鱼类雌核发育的鉴定
细胞工程-9 染色体工程
（2）人工诱导雌核发育的方法
人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或γ射 线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间 施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的 排出，使卵子发为正常的二倍体动物。
凡雌核发育的个体，都具有纯母系的单倍体染色 体组，依赖于卵子染色体组的二倍体化。
雌核发育的关键问题
1）雌核发育（gynogenesis），俗称假受精，意 指精子虽然正常地钻入和激活卵子，但精子的细胞 核并未参与卵球的发育，精子的染色体很快消失， 胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行。
自然界中动物天然存在的雌核发育频率极低。 在一些无脊椎动物和鱼类等存在。
1911年，赫特威氏Hertwig就第一个成功地人工消除 了精子染色体活性，并发现了“赫特威氏效应”。辐 射剂量在极限以下，精子和受精胚胎均正常，辐射剂 量渐增，胚胎存活率下降，继续增加辐射剂量，回复 到正常卵裂 ，胚胎存活率提高。
在自然条件和人为条件改变的情况下，染色体结 构的改变和染色体数目的增减，都将导致生物性 状的变异。
染色体工程：按照人们的需要对生物的染色体进行 操作，添加、消减或替换染色体，从 而达到定向选育新品种或创造人工新 物种的目的。动物染色体工程主要包 括染色体倍性改造、结构改造及人工 染色体的利用等技术。
(一) 染色体数目变异：
• 染色体组（genome）：一个配子的全部染色体。细胞中的一组非同源 染色体，它们在形态和功能上各不相同，但是携带着控制一种生物生长 发育、遗传和变异的全部信息，这样的一组染色体，叫做一个染色体组 • 整倍体(euploid)：体细胞内含有完整的染色体组的类型 • 非整倍体（aneuploid）：染色体组内个别染色体数目有增减，使细胞 内的染色体数目不是基数的完整倍数。 • 多倍体（polyploid）：每个体细胞含有3个或更多染色体组的个体，3， 4，5，6，8倍体 • 二倍体(diploid)：具有两个染色体组的个体 • 单倍体(haploid )：体细胞内含有配子染色体数目的个体
水产动物育种学
水产动物育种学一、绪论水产动物育种：是指应用各种遗传学方法，改造水产动物的遗传结构，培育出适合人类养殖生产活动需要的品种的过程，简单地说就是培育水产动物的新品种。
水产动物育种学：研究水产动物育种理论和方法的科学。
品种：指经过多代人工选择育成的，具有遗传稳定，并有别于同种或同种内其他群体，具有优良经济性状及其他表现型性状的水生动物植物群体。
品种分类：自然品种。
人工品种。
过渡品种育种目标：高产、稳产、优质、高效现代育种目标以遗传为基础？？选择育种理论育种方法①个体水平：选择育种和杂交育种②染色体水平：多倍体育种、单倍体育种、诱变育种③细胞水平：体细胞杂交、细胞核移植④分子水平：基因工程第一章选择育种遗传、变异、选择三者之间关系选择差选择效应选择育种方法简单了解第二章杂交育种1、常见杂交育种（育成杂交）方式种类及特点答：①简单育成杂交（增值杂交创造杂交）是指经过一次杂交，并结合定向选育，将不同品种的优点综合到新品种的一种杂交育种方式（F1代具有双亲优势，对F2代进行选育）优点：年限短，见效快，应用较广泛。
②级进育成杂交根据育种目标，引入一个改良品种与当地被改良品种杂交，产生级进杂交一代F1，然后将F1与当地被改良品种回交，回交若干代，向改良品种特定方向级进。
优点：③引入育成杂交根据育种目标，引入一个改良品种与当地被改良品种杂交，产生引入杂交一代F1，然后将F1与当地被改良品种回交，优点：④综合育成杂交根据育种目标，引入相应的改良品种与当地被改良品种进行多种育成杂交的育种方法。
2、杂种优势利用的特点3、生殖隔离的类型及解决方法①地理隔离：移植、驯化、人工授精②季节隔离：精液冻存保存、人工授精③生殖隔离：体细胞移植等。
