实验 氨基酸纸层析

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层析技术( 层析技术(chromatography 色谱技术) 色谱技术)
一、发展史：
层析分离技术在20世纪初就已得到应用： 层析分离技术在20世纪初就已得到应用： 20世纪初就已得到应用 1903年用于植物色素的分离, 1903年用于植物色素的分离,各种色素以不同的速率流动后形成不 年用于植物色素的分离 同的色带而被分开，由此得名为“色谱法” 同的色带而被分开，由此得名为“色谱法” 1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体； 1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体； 年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体 1944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析； 1944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析； 年出现了以滤纸作为支持物的纸层析 20世纪六十年代末出现了高效液相色谱(HPLC)。 20世纪六十年代末出现了高效液相色谱(HPLC)。 世纪六十年代末出现了高效液相色谱(HPLC)
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分配层析法： 分配层析法：
利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的 分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。 分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。 在一定条件下， 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系
是一个常数。 数α是一个常数。
溶质在固定相的浓度 溶质在固定相的浓度(Cs) 固定相的浓度(Cs)
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移动速率(比移值 ： 移动速率 比移值)： 比移值
原点到层析点中心的距离 Rf = 原点到溶剂前沿的距离
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影响R 值的主要因素： 影响 f值的主要因素：
Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及 两相间的体积比。由于在同一实验条件下， 两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体 积比是一常数，所以主要决定于分配系数。 积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物 质分配系数不同， 也就不同。 质分配系数不同，Rf也就不同。 （1）物质的结构和分子极性： 物质的结构和分子极性： 物质的结构不同极性不同， 物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也 就不同， 就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间 的分配系数，极性大的易溶于水中即固定相中， 的分配系数，极性大的易溶于水中即固定相中，Rf 反之,R 则较大。 小；反之,Rf则较大。
显色： 5、显色
用喷雾器将0 25 ％ 茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上 均匀喷在滤纸上， 用喷雾器将 0.25％ 茚三酮显色剂 均匀喷在滤纸上 ， 热风（加快反应）反应吹干显色。 热风（加快反应）反应吹干显色。
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实验结果与计算： 五、实验结果与计算：
用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来； 1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来； 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离， 2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算 各种已知氨基酸和未知氨基酸的R 各种已知氨基酸和未知氨基酸的Rf值。 分析混合样品中未知氨基酸的组分。 3、分析混合样品中未知氨基酸的组分
Please be quiet, 上课了！！ 上课了！！
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实
验
一
氨基酸纸层析
学时： 学时：3
2011-2-酸的分离，学习并掌握纸层 通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层 析的原理和操作技术； 析的原理和操作技术； 2、掌握分配层析法； 掌握分配层析法； 3、掌握影响分配系数的因素。 掌握影响分配系数的因素。
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展开方式： （6）展开方式：
上行法R 下行法（ 上行法Rf小；下行法（层析缸上部有一盛展开剂 的液槽，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差， 的液槽，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点 易扩散） Rf大；环行法（最好用无方向性的特制滤 易扩散） 环行法（ 用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小， 纸）用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了 溶剂的流动， 较小。 溶剂的流动，Rf较小。
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（2）层析溶剂： 层析溶剂：
首先，溶剂的纯度要高。 首先，溶剂的纯度要高。 其次， 其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的 05～ 85。 Rf在0.05～0.85。 再次，溶剂系统必须新鲜配制，如正丁醇- 甲酸-水系统久 再次，溶剂系统必须新鲜配制，如正丁醇- 甲酸放易引起酯化。 放易引起酯化。 （3）pH值： ） 值 溶剂、滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离 值都会影响物质的解离， 溶剂、滤纸和样品的 值都会影响物质的解离，从而影响物 质的极性和溶解度 极性和溶解度， 改变； 质的极性和溶解度，使Rf改变； 改变
