氨基酸的纸层析法
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸一、前言1、分离氨基酸的主要方法：(1) 离子交换法，根据氨基酸是两性电解质这一特征,以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值的差异,利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化。
离子交换法的分离步骤主要包括树脂的处理、装柱、平衡、加样、洗脱等步骤. 离子交换法也有自身的局限性，由于离子交换法是利用氨基酸等电点的不同，所以当两个或者多个氨基酸的等电点相近时，便无法分离，另外，氨基酸在树脂当中扩散速度较快，就要求料液的流速也相对较慢，这样自然造成了分离的缓慢，离子交换本身的生产原理也决定了反应难以连续还进行，这给工厂自动化生产带来影响，难以大规模地推广。
(2) 沉淀法，沉淀法是历史最悠久的分离纯化方法，目前仍在工业上发挥着重大的作用。
氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。
沉淀法原理是根据某些氨基酸可以与某些有机或者无机化合物结合而形成沉淀，可以利用这种性质向溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸沉淀，与其他氨基酸分离，在分离后再将氨基酸与沉淀剂分离即可。
现在较为成熟的分离方法有精氨酸与苯甲醛在低温条件下，缩合成溶解度小的苯亚甲基精氨酸，从而析出沉淀，析出的沉淀用盐酸处理即可分离得到目标氨基酸精氨酸的盐酸盐；亮氨酸与邻-二甲苯-4-磺酸反应，可生成亮氨酸的磺酸盐。
沉淀法的优点是方法简单，选择性强，但是缺点同样明显，沉淀剂回收困难，造成废液排放污染加剧。
(3) 萃取法，萃取法主要包括反应萃取法、溶剂萃取法、反向微胶团萃取、液膜萃取法等。
其中，反应萃取法是选择适当的萃取剂，使萃取剂解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应，生成可以溶于有机相的物质，从而使氨基酸从水相进入有机相，进而分离氨基酸。
溶剂萃取法，由于氨基酸是离子型化合物，氨基酸在物理萃取时难以高效提取的，因此常用化学发来萃取氨基酸。
(5) 电透析，由于氨基酸拥有不同的等电点，故可以通过控制溶液的PH值，使氨基酸带有正负电荷，即当PH大于等电点时，带有负电荷，将氨基酸放置在电场中，会带上负电，并且移向正极，相反，PH值小于等电点时，则带上正电荷，氨基酸向负极移动。
氨基酸的分离鉴定纸层析法
氨基酸的分离鉴定纸层析法引言：氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于生物体的正常生理功能至关重要。
因此，准确地分离鉴定氨基酸成分对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
纸层析法是一种简单而有效的分离和鉴定氨基酸的方法。
本文将介绍氨基酸的分离鉴定纸层析法并探讨其应用。
一、纸层析法的原理纸层析法是利用气相平衡原理进行物质分离的一种方法，其原理是根据物质在纸上各组分的相对亲疏性，通过运动距离的差异来分离物质。
在氨基酸的分离鉴定中，纸层析法通过将待测氨基酸溶液滴于纸上，然后将纸立起来，将纸的下端浸入相应的溶剂中，使得溶剂上升，通过毛细作用将氨基酸上提，最终实现氨基酸的分离和鉴定。
二、纸层析法的步骤1. 准备工作：制备纸层析板和显色剂。
2. 样品处理：将待测氨基酸溶解于适量的溶剂中，使其浓度适宜，然后滴于纸层析板上。
3. 运行纸层析：将纸层析板立起，纸的下端浸入相应的溶剂中，待溶剂上升到一定高度后，取出纸层析板。
4. 显色：将纸层析板放置于显色剂中，通过氨基酸与显色剂的反应，使得氨基酸在纸上显色。
5. 结果鉴定：根据显色的位置、颜色和强度等特征，对氨基酸进行鉴定和定量分析。
三、纸层析法的应用1. 氨基酸组成分析：纸层析法可用于分析蛋白质中氨基酸的组成，从而揭示蛋白质的结构和功能。
2. 质量控制：纸层析法可用于对食品、药品等中氨基酸含量的快速检测，保证产品质量和安全性。
3. 生物体内氨基酸代谢研究：纸层析法可用于研究生物体内氨基酸的代谢途径和代谢产物。