第三章多倍体育种1、如何利用四倍体泥鳅产生三倍体泥鳅（正交和反交）2、人工诱导鱼类三倍体（两个图）3、同源多倍体和异源多倍体的来源途径①同源多倍体：加倍的染色体来自于同遗物中或在原有染色体组的基础上加倍而成②异源多倍体：加倍的染色体来源于不同物种AA BBAAAA×BBBB→AABB 先加倍后杂交AA×BB→AB→AABB 先杂交后加倍4、人工诱导多倍体的方法（一）物理学方法①温度休克法：通过高温或低温作用使细胞在短时间内休克，细胞中纺锤丝被破坏。
斑马鱼
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1、用于细胞谱系分析 2、用于研究突变对胚胎的影响
3、用于饱和诱变，克隆和分析造成突变的原因
4、基因转移
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1、细胞谱系分析
含义：通过记录特定细胞在胚胎发育中的分裂历史，来揭 示其特定的细胞发育命运，观察发育潜能。 方法：直接观察法、遗传嵌合克隆分析法、颜料示踪分析 法
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2、突变
原理：斑马鱼单倍体和二倍体雌核发育 方法：①单倍体胚胎培育： 精子（经紫外照射）＋卵子
②二倍体胚胎培育
精子（经紫外照射）＋卵子
静水压休 克或热休 克e 9
作用及特点： 单倍体胚胎：胚胎可发育成基本体型 表现多种畸形 受精4天左右死亡 可用来甄别影响基本体型的突变 二倍体胚胎：可存活且可育 隐形突变通过一至三代繁育 可鉴定出来
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3、饱和诱变
原理：
化学诱导剂
成熟的精子 ＋卵子
三代繁育
发育异常胚胎 筛选
发育通道由一系列的分子事件控制，要想解 析完整的发育过程，需要掌握控制每一系列 事件的全部基因或几乎所有基因 所以，需要大量的动物个体才可进行筛选
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选择斑马鱼的优势： ①发育快、繁殖能力强 ②卵子体外受精、胚胎体外发育
斑马鱼的个“鱼”简历
• 斑马鱼（zebra fish）(拉丁名：Danio rerio)
中文学名： 斑马鱼 蓝条鱼、花条鱼、 蓝斑马鱼、印度 鱼、印度斑马鱼 Danio rerio 动物界 脊索动物门 Chordata 科： 纲： 辐鳍鱼纲 Actinoptery gii 鲤形目 Cyprinifor mes 鲤科 Cyprinidae （鱼丹）属 Danio 斑马鱼 D.
——在胚胎期产生的突变体也可呈现出 研究范围
水产动物育种学复习
水产动物育种学复习水产动物育种学复习题一、名词解释1.育种：应用各种遗传学方法，改造动植物的遗传结构，以培育出高产优质的品种。
2.品种：是人们创造出来的一种生产资料，是由同一祖先通过人工选育而来的，具有一定形态特征和生产性状的群体。
3.育成品种：指通过有意识的人工选择而形成的具有高产或某些特殊品质（如观赏、抗、抗寒）的品种。
4.地方品种：指在自然条件下，在某地生存数十年、数百年，甚至更长时间的品种。
是经过长期自然选择和人工选择而形成的基因综合体。
5.选育品种：指那些由现代育种技术改良过的品种。
6.品系：指来源于共同祖先或一个亲本对，具有突出的特点和性状，相对稳定的遗传性和一定数量的一群个体。
7.地方品系：由于各地生态条件和社会经济条件的差异，在同一品种内经长期选育而形成的具有不同特点的地方类群。
8.家系：一般指由一对系祖繁育而来的群体。
9.近亲交配系（近交系）：通过近亲交配或自交数代得到的纯系。
10.原种：指取自定名模式种采集水域或其他天然水域并用于增养殖生产的野生水生动、植物种，以及用于选育种的原始亲本。
11.良种：通常指生长较快、产量较高、质量较好、具有比较稳定的遗传性状，且适应一定地区自然条件并用于增养殖生产的水生动、植物种。
