钆喷酸葡胺脂质体的制备与研究
枸橼酸托法替尼脂质体的制备与初步
第２２卷第１期２０２３年１月杭州师范大学学报（自然科学版）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨａｎｇｚｈｏｕＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．２２Ｎｏ．１Ｊａｎ．２０２３收稿日期：２０２２ ０６ １７ 修回日期：２０２２ １０ １９基金项目：浙江省卫生健康科技计划青年人才项目（２０２２ＲＣ２４１）；２０２２年杭州师范大学“星光计划”项目；杭州师范大学２０２２—２０２３学年“本科生创新能力提升工程”项目．通信作者：沈奇英（１９８１—），女，副教授，主要从事纳米给药系统研究．Ｅ ｍａｉｌ：ｑｙｓｈｅｎ７１８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ犱狅犻：１０．１９９２６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ．１６７４ ２３２Ｘ．２０２３．０１．００４枸橼酸托法替尼脂质体的制备与初步评价钱洋伟，舒 幻，方宇镱，沈奇英（杭州师范大学药学院，浙江杭州３１１１２１）摘 要：枸橼酸托法替尼（ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂｃｉｔｒａｔｅ，ＴＯＦ）能够对中至重度活动性类风湿性关节炎（ＲｈｅｕｍａｔｏｉｄＡｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）产生较好的疗效，但因缺乏靶向性而易产生胃肠道等不良反应．为了增加其靶向性，减少不良反应，实验通过ｐＨ梯度法制备ＴＯＦ脂质体，以包封率为评价指标，通过单因素法探究包封率的影响因素，确定优势处方．由体外释放结果可知，ＴＯＦ脂质体在正常生理条件下的释药速度较慢．细胞活性实验结果表明，空白脂质体对巨噬细胞的活性几乎无影响．荧光成像实验结果可知，脂质体组关节部位的荧光强度明显强于游离组，说明脂质体可以增加药物在ＲＡ部位的富集，有利于药物靶向治疗ＲＡ．初步药效学结果显示，ＴＯＦ脂质体能够更好地减轻ＲＡ足掌肿胀．综上所述，ＴＯＦ脂质体具有良好的生物相容性和炎性关节部位的靶向性且抗ＲＡ效果良好．关键词：枸橼酸托法替尼；脂质体；包封率；制备；评价中图分类号：Ｒ９４ 文献标志码：Ａ文章编号：１６７４ ２３２Ｘ（２０２３）０１ ００２２ ０６０ 引言类风湿性关节炎（ＲｈｅｕｍａｔｏｉｄＡｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）是一种全身性的自身免疫性疾病，具有病因不明、持续反复发作的特点［１ ３］，严重影响患者的运动和生活质量．ＲＡ高发于３０～５０岁，全球发病率为１％，我国发病率约３％～５％［４ ５］．目前临床上治疗ＲＡ以药物治疗为主，在降低全身及局部炎症水平、缓解症状、延缓疾病进展等方面取得了一定效果，但仍有患者无应答，或因发生不良反应而不能应用［６］．枸橼酸托法替尼（ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂｃｉｔｒａｔｅ，ＴＯＦ）适用于中至重度的活动性ＲＡ患者［７］．目前ＴＯＦ的上市剂型为片剂，缺乏病变部位的特异性靶向作用，导致用药后往往出现胃肠道反应、上呼吸道感染等不良反应，因而有必要改变其剂型以弥补以上缺点．脂质体制备方法简单，生物相容性好．因此，我们将ＴＯＦ制成脂质体，一方面解决了ＴＯＦ口服带来的不良反应，另一方面提高了ＴＯＦ靶向ＲＡ病变部位的能力，有利于ＲＡ的药物靶向治疗．Copyright ©博看网. All Rights Reserved.１ 实验材料与仪器１．１ 实验材料枸橼酸托法替尼（上海博氏医药科技有限公司），磷脂（ＬｉｐｏｉｄＧＭＢＨ），胆固醇（国药集团化学试剂有限公司），ＤＭＥＭ高糖培养液（杭州启真湖生物科技有限公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），弗氏完全佐剂（Ｓｉｇｍａ），噻唑蓝溴化四唑（阿拉丁）．１．２ 实验仪器旋转蒸发仪（ＲＥ ５２ＡＡ，上海亚容生化仪器厂），Ａｎｔｏｎｐａａｒｌｉｔｅｓｉｚｅｒ５００型Ｚｅｔａ电位粒径分析仪（奥地利安东帕中国有限公司），全自动酶标仪（ＢｉｏｔｅｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，美国伯腾仪器有限公司北京代表处），透射电子显微镜ＴＥＭ（ＪＥＭ２１００，日本电子株式会社），高效液相色谱仪（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏ ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）．２ ＴＯＦ脂质体的工艺研究与评价２．１ 犜犗犉脂质体的工艺研究ＨＰＬＣ色谱条件：色谱柱为Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ（钻石）Ｃ１８（２００ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）柱；流动相为乙腈 水（体积比为３０∶７０）；流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长为２８５ｎｍ；柱温为２５℃；进样量为２０μＬ．选用ｐＨ梯度法制备载药脂质体．首先采用薄膜分散法制备空白脂质体，在茄形瓶中放置一定比例的卵磷脂和胆固醇，加入适量无水乙醇溶解，经旋蒸形成薄膜，加入ｐＨ３．５柠檬酸柠檬酸盐缓冲液水化，冰浴下探头超声２０ｍｉｎ（６００Ｗ，工作３ｓ／间隔３ｓ），得到空白脂质体．然后用Ｎａ２ＣＯ３溶液调至一定ｐＨ后加入ＴＯＦ溶液，于６０℃水浴中孵育１０ｍｉｎ，得到ＴＯＦ脂质体（ＴＯＦＬ）．在单因素的基础下，探究药脂比、膜材比、外水相ｐＨ对ＴＯＦＬ的包封率的影响，采用ＨＰＬＣ法测定药物峰面积，从而筛选优势处方．包封率与载药量计算公式如下：ＥＥ％＝（１－犃超滤后犃超滤前）×１００％ＬＥ％＝包封于脂质体内的药物量脂质材料总质量×１００％其中犃超滤前：超滤前超滤管内管液体的峰面积；犃超滤后：超滤后滤下的液体的峰面积．２．２ 犜犗犉脂质体的评价２．２．１ 粒径分布及其电位、电镜按优势处方制备ＴＯＦＬ，使用电位粒径分析仪测定其粒径、多分散性指数和Ｚｅｔａ电位；取少量脂质体滴于覆有碳膜的铜网上，滤纸吸干后，再用醋酸双氧铀负染３０ｓ，自然晾干后于透射电镜下观察其形貌特征．２．２．２ 体外释放根据优势处方制备ＴＯＦＬ，采用透析袋法评价该脂质体的体外释药性能．释放条件：释放介质ｐＨ７．４和ｐＨ５．５的磷酸盐缓冲液（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ，ＰＢＳ），温度（３７±０．５）℃，速度１００ｒ／ｍｉｎ．在预定时间取样，取样量为１ｍＬ，每次取样后补充等量新鲜释放介质，样品离心后取上清进样，采用ＨＰＬＣ法测定，并记录峰面积（犃），计算实际浓度（犆），计算累计释放百分率．２．２．３ 细胞活性评价巨噬细胞（ＲＡＷ２６４．７）培养在含有体积分数１０％的胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基中（含青霉素、链霉素质量浓度各为０．１ｍｇ／ｍＬ），孵育条件为３７℃，体积分数为５％ＣＯ２．采用四甲基偶氮唑蓝（ＭｅｔｈｙｌＴｈｉａｚｏｌｙｌＴｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ＭＴＴ）法检测细胞活性［８］．将对数生长期的ＲＡＷ２６４．７细胞以５０００每孔的密度接种于９６孔板上，孵育过夜贴壁，不同浓度空白脂质体处理４８ｈ后，３２ 第１期钱洋伟，等：枸橼酸托法替尼脂质体的制备与初步评价Copyright ©博看网. All Rights Reserved.于各孔内加入质量浓度为５ｍｇ／ｍＬ的ＭＴＴ３３μＬ并放置于培养箱内继续培养４ｈ后倒出孔内液体，每孔内分别加入２００μＬ二甲亚砜（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ），采用酶标仪在５７０ｎｍ处测量各孔吸光度，并计算细胞存活率．２．２．４ ＲＡ部位初步靶向性考察为了较直观地观察脂质体在ＲＡ小鼠关节部位的分布情况，选用整体器官荧光成像方法进行评价．以ＩＣＲ小鼠为实验对象，将０．１ｍＬ弗氏完全佐剂皮下注射至小鼠右后爪中，构建类风湿关节炎小鼠模型［９］．以近红外荧光染料吲哚菁绿（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅｇｒｅｅｎ，ＩＣＧ）替代ＴＯＦ制备脂质体，设立游离ＩＣＧ和ＩＣＧ脂质体组，经尾静脉注射６ｈ后处死（ＩＣＧ剂量为１ｍｇ／ｋｇ），收集其关节，比较不同制剂给药后关节处的荧光强度．２．２．５ 小鼠体内初步药效学评价将１５只ＲＡ小鼠随机分成３组，每组５只，设立ＰＢＳ组、游离ＴＯＦ组、ＴＯＦＬ组，经小鼠尾静脉注射给药（ＴＯＦ剂量为１．８ｍｇ／ｋｇ），每２天给药１次，连续给药７次，并以正常组为对照．治疗结束后，采用游标卡尺测量各组后爪足掌的厚度，评估其肿胀程度，以初步评价治疗效果．３ 结果３．１ 膜材比对包封率的影响图１ 膜材比对包封率的影响犉犻犵．１ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犿犲犿犫狉犪狀犲犿犪狋犲狉犻犪犾狉犪狋犻狅狅狀犈犈 膜材比（卵磷脂∶胆固醇）对包封率影响如图１所示，由图可知，当膜材比为１∶１和２∶１时包封率相对较高，达到５０％以上，膜材比为２∶１时的载药量比１∶１时高，且膜材比１∶１时旋蒸成膜后极难振荡脱落，细胞粉碎机超声脂质体几乎没有乳光，且外观形态较差，所以选择卵磷脂∶胆固醇比为２∶１作为最优膜材比．３．２ 外水相狆犎对包封率的影响外水相对包封率的影响结果见图２，由图可看出，在外水相ｐＨ为８时有较高包封率达到７５．７８％．所以选择外水相ｐＨ为８作为最优外水相ｐＨ．图２ 外水相狆犎对托法替尼脂质体包封率的影响犉犻犵．２ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犲狓狋犲狉犻狅狉狆犎狅狀犈犈狅犳犜犗犉犔图３ 药脂比对包封率的影响犉犻犵．３ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犱狉狌犵狋狅犾犻狆犻犱狉犪狋犻狅狅狀犈犈３．３ 药脂比对包封率的影响药脂比对包封率影响结果如图３所示，可见在ＴＯＦ∶ＳＰＣ比例为４∶１００时有较高包封率达到８８．４０％，所以选择药脂比为４∶１００作为最优药脂比．综上所述，我们得出的最优条件为：脂质体的内水相为柠檬酸 柠檬酸钠水溶液（ｐＨ３．５）时，药物与磷脂的质量比为４∶１００，胆固醇与磷脂质量比为１∶２，外水相用Ｎａ２ＣＯ３最终调至ｐＨ８．０．４２杭州师范大学学报（自然科学版）２０２３年 Copyright ©博看网. All Rights Reserved.３．４ 粒径分布电位、电镜脂质体粒径分布图及透射电子显微镜下的结果见图４．由粒径分布图（图４Ａ）可知，ＴＯＦ脂质体的平均粒径５６ｎｍ，多分散指数２０．１％，说明脂质体粒径分布均匀．由透射电镜图４Ｂ可见ＴＯＦ脂质体粒径５０ｎｍ左右，外观接近球形，分布较为均匀，与粒径分布结果相吻合．图４ 托法替尼脂质体的粒径分布图（犃）及电镜图（犅）犉犻犵．４ （犃）犜犺犲狊犻狕犲犱犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀犪狀犱（犅）犜犈犕狅犳犜犗犉犔３．５ 体外释放ＴＯＦ的累积释放百分率如图５所示，由实验结果可知，托法替尼在ｐＨ５．５ＰＢＳ中释放速度较快，可见ＴＯＦ脂质体更倾向于在较低ｐＨ值下释药．ＴＯＦ脂质体在生理条件下显示出一定的缓释效果，有利于其在体循环中保持相对稳定，靶向至弱酸性的ＲＡ部位再释药．图５ 托法替尼脂质体在狆犎７．４和狆犎５．５磷酸盐缓冲液中的累积释放百分率犉犻犵．５ 犆狌犿狌犾犪狋犻狏犲狆犲狉犮犲狀狋犪犵犲狅犳犜犗犉犔狉犲犾犲犪狊犲犱犻狀犘犅犛狆犎７．４犪狀犱狆犎５．５图６ 不同浓度空白脂质体对犚犃犠２６４．７细胞作用４８犺后的细胞活性犉犻犵．６ 犆犲犾犾犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳犚犃犠２６４．７狋狉犲犪狋犲犱狑犻狋犺犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊狅犳犫犾犪狀犽犾犻狆狅狊狅犿犲狊犳狅狉４８犺３．６ 细胞活性评价ＭＴＴ实验结果如图６所示，由结果可知，空白脂质体在质量浓度不超过５００μｇ／ｍＬ条件下，细胞活性接近９０％，说明空白脂质体对细胞活性基本无影响，毒性小，有利于利用其来载药．３．７ 犚犃部位初步靶向性考察图７ 犚犃小鼠分别注射游离吲哚菁绿、吲哚菁绿脂质体６犺离体关节荧光分布图片犉犻犵．７ 犉犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犱犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀狅犳犻狊狅犾犪狋犲犱犼狅犻狀狋狊狅犳犚犃犿犻犮犲６犺犪犳狋犲狉犻狀犼犲犮狋犻狅狀狅犳犐犆犌狅狉犐犆犌犔 采用整体器官荧光成像方法初步考察游离ＩＣＧ（ＦｒｅｅＩＣＧ）和ＩＣＧ脂质体（ＩＣＧＬ）在ＲＡ部位的靶向分布，实验结果如图７所示，在给药６ｈ时，与ＦｒｅｅＩＣＧ比较，ＩＣＧＬ组小鼠ＲＡ关节部位的荧光信号更强，说明经脂质体载药后可以增加药物在ＲＡ部位的富集，有利于ＲＡ的药物靶向治疗．３．８ 小鼠体内初步药效学评价治疗结束后，各组小鼠足掌厚度情况如图８所示．由图８可知，与正常组相比，ＰＢＳ模型组的５２ 第１期钱洋伟，等：枸橼酸托法替尼脂质体的制备与初步评价Copyright ©博看网. All Rights Reserved.足掌厚度显著增加；与ＰＢＳ模型组相比，经ＦｒｅｅＴＯＦ和ＴＯＦＬ治疗后小鼠的足掌厚度有不同程度减少，尤其是ＴＯＦＬ组的减少程度更明显．这可能是ＴＯＦＬ被动靶向至ＲＡ部位后，在炎性关节部位释放ＴＯＦ实现其靶向治疗，因此显示出比ＦｒｅｅＴＯＦ更好的缓解足掌肿胀的效果．图８ 治疗结束后各组小鼠的足掌厚度（ 犘＜０．０１， 犘＜０．０５）犉犻犵．８ 犘犪狑狋犺犻犮犽狀犲狊狊狅犳犿犻犮犲犻狀犲犪犮犺犵狉狅狌狆犪犳狋犲狉狋狉犲犪狋犿犲狀狋４ 讨论ＲＡ引起关节肿胀、多关节受累、关节畸形以及关节周围和全身的骨质疏松等病状，严重影响患者生活质量和运动能力．ＲＡ发病机制较为复杂，世界卫生组织将ＲＡ列为疑难症之一．目前临床上ＲＡ治疗的药物有改变病情药、糖皮质激素和非甾体抗炎药，主要用于控制ＲＡ的进展［１０］．与传统抗ＲＡ药物相比，ＴＯＦ不仅能够缓解症状，还能缓解或直接停止ＲＡ的损害．但是，口服ＴＯＦ治疗ＲＡ的患者大多出现胃肠道反应，易引起上呼吸道感染等不良反应，因而有必要改变其剂型以弥补以上缺点．基于纳米技术和医学交叉研究的纳米医学近年来迅猛发展，为重大疾病的诊疗提供了新的机遇［１１］．研究表明，纳米微粒在类风湿性关节炎的诊断、预防及治疗等方面具有一定优势［１２］．类风湿关节炎发生部位具有类似肿瘤血管的ＥＰＲ效应，且血管新生伴随着ＲＡ的整个病程［１２ １３］．这些病理特征为纳米微粒系统被动靶向ＲＡ病变部位提供了可能性．用于药物递送的纳米载体种类繁多，其中脂质体是纳米制剂中一种常用载体，自莱门等人［１４］在１９７１年开始将脂质体用作药物载体以来，该载体系统得到了广泛的研究与应用．实验采用ｐＨ梯度法制备ＴＯＦ脂质体，并采用单因素法筛选出ＴＯＦ脂质体的优势处方．体外释放实验表明，ＴＯＦ脂质体在ｐＨ７．４ＰＢＳ释放介质中具有一定的缓释作用，有利于将药物递送至ＲＡ部位再释放药物．细胞活性实验可看出，空白脂质体在实验浓度范围内对细胞活性几乎没有影响，有利于作为载体进行给药．由整体器官荧光成像结果可知，ＩＣＧ脂质体组小鼠ＲＡ部位的荧光信号显著强于游离ＩＣＧ组，说明脂质体可以增加药物在ＲＡ部位的富集．初步药效研究表明，与ＦｒｅｅＴＯＦ相比，ＴＯＦＬ减少足掌厚度的能力更强，可能是ＴＯＦＬ具有靶向治疗ＲＡ的作用，因此显示出更好的抗ＲＡ效果．综上所述，优势处方制得的ＴＯＦＬ能较好减轻ＲＡ小鼠的足掌肿胀程度．参考文献：［１］ＭＡＧＹＡＲＩＬ，ＶＡＲＳＺＥＧＩＤ，ＫＯＶＥＳＤＩＥ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓａｎｄｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｎｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ，２０１４，５（４）：５１６ ５３６．［２］ＴＡＮＡＫＡＹ，ＯＨＩＲＡＴ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔａｒｇｅｔｓｆｏｒｂｏｎｅｄａｍａｇｅｉｎｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ｉｎｐａｒｔｉｃｕｌａｒｔｈｅＲＡＮＫ ＲＡＮＫＬｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１８，４０：１１０ １１９．［３］池里群，周彬，高文远，等．治疗类风湿性关节炎常用药物的研究进展［Ｊ］．中国中药杂志，２０１４，３９（１５）：２８５１ ２８５８．［４］黄淑晖，刘淮．妊娠合并类风湿性关节炎的药物治疗研究进展［Ｊ］．中国妇幼保健，２０１７，３２（９）：２０４１ ２０４４．［５］常晓天，郑亚冰．类风湿性关节炎瓜氨酸化反应研究的最新进展［Ｊ］．中国免疫学杂志，２０１６，３２（２）：２７９ ２８３．［６］ＫＬＡＲＥＳＫＯＧＬ，ＣＡＴＲＩＮＡＡＩ，ＰＡＧＥＴＳ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ［Ｊ］．ＴｈｅＬａｎｃｅｔ，２００９，３７３（９６６４）：６５９ ６７２．［７］ＭＩＴＲＡＧＯＴＲＩＳ，ＹＯＯＪＷ．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇｍｉｃｒｏ ａｎｄｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒｔｒｅａｔｉｎｇｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ［Ｊ］．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＰｈａｒｍａｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，３４（１１）：１８８７ １８９７．６２杭州师范大学学报（自然科学版）２０２３年 Copyright ©博看网. All Rights Reserved.［８］张新波，朱红升，姜启凤．ＭＴＴ法检测促肝细胞生长素注射液生物活性的研究［Ｊ］．中国医学创新，２０１０，７（１７）：１６０ １６１．［９］ＦＵＪ，ＬＹＵＸＹ，ＱＩＵＬＹ．Ｔｈｅｒｍｏ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｔｒｉｂｌｏｃｋｃｏｐｏｌｙｍｅｒｍｉｃｅｌｌｅｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＰＥＧ６０００ｆｏｒｅｉｔｈｅｒｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅｏｒｗａｔｅｒ ｉｎｓｏｌｕｂｌｅｄｒｕｇｓｕｓｔａｉｎｅｄｒｅｌｅａｓｅａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．ＲＳＣＡｄｖａｎｃｅｓ，２０１５，５（４７）：３７４５１ ３７４６１．［１０］ＪＡＹＡＳＨＲＥＥＳ，ＮＩＲＥＫＳＨＡＮＡＫ，ＧＵＨＡＧ，ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓｉｎｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ａｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１８，１０２：８９４ ９１１．