四、纸层析法的优缺点纸层析法作为一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法，具有以下优点：1. 简单易行：操作简单，不需要复杂的仪器设备，成本低廉。
2. 分离效果好：对于氨基酸的分离效果较好，可以得到较为准确的结果。
3. 易于观察：通过显色剂的反应，可以直观地观察到氨基酸在纸上的分离和鉴定结果。
然而，纸层析法也存在一些缺点：1. 分离效果有限：对于某些结构相似的氨基酸，纸层析法的分离效果不佳，难以实现准确鉴定。
氨基酸的分离鉴定—纸层析法
（7）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表2。
（8）以层析时间为横坐标，扩展剂上升高度为纵坐标画图，求出扩展剂上升到15cm时所需要的时间。
（3）规划：带上手套，取宽约10cm、高约15cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2～3 cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位），参见下图。
【实验原理】
纸层析法（paper chromatography）通常用于蛋白质的氨基酸成分的定性和定量。1944年A．J．P．马丁第一次用纸层析分析氨基酸，得到很好的分离效果。到现在为止，纸层析法已经成为定性或定量测定多肽，核酸碱基，糖，有机酸，维生素，抗生素等物质的一种最简单易行的分离分析工具。
层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物，可做双向层析。其原理是以滤纸为惰性支持物的分配层析，层析溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，由于分配系数不同，结果物质在两相间不断分配而得到分离。
【注意事项】
⑴.点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)。
⑵.点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性(斑点发黄)。
⑶.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。
⑷.展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。
实验六氨基酸的纸层析法
实验六氨基酸的纸层析法氨基酸是构成蛋白质的最基本的组成成分。
在生物化学和分子生物学实验中，常常需要对氨基酸进行分离和纯化。
纸层析法是一种常用的氨基酸分离和鉴定的方法，它采用纸张作为介质，利用氨基酸的性质在多次不同极性溶剂中的间歇性抽提来完成氨基酸的分离。
下面将介绍具体操作步骤。
一、实验原理氨基酸纸层析法是一种简单而有用的分离和鉴定氨基酸的方法。
其原理是根据氨基酸在不同相对极性的溶剂中的溶解度和色谱行为而进行分离。
实验中用的纸张是具有适当极性特性的滤纸，涂上0.001~0.002mol/L氯乙酸钠作为移动相。
固定相是纸张本身，通常取5×5 cm大小。
标记物一般是用19种常见氨基酸中的一种或混合某些氨基酸，它们分别在不同移动相中有不同的颜色分离性质。
标记物的溶液可以直接在纸上点斑或者先把样品在滤纸上打成碎粒，再加入稍许水均匀混合后点斑。
二、实验步骤1. 实验器材和试剂（1）氯乙酸钠；（2）19种氨基酸标准品；（3）滤纸。
2. 制备移动相将0.001~0.002mol/L氯乙酸钠溶液制备好，备用。
3. 准备试样将要分离的氨基酸标准品用适量的氯乙酸钠溶液稀释，制备出1~2mg/mL的样品，备用。
4. 载纸处理在纸片中央绘制一条垂直线，以绘制者的名字为记。
距离中央线约1cm处，打上精细的刻度线，用微孔钳取少量标样液，在对侧依次在距中央线约1.5cm处打上纸层印。
纸层印就是取少量液体滴到滤纸上产生的斑点。
约300ug/sample。
5. 开始层析在棉花球上，涂上一层氯仿，并立即用焊接器将其挥发掉，然后再涂一遍。
整个过程保持外壳密封状态。
涂的氯仿量要足够，可以完全覆盖整个纸层印，但不能过多。
否则，纸层印上的标样就会扩散到大范围，分辨率就失去了。
将试纸浸泡在移动相中。
移动相上升时，会将固定相上的氨基酸迅速带动并在移动相中逐级输送。