12.种质资源：又称遗传资源、基因资源，指一切对人类具有实际或潜在利用价值的遗传材料（动植物类型）。
13.种质：指决定遗传性状，并将遗传信息传递给后代的遗传物质。
即亲代通过性细胞或体细胞传递给子代的遗传信息。
14.人工种质资源：指在育种工作中，通过各种方法，如杂交、诱变等，产生的育成品系或品种及各种突变体、基因标记材料、引变的多倍体材料、非整倍体材料、属间或种间杂种等一切人工创造的品种资源。
15.育种中间材料：是指具有某些缺点而未被育成品种的杂种后代、诱变育成的突变体等。
16.育种原始材料：指在选育新品种时最初采用的那些材料。
17.引种：指将外地（国）优良品种、品系或类型引进本地，经过试验，作为推广品种而直接应用于生产，或作为选育新品种的原始材料。
水产生物遗传育种学：遗传育种
一名词解释1、核型（染色体组型）：把生物细胞核内全部染色体的形态特征（染色体长度、着丝点位置、长短臂比、随体有无等）所进行的分析，也称为染色体组型分析。
2、同源染色体：形态结构相同的一对染色体。
特点：育性差，结实率低；形态、组织学上的特征。
3、复等位基因：指在同源染色体的相同位点上，存在三个或三个以上的等位基因。
4、不完全显性;F1表现为双亲性状的中间型。
5、品种：经过人工选育而成的，具有遗传稳定，并有别于原种或同种其他种群之优良性状及其表现性状的水生动植物。
6、细胞质遗传：把细胞质基因所决定的遗传现象和遗传规律称为细胞质遗传，也称为非孟德尔遗传，核外遗传。
7、染色体畸变：指染色体数目的增减或结构的改变。
8、雌核发育：合子的发育是在卵子细胞核的控制下完成的。
9、雄核发育：指卵子只依靠雄性原核进行发育的生殖方式。
10、杂交：指通过不同个体之间的交配而产生后代的过程。
11、远缘杂交：亲缘关系较远的个体间的交配，指不同种间、属间，甚至亲缘关系更远的个体间的交配。
12、近缘杂交;亲缘关系较近的个体间的交配，一般指同种内两个不同品种之间的杂交，又称品种间杂交。
13、同源多倍体：指增加的染色体组来自同一物种，一般是由二倍体的染色体直接加倍产生的。
14、异源多倍体：指增加的染色体来自不同物种，一般是由不同种属间的杂交种染色体加倍形成的。
15、混合选择：又叫集体选择，个体选择，是从来源不同的鱼群中选择表现型优良的个体混养在一起，混合交配，繁殖后代，繁殖的后代再混养在一起，再选种，这样的混合选拔留种，连续几代培育出一个新品种。
16、家系选择：将一雌一雄的优良亲鱼单独交配，建立若干家系，后代以累代近亲繁殖为基础，在尽可能相同的条件下饲养亲鱼，比较鉴定各家系的经济性状，从中选出最好家系的雌雄个体建立品系，这样的选择方法是家系选择。
17、后裔鉴（测）定：凭借子代表型平均值的测定来确定并选择亲本和亲本组合的选择育种，称为后裔测定。
水产动物育种复习题
一、名词解释1.人工雌核发育:是指用遗传失活的精子激活卵子的发育，精子不参与合子的形成，卵子仅靠雌核发育成胚胎的现象。
2.雌核发育：是指卵子在精子的刺激下，依靠自身的细胞核发育成个体的一种有性生殖方式。
3.品系：是指来源于一个亲本对〔或共同祖先〕形成的群体，它具有突出的特点和性状、相对稳定的遗传性和一定数量的个体。
4.原种：是指取自模式种采集水域或取自其他天然水域并用于养〔增〕殖生产的野生水生动物种以及用于选育种的原始亲本。
5.本地种质资源：主要指原产于本地或养殖很久地方品系或品种，它的特点是对本地自然条件有高度适应性。
6.引种驯化：多数引种对象引种到一个地区以后，一般不需要驯化，因为引种对象在培育过程中已经具有适应引种地区的性状，但有些品种的适应的范围小，或者是地区间环境差异较大，跨国跨地区的引种就需要驯化过程，这种驯化的结果往往是形成新的品种。
7.质量性状：指品种的一系列符合孟德尔遗传定律，呈间断变异的性状。
8.选择反应：是一种衡量选择效果的指标，指受选择性状经一世代的选择后，性状平均值的变化情况，在数值上等于选择亲本所繁育的子代表现型平均值减去选择前群体的表型平均值。
9.选择强度：是标准化的选择差，在数值上等于选择差除以被选择群体的表型值标准差。