［１１］ＰＲＡＳＡＤＬＫ，Ｏ ＭＡＲＹＨ，ＣＵＩＺＲ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅｄｅｌｉｖｅｒｓｐｒｏｍｉｓｉｎｇｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｆｏｒｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，１０（１３）：２０６３ ２０７４．［１２］ＣＨＵＡＮＧＳＹ，ＬＩＮＣＨ，ＨＵＡＮＧＴＨ，ｅｔａｌ．Ｌｉｐｉｄ ｂａｓｅｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｄｅｌｉｖｅｒｙａｐｐｒｏａｃｈｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１８，８（１）：４２．［１３］ＳＥＩＤＩＫ，ＮＥＵＢＡＵＥＲＨＡ，ＭＯＲＩＧＧＬＲ，ｅｔａｌ．Ｔｕｍｏｒｔａｒｇｅｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｎａｎｏｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，２０１８，２７５：１４２ １６１．［１４］ＢＵＤＡＩＭ，ＳＺ?ＧＹＩＭ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓａｓｄｒｕｇｃａｒｒｉｅｒｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｌｉｐｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａＨｕｎｇａｒｉｃａ，２００１，７１（１）：１１４ １１８．犘狉犲狆犪狉犪狋犻狅狀犪狀犱犈狏犪犾狌犪狋犻狅狀狅犳犜狅犳犪犮犻狋犻狀犻犫犆犻狋狉犪狋犲 犫犪狊犲犱犔犻狆狅狊狅犿犲狊ＱＩＡＮＹａｎｇｗｅｉ，ＳＨＵＨｕａｎ，ＦＡＮＧＹｕｙｉ，ＳＨＥＮＱｉｙｉｎｇ（ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＨａｎｇｚｈｏｕＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１１１２１，Ｃｈｉｎａ）犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂｃｉｔｒａｔｅ（ＴＯＦ）ｈａｓａｇｏｏｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｎｍｏｄｅｒａｔｅ ｔｏ ｓｅｖｅｒｅａｃｔｉｖｅＲｈｅｕｍａｔｏｉｄＡｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＲＡ），ｂｕｔｉｔｉｓｅａｓｙｔｏｐｒｏｄｕｃｅｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｎｄｏｔｈｅｒａｄｖｅｒｓｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｄｕｅｔｏｌａｃｋｏｆｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｉｎｃｒｅａｓｅｉｔｓｔａｒｇｅｔｉｎｇａｂｉｌｉｔｙａｎｄｒｅｄｕｃｅａｄｖｅｒｓｅｒｅａｃｔｉｏｎｓ，ＴＯＦｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ＴＯＦＬ）ｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｐＨｇｒａｄｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．Ｗｉｔｈｔｈｅｅｎｔｒａｐｍｅｎｔｒａｔｅａｓｔｈｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ，ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓｏｆｔｈｅｅｎｔｒａｐｍｅｎｔｒａｔｅｗｅｒｅｅｘｐｌｏｒｅｄｂｙｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｓｕｐｅｒｉｏｒｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｆｒｏｍｔｈｅｉｎｖｉｔｒｏｒｅｌｅａｓｅｒｅｓｕｌｔｓ，ＴＯＦｌｉｐｏｓｏｍｅｓｈａｄａｃｅｒｔａｉｎｓｕｓｔａｉｎｅｄｒｅｌｅａｓｅｅｆｆｅｃｔｉｎｐＨ７．４ＰＢＳ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＭＴＴｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂｌａｎｋｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ＢＬ）ｈａｄａｌｍｏｓｔｎｏｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＲＡＷ２６４．７ｃｅｌｌｓａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄａｓｄｒｕｇｃａｒｒｉｅｒ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｉｎｊｏｉｎｔｏｆｔｈｅｌｉｐｏｓｏｍｅｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｓｔｒｏｎｇｅｒｔｈａｎｔｈｅｆｒｅｅｇｒｏｕｐ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｌｉｐｏｓｏｍｅｃｏｕｌｄｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｆｄｒｕｇｓｉｎｔｈｅＲＡｓｉｔｅ，ｗｈｉｃｈｗａｓｂｅｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｆｏｒｄｒｕｇｔａｒｇｅｔｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＲＡ．ＴｈｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴＯＦＬｃｏｕｌｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅｐａｗｓｗｅｌｌｉｎｇｏｆＲＡｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｆｒｅｅＴＯＦ．Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ＴＯＦＬｈａｄｇｏｏｄｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，ｔａｒｇｅｔｉｎｇａｔＲＡｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｊｏｉｎｔ，ａｎｄｇｏｏｄａｎｔｉ ＲＡｅｆｆｅｃｔ．犓犲狔狑狅狉犱狊：ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂｃｉｔｒａｔｅ；ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ；ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎｒａｔｅ；ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ７２ 第１期钱洋伟，等：枸橼酸托法替尼脂质体的制备与初步评价Copyright ©博看网. 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阿霉素脂质体制备工艺优化及节拍式给药细胞探讨
第36卷第9期西南大学学报(自然科学版)2014年9月V o l.36 N o.9J o u r n a l o f S o u t h w e s tU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n)S e p. 2014D O I:10.13718/j.c n k i.x d z k.2014.09.009阿霉素脂质体制备工艺优化及节拍式给药细胞探讨①汤军,窦霄云,修芸,赵怡重庆医科大学生命科学研究院,重庆400016摘要:目的:优化阿霉素脂质体处方和制备工艺,利用节拍式低剂量给药化疗方式探讨阿霉素脂质体对HO-8910人卵巢癌细胞的体外杀伤作用.方法:采用硫酸铵梯度法制备脂质体,正交设计优选制备处方;葡聚糖凝胶柱层析法分离含药脂质体与游离药物并测定包封率;考察其体外释放度.以常规给药24h和节拍式低剂量给药144h的形式分别考察阿霉素脂质体㊁阿霉素体外细胞的毒性作用.结果:所得优化处方为:磷脂与胆固醇的质量比为3ʒ1,硫酸铵浓度为155mm o l/L,药物与磷脂的质量比为1ʒ10,孵育温度为60ħ.以优化处方制得的脂质体平均包封率达92.86%;脂质体具有一定的缓释作用.脂质体的细胞毒性实验结果显示,游离阿霉素与阿霉素脂质体I C50值24h分别为0.62μg/m L和0.46μg/m L,144h分别为0.06μg/m L和0.01μg/m L.结论:优化得到的阿霉素脂质体处方工艺简便,包封率高;无论是游离的阿霉素或是阿霉素脂质体,运用节拍式低剂量给药的方式在H0-8910细胞中抑制率都明显优于M T D化疗方式给药,其中脂质体药物节拍式低剂量给药方式对H0-8910细胞的抑制率明显优于游离药物.