随着移动相液面逐渐提高，固定相的氨基酸成分逐渐被分离开来。
注意事项：（1）加样时，操作应小心、细致，尽可能用毫、微、纳级的物体。
氨基酸纸层析法
氨基酸纸层析法氨基酸纸层析法（paper chromatography of amino acids）是一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法。
本文将详细介绍氨基酸纸层析法的原理、步骤、实验条件和数据处理方法等内容，以帮助读者更好地了解并应用这一实验技术。
一、氨基酸纸层析法的原理氨基酸纸层析法是利用氨基酸在纸上的分布系数和溶剂的渗透速度差异进行分离的方法。
其原理是在一根滤纸条上画上水平的线，将待测的氨基酸溶液直接点于纸条上，待溶液中的氨基酸离子在滤纸上沿渗透液前进，不同氨基酸在滤纸上的迁移速度不同，从而实现氨基酸的分离和测定。
二、氨基酸纸层析法的步骤1. 实验前准备（1）准备氨基酸样品，将其溶解在适当的溶剂中，并使用pH 计调节至适当的酸碱度。
（2）准备滤纸条，按照实验需要确定滤纸的宽度和长度。
（3）准备层析槽，将槽中的溶剂预先与上盖采光纸取代，避免有光照射到。
2. 进行层析实验（1）在滤纸条上绘制水平基线，并将标记的点分开，便于后续氨基酸的测定。
（2）将氨基酸溶液直接点于滤纸条上，点的位置要尽量靠近基线，以避免扩散的影响。
（3）将纸条的一端浸入含有适当溶剂的层析槽中，保持溶剂的面平稳。
（4）待溶液中的氨基酸在滤纸上渗透，不同氨基酸迁移的距离不同，最终在纸条上形成清晰的色斑。
（5）将纸条取出，用热风干燥，然后在紫外灯下进行观察和记录。
3. 数据处理将滤纸上的色斑分别用铅笔勾画出来，并测量它们与基线之间的距离。
然后，根据距离之间的比例关系来计算氨基酸在纸上的迁移速度，并与标准曲线进行比较，从而得出待测氨基酸的浓度。
三、氨基酸纸层析法的实验条件1. 溶剂体系常用的溶剂体系有正丙醇/ 乙酸/水 = 4:1:5、正丙醇/氨水/水 = 70:2:25等，需要根据实验需要确定溶剂的组成和比例。
2. 滤纸条的准备常用的滤纸有菱形滤纸和圆形滤纸，需要根据所需分离的氨基酸种类和数量决定滤纸的大小。
3. 实验条件实验应在干燥、通风的环境中进行，避免光照和温度过高。
实验一纸层析法分离鉴定氨基酸
【三、器材与试剂】
【三、器材与试剂】 器材： 1、层析缸 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿 5、层析滤纸(新华一号) 试剂： 1、扩展剂 （正丁醇：水：冰醋酸= 4：3：1） 2、显色剂 0.1％茚三酮正丁醇溶液。 3、氨基酸溶液 0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液 及它们的混合液
显色： 用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。
计算Rf值
【五、实验结果与分析】
【六、注意事项】
【七、思考题】
1、实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么？ 2、Rf值的含义、影响因素？
下次实验 ： 实验二 蛋白质和氨基酸的颜色反应
值 日 生 值 日
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小实验
当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。 滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。 看看接下来会发生什么事情…
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可以看出1号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。 而4号氨基酸与滤纸的结合最紧，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。
这就是纸色谱法。 对照上图，可知道1-4号的各代表什么氨基酸。 纸色谱法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。