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室验室的温度和时间: （5）室验室的温度和时间: 温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数 分配系数； 温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数； 也影响滤纸纤维的水合作用从而影响固定相的体积 固定相的体积； 也影响滤纸纤维的水合作用从而影响固定相的体积；也影 响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。层 响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。 析必须在恒温条件下进行。 析必须在恒温条件下进行。
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3、点样： 点样：
用毛细管点样，中间点混合氨基酸， 用毛细管点样 ，中间点混合氨基酸， 两侧点四种 标准氨基酸；每个，每点一次用晾干后再点下次， 标准氨基酸 ； 每个， 每点一次用晾干后再点下次 ，点 样点的直径应控制在2mm左点样点重复点 左点样点重复点5 样点的直径应控制在 2mm左点样点重复点5次右 ，点样 完毕用大头针将滤纸做成筒形 点样面向外。 筒形， 完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外。
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三、层析技术的种类
1、按流动相的状态分类： 按流动相的状态分类：
（1）液相层析（色谱） 液相层析（色谱） （2）气相层析（色谱）； 气相层析（色谱）
2、按固定相的使用形式分类： 按固定相的使用形式分类：
（1）柱层析（2）纸层析（3）薄层层析； 柱层析（ 纸层析（ 薄层层析；
3、按分离过程所主要依据的物理化学性质分类： 按分离过程所主要依据的物理化学性质分类：
（1）吸附层析 （2）分配层析 （3）离子交换层析 亲和层析等。 （4）凝胶层析 （5）亲和层析等。
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实验原理: 二、实验原理:
纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。 纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。 分配层析 滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为固定相， 滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为固定相， 固定相 通常把有机溶剂作为流动相。 通常把有机溶剂作为流动相。 流动相 将样品点在滤纸上，进行展层， 将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在 两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同， 两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同， 不同氨基酸随流动相移动的速率就不同， 不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些 氨基酸分离开来， 氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点
分配系数α= 分配系数
溶质在流动相的浓度 溶质在流动相的浓度（Cl) 流动相的浓度（
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溶剂系统： 正丁醇：甲酸： 溶剂系统： 正丁醇：甲酸：水=15：3：2 ： ： 固定相：水和滤纸纤维素有较强的亲和力， 固定相 水和滤纸纤维素有较强的亲和力， 水和滤纸纤维素有较强的亲和力 固定相; 因而其扩散作用降低形成固定相 因而其扩散作用降低形成固定相; 流动相：有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在 流动相： 有机溶剂和滤纸亲和力弱， 滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。 滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。 流动相 由于混合液中各种氨基酸的α值不同， 由于混合液中各种氨基酸的α值不同，所以 移动速率（ 迁移率R 就不同， 移动速率 （ 即 迁移率 Rf 值 ） 就不同 ， 从而达 到分离的目的。 到分离的目的。
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四、实验步骤： 实验步骤：
样品的准备： 1、样品的准备：
称取谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、 称取谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品各 1mg混合溶于10%异丙醇中 0.01M。 混合溶于10%异丙醇中， 1mg混合溶于10%异丙醇中，0.01M。
滤纸的准备： 2、滤纸的准备：
取一长方形滤纸，在滤纸横向对应的两边， 取一长方形滤纸，在滤纸横向对应的两边，距边沿 2cm处 各画两条平行线，一条作前沿标志， 2cm处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点 样线，在点线上每隔2cm画一个“ 作为点样位置 2cm画一个 作为点样位置， 样线，在点线上每隔2cm画一个“+”作为点样位置，共5 个点。 个点。
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层析的基本概念 二、定义
是根据被分离的混合物中各组分的理 层析技术是根据被分离的混合物中各组分的理 化性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 化性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等）的不同， 分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分在两 相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定 一相为固定的，称为固定相； 固定相 相，称为流动相）中进行分配。 称为流动相）中进行分配。 流动相
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层析的基本概念
固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固 固定相 体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可 以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的 流动相 物质移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析 中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
样品溶液中杂质： （7）样品溶液中杂质：
如氯化钠的存在会影响氨基酸的R 如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。
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