关键词:阿霉素脂质体;正交设计;节拍式低剂量给药;体外细胞实验中图分类号:Q813文献标志码:A文章编号:16739868(2014)9005706阿霉素(D o x o r u b i c i n,D O X)是临床常用的蒽环类抗恶性肿瘤药,是治疗实体肿瘤最有效的药物之一.与大多数抗肿瘤药物相同,D O X不良反应较多,如心脏毒性㊁骨髓抑制㊁消化道和肾脏毒性等,不仅影响了患者的生存质量,而且使D O X的应用受到限制.节拍式给药(M e t r o n o m i cC h e m o t h e r a p y)是一种低剂量长时间给药的方法.节拍式给药方式的药物总累积量比最大耐受量(M a x i m u m T o l e r a-t e dD o s e,MT D)方式的要少,因此可减少在MT D化疗方案中出现的诸多不良反应[1-2].有文献报道采用降低用药剂量的化疗方式不仅可以减轻抗肿瘤药物的毒性反应,并且在治疗肿瘤的效果方面也优于MT D方式[3-7].脂质体是一种抗癌药物载体,有研究表明,将D O X包入脂质体内可降低其对正常细胞的毒性,同时可增强其杀伤肿瘤细胞的能力.本研究设计将D O X包裹于脂质体中,以包封率为指标,采用正交实验筛选并优化了其处方和制备工艺;将脂质体与节拍式低剂量化疗方式相结合,以HO8910卵巢癌细胞为细胞模型,采用MT T比色法,探讨D O X脂质体和游离D O X水溶液的细胞毒性作用,为临床应用阿霉素提供更多的用药方式.①收稿日期:20130715基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2014A A022209);国家自然科学基金资助项目(81370906).作者简介:汤军(1983),女,重庆渝中人,硕士,主要从事药理生理学研究.2西南大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第36卷1材料与仪器1.1材料阿霉素原料药(浙江海正药业股份有限公司);胆固醇(广州天马精细化工厂);蛋黄卵磷脂(上海国药集团化学试剂有限公司);S e p h a d e xG-50(S i g m a公司);透析袋(MW12000-14000);混合纤维微孔滤膜,孔径为0.45μm(上海市新亚净化器件厂);人卵巢癌细胞HO-8910(重庆医科大学);四甲基偶氮唑盐(S i g-m a公司);胎牛血清(M d g e n i c s公司);R P M I1640(H y c l o n e公司),其余试剂均为分析纯.1.2仪器U V-2102P C紫外分光光度计(日本尤尼可公司);层析柱(重庆医用玻璃厂);S a r t o r i u s B S210S电子天平(德国S a r t o r i u s公司);真空旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);S H B-C循环水多用真空泵(郑州杜甫仪器厂);K Q2200B超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);WH一1型旋涡仪(上海沪西分析仪器厂); p H S-3C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂);生物超净工作台S W-C J-2F D(苏净安泰空气技术有限公司);C O2培养箱(美国H E P A公司);超低温电冰箱MD F192(日本S A N Y O公司);普通光学显微镜B H-2(日本O L YM P U S公司);高速离心机5415D(德国E p p e n d o r f公司);E L X800酶标仪(B I O-T E K公司).2方法与结果2.1硫酸铵梯度法制备阿霉素脂质体采用硫酸铵梯度法制备D O X脂质体[8],蛋黄卵磷脂和胆固醇适量,加至圆底烧瓶中,加入氯仿10m L,40ħ旋转减压蒸发除去氯仿,在瓶壁内形成均匀的脂质薄膜,40ħ真空干燥,12h.加入155mm o l/L硫酸铵缓冲溶液(p H=5.5)将脂膜水化,于60ħ水浴中温育,间歇超声5m i n.取脂质体混悬液10m L置于透析袋中,在磷酸缓冲液(P B S,p H=7.4)2L中进行透析.脂质体囊泡过0.45μm微孔滤膜,形成空白脂质体.在上述空白脂质体中逐滴加入含5m g D O X的溶液,混匀,水浴40ħ孵育20m i n,即得D O X脂质体.2.2光谱分析用磷酸盐缓冲液(P B S,p H=7.4)配制一定体积质量分数的D O X标准品溶液,以P B S为空白对照,在220~600n m波长处进行紫外扫描,根据扫描图谱(图略)所示,D O X在480n m处有最大吸收.另取空白脂质体0.2m L,经T r i t o nX-100破乳后,用甲醇稀释至10m L,在220~600n m范围内进行紫外扫描,根据扫描图谱(图略)可知,空白脂质体在480n m处无吸收,故可确定480n m为D O X的测定波长.2.3标准曲线的绘制精密称取D O X标准品10m g,置于100m L量瓶中,加P B S(p H=7.4)溶解,混匀,即得体积质量分数为100μg/m L的标准储备液.精密吸取上述D O X标准储备液0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0m L,分别加至10m L容量瓶中,P B S缓冲液稀释并定容至10m L刻度,混匀即得体积质量分数为1.0,2.0,5.0, 10.0,20.0,40.0,60.0μg/m L的D O X标准液.以P B S为空白对照,480n m波长处测定以上各溶液的吸光度.以吸光度(A)对D O X浓度(C)进行线型回归,回归方程为A=0.0189C-0.0065r=0.9995结果表明,D O X在1.0~60.0μg/m L范围内线性关系良好.2.4洗脱曲线的绘制采用S e p h a d e xG-50型葡聚糖凝胶柱色谱法分离脂质体和游离药物.取0.5m LD O X脂质体上柱,用P B S洗脱,流速控制在0.3m L/m i n左右,用刻度试管每2m L收集1份,共收集17份,每份分别用10%的T r i t o nX-100破乳后用甲醇稀释至4m L.取空白脂质体0.5m L上柱,收集洗脱液用10%的T r i t o nX-100破乳后用甲醇稀释至4m L作为空白,在上述条件下进行测定,记录吸光度,绘制洗脱曲线(图1).结图1 D O X 脂质体的洗脱曲线果表明脂质体在4m L 处洗脱出柱,至18m L 时已基本洗脱完全,游离药物集中在20~32m L .2.5 包封率的测定精密移取D O X 脂质体混悬液0.5m L 上柱,用P B S 洗脱,分离脂质体和游离药物,收集4m L 至18m L 洗脱液,U V 检测脂质体中药物浓度.按2005年版‘中国药典“[9]中的相关规定,测定包封率.E N =(1-C f/C t )ˑ100%式中E N 为包封率,C f 为游离药物的量,C t 为脂质体悬液中药物的总量.2.6 正交实验因素与水平的设计采用单因素筛选的条件,初步制定D O X 脂质体的制备处方,在此基础上采用四因素三水平L 9(34)的正交设计方案,选择影响脂质体包封率的主要因素:磷脂与胆固醇的质量比(A ),硫酸铵浓度(B ),药物与磷脂的质量比(C ),孵育温度(D ),结果见表1.表1 L 9(34)正交实验因素水平表水 平因 素A 磷脂与胆固醇的质量比B 硫酸铵浓度/(mm o l㊃L -1)C 药物与磷脂的质量比D 孵育温度/ħ12ʒ11251ʒ205023ʒ11551ʒ106034ʒ11751ʒ570采用直观分析法分析,结果表明:各因素对包封率的影响程度为C>B>A>D.最佳组合为C 2B 2A 2D 2,即磷脂与胆固醇的质量比为3ʒ1,硫酸铵浓度为155mm o l /L ,药物与磷脂的质量比为1ʒ10,孵育温度为60ħ,结果见表2.表2 D O X 脂质体正交设计结果实验号因 素A 磷脂与胆固醇的质量比B 硫酸铵浓度/(mm o l㊃L -1)C 药物与磷脂的质量比D 孵育温度/ħ包封率1111183.42122292.33133379.14212386.65223180.16231290.77313276.58321384.69332185.9均值184.982.286.283.1均值285.885.788.386.5均值382.385.278.683.4极差3.473.509.703.37 通过对处方和工艺中各关键因素的验证,最终确定制备D O X 脂质体的最佳处方和工艺流程,其验证结果见表3.3第9期 汤 军,等:阿霉素脂质体制备工艺优化及节拍式给药细胞探讨表3最佳工艺验证包封率N o.12345A v e r a g eE/%E w/%93.2791.2192.5793.6193.6892.862.7D O X脂质体体外释放实验分别取D O X脂质体和其游离药物水溶液5m L,加入长约10c m的透析袋中,两端扎紧后,悬置于盛有50m LP B S(p H=7.4)的具塞锥形瓶中,密塞,于37ħ水浴恒温振荡,定时取外液2.0m L,同时补加等量同温的P B S.参照脂质体包封率测定方法,测定释药介质中药物体积质量分数,并计算累积释药分数Q.从实验结果可知,D O X脂质体在48h内释放完全,而游离药物的水溶液在8h内释放完全.由此表明脂质体形式对D O X起到了较好的缓释作用(图2).图2D O X脂质体与D O X水溶液的平均累积释药量曲线2.8低剂量连续给药细胞初步实验将人卵巢癌HO-8910细胞于含体积分数为10%胎牛血清的R P M I1640完全培养基中,37ħ㊁5% C O2条件下培养.实验时以胰酶消化,制备单细胞悬液,调整细胞体积单位为1.0ˑ105/m L.取指数生长期细胞制成1.0ˑ105/m L细胞悬液,以180μL/孔接种于96孔培养板上,培养24h后分别加入10μL不同体积质量分数的D O X和D O X脂质体药液,使之终体积质量分数分别为1μg/m L,0.1μg/m L, 0.01μg/m L,0.001μg/m L;设立2个对照组,D O X的对照组为加入等量的10μL生理盐水溶液,D O X脂质体的对照组加入10μL空白脂质体溶液.