实验一 纸层析法分离鉴定氨基酸
【一、实验目的】
【二、实验原理】
层析技术 是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 可分离物质 糖类、有机酸、氨基酸、核苷等
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固定相 在层析中起分离作用而不随层析过程移动的物质。如纸层析中固定相是滤纸纤维中结合的水。固定相被看成是样品移动的阻力。
氨基酸的分离鉴定纸层析法实验报告
氨基酸的分离鉴定纸层析法实验报告一、实验目的1、掌握纸层析法分离和鉴定氨基酸的基本原理和操作方法。
2、学习如何根据氨基酸在层析纸上的迁移率（Rf 值）来鉴定氨基酸。
二、实验原理纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
滤纸纤维上的羟基具有亲水性，能吸附一层水作为固定相，而有机溶剂作为流动相。
当有机相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相之间进行分配。
由于不同的氨基酸在两相中的分配系数不同，导致它们在滤纸上的迁移率不同，从而实现分离和鉴定。
Rf 值（比移值）是氨基酸在层析中的特征值，计算公式为：Rf ＝溶质移动的距离／溶剂移动的距离。
三、实验材料与仪器1、实验材料标准氨基酸溶液：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸。
混合氨基酸溶液。
展开剂：正丁醇：冰醋酸：水＝ 4:1:5（体积比）。
显色剂：025%茚三酮溶液。
2、实验仪器层析缸。
毛细管。
喷雾器。
烘箱。
直尺。
四、实验步骤1、准备滤纸选用一张大小合适的滤纸，在距底边 2cm 处用铅笔轻轻画一条横线，作为起始线。
2、点样用毛细管分别吸取标准氨基酸溶液和混合氨基酸溶液，在起始线上轻轻点样，每个点的直径不超过 2mm，点样后自然风干。
3、层析将滤纸垂直放入装有展开剂的层析缸中，滤纸下端浸入展开剂约1cm，注意滤纸不要与缸壁接触，盖上盖子，进行层析。
当展开剂前沿上升至距滤纸顶端约 1cm 时，取出滤纸，用铅笔标记展开剂前沿的位置，自然风干。
4、显色用喷雾器将显色剂均匀地喷在滤纸上，放入烘箱中，在 80℃左右烘 5 10 分钟，直至斑点显色清晰。
五、实验结果与分析1、测量并计算 Rf 值用直尺分别测量标准氨基酸和混合氨基酸斑点中心到起始线的距离（a）以及展开剂前沿到起始线的距离（b），计算 Rf 值。
2、结果分析根据计算得到的 Rf 值，对照标准氨基酸的 Rf 值，鉴定混合氨基酸溶液中的成分。
六、注意事项1、点样时要避免毛细管的尖端刺破滤纸，且点样量要适中，过多会导致斑点扩散，影响分离效果。
氨基酸的分离鉴定——纸层析
氨基酸的分离鉴定——纸层析氨基酸是构成蛋白质的基本单元，其在生物体内的作用极为重要。
因此对氨基酸的分离和鉴定具有重要的研究意义。
纸层析是一种常用于分离和鉴定氨基酸的方法。
其原理是利用氨基酸在纸层析板上的运动速度不同，根据氨基酸之间的相互作用，分离出各种氨基酸。
实验步骤：1. 纸层析板的制备将一张高分子量纸，如Whatman No.1滤纸，剪成所需要的大小，并用铅笔在纸上画出氨基酸移行的标线。
2. 氨基酸样品的制备将所需的氨基酸样品溶解在适量的水中，浓度应为0.2-2%。
3. 样品的上样将氨基酸溶液利用微量注射器沿着标线往上移行。
在上样后，将纸层析板放在带有盖子的玻璃罩中，罩中放置一些饱和度为70%的异丙醇-水溶液，保持相对湿度为70%，使其充分展开。
5. 鉴定氨基酸将经过分离的氨基酸溶液阴性反应的氨基酸用二乙酰胺-丙酮混合溶液鉴定。
将0.2ml 二乙酰胺-丙酮混合溶液加入几滴氨基酸样品中，加热60℃-80℃，5分钟。
加入0.1ml氯仿，振荡混合，分离出上清液，上清液加入干燥瓶中，用喷雾器喷洒Ninhydrin试剂，加热于热水中1分钟，在冷水中快速降温附着氨基酸的部位呈现紫色。
注：二乙酰胺-丙酮混合溶液的组成为45%二乙酰胺，45％丙酮和10%水。
6. 结果的解释根据氨基酸在纸层析板上的运动速度和比色反应的颜色，确定样品中的氨基酸种类及含量。
优点：纸层析方法简便易行，无需昂贵的仪器设备，适用于小样品分析，能分离不同种类的氨基酸，并且结果清晰，操作简单。