10.引入育成杂交：又称导入杂交、改进杂交，是为了获得更高的经济效益或根据挡当地的自然条件、经济条件和生产需要以及原有地方品种品质等所客观确定的育种目标，通过引入品种对原有地方品种的某些缺点加以改进而使用的杂交方式。
11.后裔鉴定：又称后裔测定，是根据繁殖亲本后代的质量来评定亲本的种用价值的选择育种技术，其突出优点是能迅速判别亲本的基因型。
12.Hertwig effec t:通常伴随着对精子的放射线照射剂量的增高，失活精子受精后胚胎的成活率降低，当照射超过某一剂量时，成活率反而上升，这种现象称作….13.混杂现象：指品种内具有了本品种不应该具有的基因或遗传物质，使得品种表现出非本品种固有的性状或性能，同时也降低了品种的生产性能。
鱼类精子活力检测
一、实验目的及意义： 精子活力检测是繁殖生物学研究的重要手段，
在鱼类种质改良、远缘杂交及雌核发育研究中具
有重要的作用。
二、实验内容及步骤
一）雄鱼的人工催产 1、取已达性成熟的雄性鲤鱼，实验前10小 时注射HCG； 2、用干毛巾擦干鱼体，轻轻挤压腹部，挤 出乳白色的精液； 3、将精液分装于EP管中；
精子存活率=活动精子数量/全部精子数量×100%
三）精子稀释液对精子活力的影响
取EP管，加入稀释液和精液(4:1)，在室 温下放置1min, 2min, 5min, 10min, 30min, 1h检查精子活力。
精子稀释液 ：1）0.4%NaCl 2）Hank’s液
四）环境温度对精子活力的影响
1、将精液分装于EP管中，其中1管置于4 度冰箱，另1管放入35度水浴； 2、分别在10min,30min,1h取样检查精子 活力。
二）鱼类精子活力的检测
1、用干燥牙签的钝端沾一小滴精液，点在干 净且干燥的载玻片上（用纱布擦干净）， 4x物镜下找到精液后，转换到10x，观察精 子的运动性； 2、用牙签蘸水划过精液区，观察精液边界区 域精子运动性，记录精子遇水激活后1min, 2min, 5min,10min的运动性（精子活力）。
鱼 条件 种 鲤 遇水激活 鱼 后精子
精子失活时间（s）
结论
10min 保存温 度 4℃ 22℃ 35℃ 稀释 保存 1min H2O Hank’ s 0.4% NaCl 2min
30min
1h
温度对精子 活力的影响：
√ 80sHale Waihona Puke ×5min10min
30min 1h
盐离子平衡 对精子活力 的影响：
微卫星标记
鳗及其近交后代微卫星分子标记研究RAPD指纹方面的初步研究，但采用微卫星分子标记进行分析的研究还相对较少。
而微卫星分子标记方法在动植物育种上己经作为一种育种辅助标记广泛应用。
2遗传标记的发展及应用遗传标记(GelleticMarkers)是指与目标性状紧密连锁，同该性状共同分离可以明确反映遗传多态性的生物特征，是基因型特殊的可识别的表现形式，它是生物分类学、育种学、遗传学和物种起源与进化等研究的主要技术指标之一。
广义的遗传标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，狭义的遗传标记概念只是指DNA分子标记(Parke:。
tal.，1998)。
理想的遗传标记一般必须达到以下几个要求: (1)具有高度的多态性;(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型;(3)能明确辨别等位基因;(4)遍布整个基因组;(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记的位点均匀分布于整个基因组;(6)选择中性，即无基因多效性;(7)检测片段简单、快速，实验程序易自动化;(8)开发成本和使用成本尽量低廉;(9)在实验室内和实验室间重复性好，便于数据交换。
但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求(贾继增，1996;邱芳等，1998;赵淑清等，2000)。
遗传标记已作为一种辅助育种标记广泛应用于动、植物及其它领域。