按照A,B,C3种给药方案给予细胞药物.A方案:细胞培养24h后,分别投入不同体积质量分数的游离药物和脂质体药物,24h后测细胞MT T值;B方案:细胞培养24h后,每24h投入不同体积质量分数的游离药物,一共投药6次,144h后测细胞MT T值;C方案:细胞培养24h后,每48h投入不同体积质量分数的脂质体药物,一共投药3次,144h后测细胞MT T值[10].半数抑制浓度(I C50)是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度[11].在MT T法中,就是以对照组吸光度O D值减少一半所需的药物浓度为I C50.公式为l g I C50=X m-I(P-(3-P m-P n)/4),其中X m:l g最大剂量;I:l g最大剂量/相临剂量,P:阳性反应率之和,P m:最大阳性反应率,P n:最小阳性反应率.由表4可知,无论是游离药物还是由脂质体作为载体的药物,用节拍式低剂量给药的化疗方式都优于一次性给药.由表5可知,D O X脂质体的I C50明显低于游离的D O X.表4各组体积质量分数药物对H O-8910的抑制率体积质量分数/(μg㊃m L-1)游离D O X/%24h144hD O X脂质体/%24h144h143.7076.5029.2089.500.136.2064.3037.9091.800.018.2434.1029.2058.900.001-2.441.022.1424.804西南大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第36卷表5 游离D O X 与脂质体D O X I C 50值μg ㊃m L -1 游离阿霉素阿霉素脂质体24h0.620.46144h 0.060.013 讨 论本研究在参考有关文献的基础上[11],采用硫酸铵梯度法制备D O X 脂质体,在单因素实验基础上采用L 9(34)正交设计实验,以包封率为指标,磷脂与胆固醇的质量比㊁硫酸铵浓度㊁药物与磷脂的质量比㊁孵育温度为主要因素,筛选出了制备D O X 脂质体的最佳处方,提高了D O X 脂质体的包封率.所得优化处方为磷脂与胆固醇的质量比为3ʒ1,硫酸铵浓度为155mm o l /L ,药物与磷脂的质量比为1ʒ10,孵育温度为60ħ.以优化处方制得的脂质体平均包封率达92.86%.实验中,笔者以人卵巢癌细胞HO -8910细胞作为细胞模型,分别采用节拍式低剂量或MT D 化疗方式给药,比较D O X 水溶液和D O X 脂质体对肿瘤细胞的细胞毒性作用.结果显示无论是D O X 水溶液或是D O X 脂质体,运用节拍式低剂量给药的方式在H 0-8910细胞中抑制率明显优于MT D 化疗方式给药;D O X 脂质体节拍式低剂量给药方式对H 0-8910细胞抑制率明显优于D O X 水溶液;在节拍式给药方式中,D O X 脂质体使用的剂量为实验MT D 体积质量分数的1/100.脂质体具有一定的缓释作用.脂质体的细胞毒性实验结果显示,游离阿霉素与阿霉素脂质体I C 50值24h 分别为0.62μg /m L 和0.46μg /m L ,144h 分别为0.06μg /m L 和0.01μg /m L .优化得到的阿霉素脂质体处方工艺简便,包封率高;无论是游离的阿霉素或是阿霉素脂质体,运用节拍式低剂量给药的方式在H 0-8910细胞中抑制率都明显优于MT D 化疗方式给药,其中脂质体药物节拍式低剂量给药方式对H 0-8910细胞的抑制率明显优于游离药物.本课题设计的目的是将脂质体与节拍式低剂量化疗方式相结合,从而减少药物对系统的毒副作用,同时通过维持低剂量血药治疗体积质量分数来增加治疗效果.研究结果证实,节拍式低剂量给药方式与脂质体抗癌药物结合能够减少用药剂量,提高疗效.本实验研究方向也许会为今后的癌症治疗提供一种创新的战略,同时也提供了一种新的抗血管生成治疗方式与药剂学T D D S 相结合的思路.参考文献:[1]T U L P U L E A ,G R O O P MA NJ ,S A V I L L E MW ,e t a l .M u l t i c e n t e rT r i a l o fL o w -D o s eP a c l i t a x e l i nP a t i e n t sw i t hA d -v a n c e dA I D S -R e l a t e dK a po s i S a r c o m a [J ].C a n c e r ,2002,95(1):147-154.[2] K L E M E N T G ,B A R U C H E LS ,R A KJ ,e t a l .C o n t i n u o u sL o w -D o s eT h e r a p y w i t h V i n b l a s t i n ea n dV E G F R e c e p t o r -2A n t i b o d y I n d u c e sS u s t a i n e dT u m o rR e g r e s s i o n W i t h o u tO v e r tT o x i c i t y [J ].JC l i n I n v e s t ,2000,105(8):R 15-R 24.[3] B E L L O L ,C A R R A B B A G ,G I U S S A N IC ,e t a l .L o w -D o s e C h e m o t h e r a p y C o m b i n e dw i t ha nA n t i a n g i o g e n i cD r u g R e -d u c e sH u m a nG l i o m aG r o w t h i nV i v o [J ].C a n c e rR e s ,2001,61(20):7501-7506.[4] MA NS ,B O C C IG ,F R A N C I A G ,e t a l .A n t i t u m o r a n dA n t i -A n g i o g e n i cE f f e c t s i n M i c eo fL o w -D o s e (M e t r o n o m i c )C y c l o p h o s p h a m i d eA d m i n i s t e r e dC o n t i n u o u s l y T h r o u g ht h eD r i n k i n g W a t e r [J ].C a n c e rR e s ,2002,62(10):2731-2735.[5] S T O L LBR ,M I G L I O R I N IC ,K A D AM B IA ,e t a l .A M a t h e m a t i c a lM o d e l o f t h eC o n t r i b u t i o no fE n d o t h e l i a l P r o g e n i -t o rC e l l s t oA n g i o g e n e s i s I n t u m o r s :I m p l i c a t i o n s f o rA n t i -A n g i o g e n i cT h e r a p y [J ].B l o o d ,2003,102(7):2555-2561.[6] K E R B E LRS ,K L E M E N T G ,P R I TC HA R DKI ,e t a l .C o n t i n u o u sL o w -D o s eA n t i -A n g i o g e n i c (M e t r o n o m i c )C h e m o -t h e r a p y :f r o mt h eR e s e a r c hL a b o r a t o r y I n t o t h eO n c o l o g y Cl i n i c [J ].A n nO n c o l ,2002,13(1):12-15.[7] HA HN F E L D TP ,F O L KMA NJ ,H L A T K YL .M i n i m i z i n g L o n g -T e r m T u m o r B u r d e n :t h eL o g i c f o rM e t r o n o m i cC h e -m o t h e r a p e u t i cD o s i n g a n d I t sA n t i a n g i o ge n i cB a s i s [J ].JT h e o rB i o l ,2003,220(4):545-554.[8] G R A N T GJ ,B A R O N HO L Z Y ,B O L O T I N E M ,e t a l .A N o v e lL i p o s o m a lB u p i v a c a i n eF o r m u l a t i o nt oP r o d u c eU l -t r a l o n g -A c t i n g A n a l g e s i a [J ].A n e s t h e s i o l o g y ,2004,101(1):133-137.5第9期 汤 军,等:阿霉素脂质体制备工艺优化及节拍式给药细胞探讨6西南大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第36卷[9]中国药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社,2010:110-111.