限制：纸层析分离结果受到氢键作用和酸碱度等因素的影响，需要控制好上样的数量和浓度。
此外，纸层析无法分离胶原氨基酸和类似结构的氨基酸，且鉴定结果在颜色和色谱图谱方面有些模糊。
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实验一氨基酸的纸层析法
一、目的
色层分析法已广泛地用于氨基酸、核酸、激素、维生素、糖类等的分离与分析。
其优点是：能够分离与分析在组成、结构及性质上极为相似的物质；设备简单，操作容易，样品用量少，结果也较准确。
本实验的目的在于掌握纸层析法的一般原理和操作技术。
二、原理
纸层析法是以滤纸作为支持物的分配层析法。
分配层析法是利用物质在两种不同混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的。
通常用@表示分配表示分配系数。
在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数。
α=溶质在静止相的浓度（Cs）/溶质在流动相浓度（CL）
本实验层析溶剂是选用有机溶剂和水组成的。
由于滤纸纤维与水有较强的亲和力（纸上有很多-OH基与水以氢键相连），吸附很多水分，一般达滤纸重的22%左右（其中约有6%的水与纤维素结合成复合物），因此使这部分水扩散作用降低形成静止相。
层析时，将滤纸的亲和力很弱，可以在滤纸的毛细管中自由流动，便形成流动相。
层析时，将滤纸一端浸入层析溶液中。
有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其中的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。
分配过程：一部分溶质随有机相移动离开原点而进入无溶质区，并重新分配，即一部分溶质从有机相又进入水相。
随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配，不断向前移动。
各种物质因其分配系数的不同，在两相间分配系数就不同，分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，移动的速度慢。
所以各种溶质在层析过程中由于移动的速度不同便可以彼此分开。
移动速度一般用移动速率Rf值表示：
Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
各种化合物在恒定条件下，经层析后都有其一定的Rf值，也就是说在层析谱中有一定的位置。
借此可以达到定性、分离、鉴别的目的。
Rf值决定于很多因素，其中最主要的是所分离物质的分配系数。
物质的分配系数是由以下因素决定的：
（1）物质极性的大小。
水的极性很强，一般极性强的物质就容易进入水相，非极性的物质易进入有机溶剂中。
例如侧链含-OH和-NH2、-COOH较多的氨基酸易分配在水相中，Rf 值较小；而含非极性基（如-CH3）较多的物质其分子的极性降低，Rf值增大。
（2）滤纸的质地以及为水分饱和的程度。
滤纸的质地必须均一、纯净、厚薄适当，具有一定的机械强度，层析前应为水和有机溶剂的蒸汽所饱和。
（3）溶剂的纯度、PH值和含水量。
PH值和含水量改变可使氨基酸和层析溶剂极性改变，Rf值也随之改变。
（4）层析的温度和时间。
温度改变使溶剂中有机相含水量改变，Rf值也改变。
当所有条件相同时，层析时间短，则Rf值小。
因此，在层析过程中，对以上影响Rf值的因素必须严格控制。
三、实验材料、仪器和试剂
1．实验材料：在25C温箱中萌发2-3天的绿豆芽。
2．仪器：
（1）恒温水浴1台
（2）烘箱1个
（3）研钵1个
（4）三角瓶1个
（5）蒸发皿1个
（6）50毫升分液漏斗1个
（7）量筒3个
（8）微量吸管（或标有刻度的毛细管）
（9）电热吹风机1个
（10）层析缸及培养皿一套
（11）层析滤纸
（12）小型玻璃喷雾器1个
（13）剪刀、刀片、铅笔、尺子、玻棒、凡士林及点样瓶。
3．试剂：
（1）氨基酸标准溶液：浓度为0.01M，溶于10%异丙醇中。
第一组：天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸。
第二组：鸟氨酸、甘氨酸、r-氨基丁酸、缬氨酸。
