细胞增殖阶段，如 很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫 抑制。一般以间隔10～20天为好。二次以 后每次的间隔一般为7～10天，不能太长， 以防刺激变弱，抗体效价不高。
血液采集
采血量底静脉
中量
耳中央动脉，颈动/静 脉，心脏
大量
股动脉，颈动脉，心 脏，摘眼球
血清的分离：采取4℃静置过夜，3000-4000 转离心10-15min钟。
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多克隆抗体纯化
•蛋白A亲和层析 蛋白A可与多种哺乳动物的IgG重链的Fc片段 相结合也可与某些IgM和IgA相结合
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家兔
家兔是最适合制备抗体的动物。 •其体型适中,成年体重为2～6kg,一次采血量 可达25～50ml,全放血量则达100～180ml; •性格驯顺,易于操作和采血; •寿命相对较长,为5～8年; •能生产足够量的高效价和高亲和力的抗血清； •通常适用于制备抗啮齿类和人蛋白质的抗体； •家兔仅一型IgG而无亚型。用家兔的IgG很容 易制备Fc、Fab和F(ab′)2等片段
•抗原亲和纯化 多抗的亲和层析是基于抗原与抗体结合的一 种层析方式。基本思路是将抗原固定在一种 基质上，然后与抗血清孵育以捕获相应的抗 体，然后从基质上洗掉非特异性结合的抗体， 最后再将抗体洗脱下来
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初次应答(primary response)
机体初次接受适量的抗原刺激后，引起体内抗体产生的过程 称为初次应答，主要特点为：
①机体初次接触抗原后，需经一定的潜伏期血清中才能出现 抗体，潜伏期的长短取决于抗原的性质、抗原进入机体的途 径、所用的佐剂类型、受体情况等，潜伏期之后为抗体的对 数上升期，抗体含量直线上升，然后为持续期，抗体产生和 排出相对平衡，最后为下降期；