[10]B O C C IG,N I C O L A O U KC,K E R B E LRS.P r o t r a c t e dL o w-D o s eE f f e c t s o nH u m a nE n d o t h e l i a l C e l l P r o l i f e r a t i o n a n dS u r v i v a l i nV i t r oR e v e a l a S e l e c t i v eA n t i a n g i o g e n i cW i n d o wf o rV a r i o u sC h e m o t h e r a p e u t i cD r u g s[J].C a n c e rR e s,2002, 62(23):6938-5943.[11]颜科,胡春梅,潘黎军,等.阿霉素脂质体的制备及对M C F-7/D O X作用的考察[J].重庆医科大学学报,2009,34(3):329-331.S t u d y o nP r e p a r a t i o no fD o x o r u b i c i nL i p o s o m e a n d I t sC y t o t o x i c i t y E v a l u a t i o nw i t hR h y t h m i c a l L o w-D o s a g eA d m i n i s t r a t i o nT A N G J u n, D O U X i a o-y u n, X I U Y u n,Z HA O Y iI n s t i t u t eo f L i f eS c i e n c e,C h o n g q i n g M e d i c a l U n i v e r s i t y,C h o n g q i n g400016,C h i n aA b s t r a c t:O b j e c t i v e:T o o p t i m i z e t h e f o r m u l a a n d p r e p a r a t i o n t e c h n i q u e o f d o x o r u b i c i n l i p o s o m e,a n d t o e-v a l u a t e i t s c y t o t o x i c i t y o nh u m a no v a r i a n c a n c e rHO8910c e l l s i nv i t r ow i t h r h y t h m i c a l l o w-d o s a g e a d m i n-i s t r a t i o n.M e t h o d s:D o x o r u b i c i n l i p o s o m ew a s p r e p a r e db y t h e(N H4)2S O4-g r a d i e n tm e t h o d.T h eo p t i-m u mf o r m a t i o nw a s s e l e c t e db y m e a n so f t h eo r t h o g o n a l d e s i g no f e x p e r i m e n t.T h e i nv i t r od r u g r e l e a s e b e h a v i o r o f l i p o s o m ew a s e v a l u a t e d b y t h e d i a l y s i sm e t h o d.MT Ta s s a y w a s a p p l i e d t o i n v e s t i g a t e t h e c y t o-t o x i c i t y o f d o x o r u b i c i n l i p o s o m e a n d f r e e d o x o r u b i c i nw i t h c o mm o n a d m i n i s t r a t i o n a f t e r24h a n d r h y t h m i-c a l l o w-d o s a g e a d m i n i s t r a t i o na f t e r144ho n HO8910c e l l s.R e s u l t s:T h eo p t i m u mf o r m u l aw a sa s f o l-l o w s:t h e r a t i o o f l e c i t h i n t o c h o l e s t e r o l w a s3ʒ1,(N H4)2S O4c o n c e n t r a t i o nw a s155mm o l/L,d r u gʒl e c-i t h i nw a s1ʒ10,t e m p e r a t u r ew a s60ħ.T h e a v e r a g e e n t r a p m e n t e f f i c i e n c y f o r d o x o r u b i c i nw a s92.86%. T h e r e l e a s e o f l i o s o m ew a s r e l a t i v e l y s l o w.T h e c y t o t o x i c i t y t e s t s h o w e d t h a t I C50o f f r e e d o x o r u b i c i na n d d o x o r u b i c i n l i p o s o m e sw e r e0.62μg/m La n d0.46μg/m Lr e s p e c t i v e l y a t24ha n d0.06μg/m La n d0.01μg/m La t144h.C o n c l u s i o n:T h e s e l e c t e d f o r m u l a t i o n a n d p r e p a r a t i o n t e c h n i q u e o f d o x o r u b i c i n l i p o s o m e i s r e a s o n a b l e i n p r e s c r i p t i o n,p r a c t i c a b l e i n t e c h n i q u e s a n dh i g h i n e n c a p s u l a t i o n e f f i c i e n c y.MT T i n d i c a t e d t h a t t h e i n h i b i t i o n r a t e s o f f r e e d o x o r u b i c i n a n dd o x o r u b i c i n l i p o s o m e sw i t h r h y t h m i c a l l o w-d o s a g e a d m i n-i s t r a t i o nw e r em u c hh i g h e r t h a n t h o s ew i t h MT Dc h e m o t h e r a p y a d m i n i s t r a t i o n,a n d r h y t h m i c a l l o w-d o s-a g e a d m i n i s t r a t i o nh a dm u c hh i g h e r i n h i b i t i o n r a t e f o rHO8910c e l l s t h a n f r e e d r u g.K e y w o r d s:d o x o r u b i c i n l p o s o m e;o r t h o g o n a l d e s i g n;r h y t h m i c a l l o w-d o s a g ea d m i n i s t r a t i o n;i nv i t r oc e l l r e s e a r c h责任编辑夏娟7第9期汤军,等:阿霉素脂质体制备工艺优化及节拍式给药细胞探讨。
透明质酸脂质体制备及释放研究
HEILONGJIANGMEDICINEANDPHARMACYJun.2018，Vol.41 No.3• 47 •透明质酸脂质体制备及释放研究①吕佳书，郭欣,姜思亮，田泽群,杨春荣，苏瑾,胡艳秋，孙维彤(佳木斯大学，黑龙江佳木斯154〇〇7)摘要：目的：制备透明质酸（Hyaluronic acid ，HA )托氟淀脂质体（HA - TFu - Lip )，研究其体外释放规律。
方法：建立药物 含量测定方法, 药模型，探讨其释放行 制。
结果：TFu -L ip 和HA -TFu -L ip 】 缓 放。
结论：获意的HA -TFu - Lip 载体，其体外释药具有一定的缓释性。
关键词：透明质酸； ； ；体外释放中图分类号:Q 591 文献标识码:A 文章编号:1008 -0104(2018)03 -0047 -02N 3 -邻甲苯甲酰基-氟尿嘧陡，即托氟啶(吧- O - toluyl - florouracil ，TFu )，为 5 -氣尿瘤陡(5-£!- orouracil ，5-F u )的前体。
能在体 胺酶(其活性和水平在肿瘤细胞内高于 细胞）的作用下，缓慢释放出5 -F u ，増加 体 衰期的同时，善了 的选择性，提高了抗肿瘤活性，具有良好的市场应用 [1’2]。
但 研究表明TFu 溶解度较低，， 收差，, 用度不高[34]。
选择合适的载体递 提高疗效非常关键。
明质酸（Hyaluronic acid , HA ), —种体内广泛存在的糖胺聚糖，能特异性与细胞表面CD 44受体结 合。
可利用其修饰纳 体 CD 44高表的肿瘤组织和细胞内，提高药物的选择性分布[78]。
)；R E -3000A 转蒸发仪（上海亚荣生化);KQ -400KDB 超声波清洗机(昆山市 仪限公司）紫外分光光度计（U V -2550，Japan ); RCZ -8B 出 （天津 精密 ）；L E -80K 型超高速冷冻离心机（美国Beckman 公 司）；DF -101S 集热式恒温加 （巩义市予 限公司）。
硫酸阿米卡星脂质体的研制及其药效学初步研究.