第三组：谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸。
第四组：酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、谷氨酰酸。
第五组：胱氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、瓜氨酸、天冬酰胺。
（2）溶剂系统：
第一向：正丁醇：甲醇：水：（15：3：2，体积），摇匀静置备用。
第二向：苯酚：水（80：20，重量）。
配制方法：在分液漏斗中先计量加入少量无离子水，再加入一定量的新新蒸馏的酚，根据酚量补足应加入的全部无离子水，这亲友可避免因酚的冷凝而造成的溶解困难。
充分摇匀后静置备用。
（3）无离子水：用于实验中各种试剂的配制。
（4）10%异丙醇：用于配制氨制氨基酸标准液。
（5）80%乙醇：取分析乙醇以无离子水稀释。
（6）0.25%的水合茚三酮丙酮溶液。
（7）活性炭
（8）石英砂
四、操作步骤
1．氨基酸的提取：
取新鲜的绿豆芽下胚轴2克，加80%乙醇10毫克，加少量石英砂，在研钵中研成匀浆。
移入三角瓶，用少量80%乙醇淋洗研钵，一并移入三角瓶，加0.8克活性炭，置沸水浴中加热至沸1分钟，取下冷却，用滤纸过滤，用少量80%乙醇冲洗滤渣。
滤纸收集在蒸发皿中，置50-60C水浴上蒸干。
用1毫升10%异丙醇溶解，收集样液，准备点样。
2．滤纸的准备：
单向层析滤纸：取28⨯28厘米层析滤纸一张，在对应的两边距每边2厘米处，用铅笔和直尺各划一条平行于纸边的直线，其中一条为溶剂前沿到达的标志，另一条为点样线。
在点样线上每隔2厘米划一与点样线垂直的短线，标出五组标准氨基酸和样品的点样位置。
双向层析滤纸：取28⨯28厘米层析滤纸，在距每边2厘米处各划一条平行于纸边的直纸，以“井”字格下缘直线左端交点为点样原点，原点右手为第一向，另一垂直方向为第二向。
用一张做标准氨基酸图谱，另一张做样品图谱。
3．点样：
点样时选用微量吸管或标有刻度的笔细管（每小格1微升），分别在每个点样处精确点样4微升。
必须在每一滴样品干后再点每二滴。
为使样品快速干澡。
可在有加热装置的点样台上进行，或用吹风机吹干，样点的直径以2-3毫米为宜，点样时温度不能过高，否则会破
坏氨基酸。
将点好样品的单向和双向层析滤纸均卷成筒形，在上、中、下三处系三道线，但滤纸两边缘不能接触。
为了消除盐酸的干扰，避免拖尾现象，可将层析滤纸放入盛有浓氨水的层析缸中熏10分钟，取出在45℃烘箱中将氨驱净，再进行层析。
在整个操作过程中，应戴上乳胶手套，以避免污染试纸，同时防止空气中的氨。
4．层析：
本实验采用上行层析法。
（1）单向层析：取适当大小的层析缸一个，缸底放一个培养皿，向培养皿中注入第一向溶剂，液层厚约1.5厘米，在培养皿上横放两根玻棒，取已点好样品的单向层析纸以点样端朝下放在盛有层析溶剂的层析缸内的玻棒上，盖上盖子（滤纸勿与溶剂接触）。
平衡一小时，然后将纸放入层析溶剂中，注意点样不能浸入溶剂，以免浸脱。
将层析缸密封，这时溶剂沿纸上升，待溶剂前沿到达标记线时，立即取出，用吹风机吹干或45℃以下烘干，然后显色。
（2）双向层析：按上述单向层析法，将点好标准氨基酸和样品的双向层析滤纸分别用第一向溶剂进行上行层析，到达前沿标志线时立即取出用吹风机吹干溶剂，剪去溶剂前沿以外的部分，然后将纸转90度角，以同样的方法用第二向溶剂直行上行层析，当溶剂前沿到过标志线时立即取出吹干或45℃以下烘干，进行显色。
5．显色：
用喷雾器将0.25%的茚三酮显色剂均匀喷在层析纸上注意不要喷得过多。
用吹风机吹干溶剂后，放在60-65℃烘箱中烘3分钟或用吹风机吹热风，即能显出各种氨基酸的色班。
为消除铵离子的影响，可在展开后的滤纸上喷上1%的氢氧化钾溶液，在60℃下保持15分钟，以使全部氨完全挥发掉，再行显色。
五、结果和计算：
单向层析：显色完毕后，用铅笔将各色的轮廓和中心点描绘出来，然后量出由原点至色谱中心点和溶剂前沿的距离，计算出各种已知和未知色谱的Rf值进行比较和鉴定。
各种已知氨基酸顺序由指导教师供给。
双向层析：Rf值由两个数值组成，即要在第一向和第二向层析中各计算一次，根据Rf 值并借助各种氨基酸的特有颜色，分别与标准氨基酸对比，即可鉴定为何种氨基酸，从而可知样品中所含氨基酸的种类。
六、附注：
色素含量不高的植物样品，可不用活性炭处理。