硫酸 阿 米 卡星传统制剂的主要缺点是生物半衰期短，用量大，且具有耳、’肾 和神经肌肉阻滞等毒副作用，而脂质体剂型能有效延长药物的半衰期，减少用量， 降低毒副作用。本文在研究了有关单一因素对硫酸阿米卡星脂质体包封率和稳定 性的影响的基础上，运用正交设计法优化了脂质体的制备工艺和处方。结果表明， 硫酸阿米卡星脂质体的最佳处方为：磷脂：胆固醇＝１．５：１，药物：（磷脂＋胆固 醇卜１：１５，Ｐ ＢＳ液的ｐＨ值为７．０，脂相二水相＝３：１，以乙醚为有机溶剂，采用逆 相蒸发法制备。在此条件下所制备的脂质体包封率为 ６４．８４５ ，具有较好的稳定性。
英文缩 写
Ｍ ＩＣ
ＬＵＶＳ ＳＵＶＳ Ｍ ＬＶ Ｓ
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擂 略词
英文全名
ｍｅｄｉａｎｌ ｅｔｈａｌｄ ｏｓｅ ｍｉｎｉｍａｌｉ ｎｈｉｂｉｔｉｏｎｃ ｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｍｉｎｉｍａｌｂ ａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｃ ｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
物残 留低的特点。
关键词：硫酸阿米卡星：硫酸阿米卡星脂质体；包封率；药动学；毒理学；抑
菌实验：链球菌病；临床疗效
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
Ｔｈ ｅｍ ａｉ ｎｓ ｈｏｒｔｃｏｍｉｎｇｏ ｆｔｈ ｅｔ ｒａｄｉｔｉｏｎａｌｐ ｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏ ｆａ ｍｉｋａｃｉｎｓｕｌｆａｔｅｉ ｓｉｔ ｓ ｓｈｏｒｔｅ ｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｈ ａｌｆ－ｌｉｆｅ，ｇ ｒｅａｔｃｏ ｎｓｕｍｐｔｉｏｎａ ｎｄｔ ｏｘｉｃｉｔｙｏ ｆｅａ ｒ，ｋｉｄｎｅｙａ ｎｄｎ ｅｕｒａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｌ ｉｐｏｓｏｍａｌａｍ ｉｋａｃｉｎｓｕｌｆａｔｅｃ ａｎｉｍ ｐｒｏｖｅａ ｂｏｖｅ－ｍｅｎｔｉｏｎｅｄｉ ｎｄｅｘ．Ｏ ｎｔｈ ｅｂ ａｓｉｓ ｏｆｅ ｖａｌｕａｔｉｎｇ ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆｓ ｅｖｅｒａｌｆ ａｃｔｏｒｓｏ ｎ ｔｈｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａ ｎｄｓ ｔａｂｉｌｉｔｙ，ｔ ｈｅｏ ｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅ ｓｉｇｎｗ ａｓｕ ｔｉｌｉｚｅｄｔｏ ｏ ｐｔｉｍｉｚｅｔｈ ｅｐ ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄｆ ｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｏ ｆｌｉ ｐｏｓｏｍａｌａｍ ｉｋａｃｉｎｓｕｌｆａｔｅ．Ｔｈｅｒ ｅｓｕｌｔｓｓ ｈｏｗｅｄｔ ｈａｔｔｈ ｅｉｄ ｅａｌｒａ ｔｉｏ ｆｏｒｌｅ ｃｉｔｈｉｎ：ｃｈ ｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｓ １ ．５：１，ｔｈ ｅｒ ａｔｉｏｆ ｏｒａ ｍｉｋａｃｉｎｓｕｌｆａｔｅ：（ ｌｅｃｉｔｈｉｎ＋ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）ｉｓ １：１５ａ ｎｄｐ Ｈｏ ｆＰＢ Ｓｉｓ ７ ．０，ｔｈ ｅｒａ ｔｉｏｆｏ ｒｏｒ ｇａｎｉｃｓｏ ｌｖｅｎｔ：Ｐ ＢＳｉｓ ３ ：１．Ｔｈ ｅｅｎ ｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｉｓ ６ ４．８％，ａｎｄｉｔ ｓｓｔ ａｂｉｌｉｔｙｉ ｓｓａ ｔｉｓｆｙｉｎｇ
【精品】低相对分子质量透明质酸脂质体的制备及透皮性能(精)
低相对分子质量透明质酸脂质体的制备及透皮性能(精)中国组织工程研究与临床康复第 15卷第 3期 2011– 01– 15出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research January 15, 2011 Vol.15, No.3 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH465 1Biological Science and Engineering College, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; 2Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen, Shenzhen 518057, Guangdong Province, ChinaZhang Wen-qiang★ , Master, Biological Science and Engineering College, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen, Shenzhen 518057, Guangdong Province, Chinayywenzi23@Correspondence to: Huang Yue-shan, Doctor, Associate professor, Biological Science and Engineering College, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China Received: 2010-08-07 Accepted: 2010-12-07低相对分子质量透明质酸脂质体的制备及透皮性能★张文强 1,2,黄岳山 1Preparation of low-molecular-weight hyaluronan liposomes and their percutaneous penetration Zhang Wen-qiang1,2, Huang Yue-shan1AbstractBACKGROUND:Hyaluronic acid is a versatile polymer material, in practical applications, due to its large molecular weight,percutaneous absorption effect is not satisfied, the use of liposomes as a carrier can improve its transmission effect, with a goodapplication prospect.OBJECTIVE: To study the percutaneous penetration of the liposomes carrying low-molecular-weight hyaluronic acid.METHODS: Low-molecular-weight hyaluronan liposomes were prepared through thin films. Orthogonal experiment was design,and percutaneous penetration was study by snake slough.RESULTS AND CONCLUSION: The low-molecular-weight hyaluronan liposomes could enwrap more hyaluronic acid when thetemperature is 35 ℃ , the ratio of cholesterol and lecithin is 0.15∶ 1, the ratio of hyaluronic acid and lecithin is 0.03∶ 1, and thepH of hydration medium PBS is 7.5. Hyaluronic acid could penetrate the snake slough more easily when they were enwrapped byliposome, and the percutaneous penetration of hyaluronic acid was improved.Zhang WQ, Huang YS.Preparation of low-molecular-weight hyaluronan liposomes and their percutaneous penetration. ZhongguoZuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(3:465-467.[ ]摘要背景:透明质酸是一种用途广泛的高分子材料,在实际应用中,由于其相对分子质量较大,透皮吸收效果不理想,利用脂质体作为其载体可以改善其传输效果,具有较好的应用前景。
论文范文：氨甲环酸柔性纳米脂质体凝胶的制作和体外释药分析
论文范文：氨甲环酸柔性纳米脂质体凝胶的制作和体外释药分析第一章绪论皮肤色素沉着是临床上皮肤科常见的病症之一，它是由于皮肤受到紫外线照射、炎症刺激等外源性因素和自身疾病引起的内源性因素使大量黑色素非正常聚集于皮肤的不同部位，在皮肤表面呈现出局部颜色变黑，如黑斑息肉综合征、特发性多发性斑状色素沉着、黄褐斑、雀斑、色斑及老年斑等[1]。
皮肤色素沉着类疾病尽管没有疼痛、瘙痒等痛苦，但由于黑色素沉着导致的皮肤肤色不均，进而影响到人们的日常生活。
随着社会的发展，抗色素沉着类疾病引起了人们的关注，从而出现了各式各样祛斑产品和治疗方法[5]。
氨甲环酸(TranexamicAcid，TA)作为一种蛋白酶抑制剂，抑制黑斑部位表皮细胞的机能，改善黑斑部位活性化因子群的活跃状态[6]，抑制黑色素的生产而被应用于治疗色素沉着等病症。
目前临床上使用TA 治疗色素沉着疾病多是口服或静脉注射给药，常引起胃肠道刺激等不良反应[7_8]。
经查阅文献的得知：TA作为经皮给药制剂的主要剂型是膏剂，然而因皮肤角质层这一主要的物理屏障，疗效不显著。
近年来，在新技术和新设备不断发展的情况下，关于经皮给药系统在促进药物透皮吸收的方法方面取得了很大的进步[9]。
微乳[iG]、固体脂质纳米粒[11]、脂质体[12]等新型药物载体可与角皮肤质层具有很高的融合性，从而将药物传递到皮肤内部来克服皮肤角质层屏障的影响。
柔性纳米脂质体(Flexible nano-liposomes，FNL)是在脂质体的类脂材料中加入胆酸钠、脱氧胆酸钠等表面活性剂，使其除具有普通脂质体经皮给药系统的优点如生物利用度高、皮肤亲和力好和安全无毒外，还具有高度的变形性、适宜的亲水性和渗透性[13]。
因此能够高效地穿透比自身小数倍的皮肤孔道。
此外，柔性纳米脂质体的结构类似于生物膜结构，与皮肤角质层具有很高的融合性，可以使药物尽可能多地在皮肤的表皮和真皮层内形成一个药物e库，而发挥其缓释效果，使药物能够在局部病变部位持久地起治疗作用。
磁共振成像造影剂研究新进展
超顺磁性探针：主要包括超顺磁性氧化铁颗粒
（ＳＰｌ０）、超微型超顺磁性氧化铁颗粒（ＵＳＰｌ０）和单晶体氧 化铁颗粒（ＭＩＯＮ）等。ＳＰＩＯ直径４０～４００ ａｍ，由Ｆｅ３ ０４ 和Ｆｅ。０。组成，外包碳氧葡聚搪，其氧化铁核心由若干个 单晶体构成。ＵＳＰＩＯ最大直径不超过３０ ｎｍ。超顺磁性氧 化铁的颗粒大小对其进入网状内皮系统的部位有较大影 响，一般直径较大的ＳＰＩＯ主要为肝、脾的网状内皮系统所 摄入，而ＵＳＰＩＯ颗粒小。主要进入淋巴结组织及骨髓组织 中。Ｍｅｔｚ等（１２’研究结果表明ＳＰＩｏ颗粒的血中清除率太 快，不适合作为标记组织血管特征的探针。而ＵＳＰＩＯ的半 衰期较长（１～３ ｈ）．增强效果明显，适合作为分子探针。 ＵＳＰＩＯ中的Ｆｅｒｕｇｌｏｓｅ Ｃｌａｒｉｓｃａｒ是第１个用于乳腺ＭＲ临 床试验的大分子对比剂。ＭＩＯＮ的核心是单晶氧化铁，直
５．１
超顺磁性氧化铁为典型的微粒对比剂，直径为３０～
５ ０００
ｎｍ的颗粒。从血液中清除主要由肝脏的肝、脾的网
状内皮系统进行。因此可以作为以网状内皮系统为靶器官 的对比剂应用于肝，脾和淋巴结成像＂］。目前使用最多的 Ｆｅｒｕｍｏｘｉｄｅｓ（ＡＭＩ－－２５）（Ｇｕｅｒｂｅｔ生产）就是用葡萄糖包裹 的氧化铁晶体。按微粒的大小可分为超顺磁性氧化铁颗粒 （ＳＰＩＯ）和超小氧化铁颗粒（ＵＳＰＩＯ）。ＳＰＩＯ基本上显示Ｔ２ 效应（信号丢失），ＵＳＰＩＯ则有明确的Ｔ１缩短效应（Ｔ１ｗＩ 上信号强度增加）。此外，ＵＳＰＩＯ化合物在血液中的半衰 期较长（超过３００ ｍｉｎ）。可作为一种血池对比剂。由于该颗 粒大小的物质主要经网状内皮系统清除，因而，静脉注射该 类对比剂进入肝脏及脾脏的网状内皮细胞，产生短Ｔ２效 应，在肝脏库普弗细胞可摄取对比剂颗粒。由于正常肝脏 存在库普弗细胞，而肿瘤内一般无或少含库普弗细胞，因 而，对比剂能够增加肿瘤与肝脏实质之间的对比。从而提高 肝脏肿瘤的检出率。这种新型化合物还可用于组织灌注成 像和ＭＲ血管成像。Ｆｅｒｕｍｏｘｉｄｅｓ是安全的对比剂，无严 重的不良反应。
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【摘要】 本文采用改良逆相蒸发法-膜挤压法相结合将水溶性顺磁性造影剂钆喷酸葡胺制成
小单室脂质体（suv）， 方法 简单、重现性好，显示了可进一步 工业 化的良好前景。激光
散射法测得脂质平均粒径为195nm。4℃避光放置6个月，各项理化指标基本无变化。对制剂
的急性毒性 研究 结果表明，钆喷酸葡胺及钆喷酸葡胺脂质体的ivld50值分别为
8.00mmol/kg和9.56mmol/kg，这提示脂质体可降低药物的毒性。而影像学结果进一步证明了
钆喷酸葡胺脂质体具有靶向性。
【关键词】 钆喷酸葡胺；脂质体；制备研究
research and preparation of liposomal gd-dtpa
1982年由德国先灵（schering ag）公司的威曼等人制备成功的钆喷酸葡胺［（nmg）2-gd-dtpa］
是研究和 应用 最多的造影剂，并在1984年报告了首次应用于人体的结果。由于它能在正常
和病变组织间增加额外对比度，使mri诊断的敏感性和特异性均得以提高，故很快被人们所
接受。钆喷酸葡胺是细胞外离子型造影剂［1］，它主要用于颅脑、脊柱及全身的磁共振成像，
特别是对脑的造影是安全有效的［2～6］。由于它主要通过肾脏快速代谢［1,7］，能与细胞外
空间快速平衡及快速的肾清除，不适用于肝、脾肿瘤的成像［8～10］。在分布上无特殊的靶
器官，或者说它是一种无专一性分布的造影剂。为了提高肝、脾肿瘤的成像效果，使钆喷酸
葡胺具有器官靶向性，可用脂质体作为药物的载体来达到此目的。在这方面的研究国外已有
报道［11～14］，实验证明了包封于脂质体中的钆喷酸葡胺具有肝、脾器官靶向性。本实验以
豆磷脂和胆固醇为成膜材料，制备了钆喷酸葡胺脂质体，并对其体内外稳定性进行了研究，
以期为钆喷酸葡胺脂质体的进一步开发以及将来应用于临床提供实验依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 高速离心机（沈阳理化仪器厂），zetasizer 3000（英国malvern仪器公司），zm-420
透射电镜（philips），ndj79旋转式粘度计（同济大学机电厂），dl302-1电热恒温箱（上海
天淞五金厂）。
1.2 材料 gd2o3（北京有色金属研究院），dtpa（北京福星化工厂），甲葡胺（北京北陆医药
有限公司），精制大豆磷脂（上海油脂一厂），胆固醇（上海生化试剂厂），钆喷酸葡胺注射液
（先灵〈广州〉药业有限公司），生理盐水（双鹤药业），其他试剂均为 分析 纯。
2 方法与结果
2.1 钆喷酸葡胺脂质体的制备 参考 文献 初步拟定以下基础处方［15］：300mg卵磷脂，
75mg胆固醇及0.1%量的ve，制成10ml。
2.1.2 膜挤压法 将上述脂质体混悬液在一定的压力下，依次通过0.8、0.45、0.22μm微孔
滤膜，每次重复6遍，最终得到均匀乳状的钆喷酸葡胺脂质体。
2.2 处方优化 根据单因素考察结果，首先确定缓冲液的离子强度，处方成分为磷脂、胆固
醇、十八胺和药物，把磷脂（pc）用量、胆固醇（chol）用量、十八胺（sa）用量及成膜时
温度（t）作为4个考察因素。选择u10（104）均匀表可得10组处方，利用人工神经 网络 系
统进行处方优化，主要考察指标为脂质体的外观、ke值及沉降体积比f，最终确定最佳处方
为：磷脂250mg，胆固醇50mg，十八胺20mg，药物浓度0.5m，制备成脂质体10ml。
2.3 含量及包封率测定
2.3.1 总药量的测定 氯仿萃取磷脂：精密吸取1ml脂质体，用制剂缓冲液稀释至一定倍数，
取稀释液5ml具带塞试管中，加少许固体氯化钠，加入等量氯仿后置60℃水浴之中3min，强
烈涡流振荡2min，于离心机4000r离心10min，取上清液在吸收波长274nm及320nm分别测
定吸光度值a。根据标准方程：
δa=0.0204c+0.008 计算 总药量。
透析法：此法是最简单的也是最常用的除去未包裹药物的方法，它不需要复杂的技术，也无
须昂贵的仪器，且能够扩大生产。本实验对此方法进行考察，结合紫外法测定了钆喷酸葡胺
脂质体的包封率。测得包封率平均为25.6%。
2.4 粒度分布 将脂质体用水稀释后在激光粒度分析仪上进行测定。结果表明，脂质体平均
粒径为195nm。
2.5 脂质体稳定性的研究
2.5.1 含量及包封率的测定 将钆喷酸葡胺脂质体充n2后密封于安瓿中，于4℃冰箱及25℃
孵箱中避光贮存，分别在1、3、6月取样，测定制剂的含量，并计算贮存过程中的包封率，
结果见tab.1。tab.1 results of stability determination of gd-dtpa containing liposome
under the condition of 4℃ or 25±1℃
2.5.2 外观变化考察 钆喷酸葡胺脂质体4℃放置6个月后，外观未见明显变化，安瓿底部
未见沉聚物，显微镜下观察，粒径略有增大；25℃放置6个月后，外观未见明显变化，微镜
下观察，粒径明显增大，并可见少量聚集。
综上所述，钆喷酸葡胺脂质体在4℃贮存6个月后，制剂的物理和化学稳定性良好，其外观、
含量均变化不大，包封率下降也很低，仅为2%左右，粒径略有增大；而其在25℃贮存6个月
后，制剂发生了一些物理变化，微粒有沉降聚集的现象发生，包封率下降为8%左右，且粒径
明显增大。所以脂质体应在低温（4℃）下避光、密封贮存。
2.6 急性毒性实验
2.6.1 静脉注射给药ld50的测定 取雌雄小鼠50只，随机分成5组，雌雄各半，每组10
只。各组按1：0.8的剂矩，注射钆喷酸葡胺水溶液组的剂量分别为5.1、6.4、8.0、10.0
和12.5mmol/kg，每只鼠一次尾静脉注射0.15ml，注射速度为1ml/min。注射后观察动物中
毒症状，记录一周内动物死亡数，计算出ld50及95%可信限。
同法进行钆喷酸葡胺脂质体静脉注射ld50的测定，剂量分别为6.4、8.0、10.0、12.5和
15.6mmol/kg。
2.6.2 结果 小鼠尾静脉注射钆喷酸葡胺水溶液后，立即出现呼吸急促、腹部急剧起伏、弓
背、下肢伸展等中毒症状，部分小鼠0～3min内即死亡，在以后的1周内，小鼠有食量减少，
排泄物稀、多、粘，精神萎靡等中毒症状。小鼠尾静脉注射钆喷酸葡胺脂质体后，与上述中
毒症状相似。以同样速度注射，死亡时间略有延迟，部分小鼠5 min后中毒死亡。结果见tab.2
和tab.3。由改进寇氏法求得，钆喷酸葡胺水溶液对昆明小鼠的ivld50为8.00mmol/kg
（7.22～8.86mmol/kg）；而钆喷酸葡胺脂质体的ivld50为9.56 mmol/kg（8.43～
10.85mmol/kg）。