从不同层次水平上看，它可分为形态学标记、细胞学标记、生化标记、分子标记四种2.1形态学标记形态学标记(MO甲hologicalmarkers)是指那些从表型上看显示遗传多态性的特征，即生物特征，如鱼的体高、体长、体色等。
由于形态学标记易观察、识别，因此它一直是选种、育种的重要标记，也是孟德尔遗传学创立的重要基础。
由自发突变或物理化学诱变均可获得具有特定优良性状的形态特征，通过人工选育工作使那些优良胜状稳定遗传下来，从而达到选育的目的和效果，自上个世纪80年代，我国科研工作者就开始采用形态学方法对鱼类种质资源鉴定进行研究，李思发等(1990) 对长江、珠江、黑龙江鳞、墉、草鱼种质资源进行了调查和研究。
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红鲤（红色）♀
普通鲤（青色）♂ 精子经UV照射
红色、全鳞：雌核 F1 青色、全鳞：杂合
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红镜鲤♀ （红色、散鳞）
精 子 经 UV 照 射
镜鲤♂ （青色、散鳞）
红色、散鳞：雌核
F1
青色、散鳞：杂合
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散鳞镜鲤♀ （ss）
精 子 经 UV 照 射
全鳞镜鲤♂ （SS，Ss）
F1
散鳞后代：雌核
9
天然雌核发育鱼类的鉴别
• 3.人工授精卵的细胞学观察 • A：人工授精卵切片光镜观察（精核始终保持密致状态） • B：囊胚细胞压片镜检（检测染色体数目）
天然雌核发育鱼类的鉴别
4.视泡期胚胎脑部形态观察 人工雌核发育单倍体胚胎（与失活精子人工授
精）脑部呈S形畸形，而天然雌核发育及人工雌核
发育二倍体胚胎脑部正常。 5.红细胞大小 方正银鲫红细胞及核的长径、短径、面积、体 积均大于二倍体野鲫，即二倍体与三倍体的核体积
3.染色体计数和组型分析（最准确）
雌核发育：囊胚细胞只一套来自雌核的染色体，为单倍体 囊胚期 压片镜检 杂交种：有来自雌核和雄核的染色体各一套，为二倍体
19
染色体组型：染色体大小、形态以及着丝点位置
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银大麻哈鱼（2n=60）♀ 美洲红点鲑（2n=48）♂
F1
2n=84：雄核发育 2n=60：雌核发育
Nagy等（1978）
17
2. 生化：运铁蛋白位点变异、脂酶
运铁蛋白来说，雌性等位基因不同于雄性，雌 核发育后裔中检测不出来源于雄性的等位基因
1.鲤鱼的运铁蛋白谱带：a-f，红鲤8305E等位基因纯合带，g.其他鲤个体的A等位基因纯合带 2.酯酶同工酶在鲤各组织中的表达L.肝，E眼，H心，B脑，M肌肉，S血清 3.红鲤8305血清脂酶同工酶谱a-d：红鲤8305只有G2纯合带，e-f，红镜鲤G1纯合带 18
单倍体 n
二倍体 2n
三倍体 3n
第三节
安鲫为例）
雌核发育二倍体的鉴定
（一）天然雌核发育鱼类的鉴别（以方正银鲫和普
1.人工繁殖：用正常鲤鱼精子与排出的成熟卵作人工授精，
子代不具一对吻端须
8
天然雌核发育鱼类的鉴别
2.辐射精子人工繁殖：遗传失活鲤鱼精子作人工授精，发育 的胚胎不出现辐射雌核发育单倍体综合症，孵出仔鱼正常。 绝大多数的动物单倍体，其胚胎多表现为脑部S形，尾部 短而弯曲，水肿，围心腔扩大及心血管畸形等单倍体综合症。 由于生理上不正前
完成的，
c.第二极体排出的抑制，对接近着丝点的基因来说，
将主要导致纯合后裔，而对远离着丝点的基因来
说，则导致杂合体比例的增加，而对那些与其着
丝点自由分离的基因来说，2/3 后裔应该是杂合的。
23
24
合。
• 3）后代不具父本性状。 • 4）银鲫中，除某些种类外，所有雌核发育后代全为雌性， 表现型似母本，基因型与母本相同或不尽相同，视卵核发 育的途径而定。
人工诱导雌核发育（二倍体）
染色体的倍性
• 各种生物的染色体数目一般是恒定的，它们在体细胞中成 对，在性细胞中成单。通常用n表示性细胞染色体数目。
20
1.鲤鱼二倍体中囊胚细胞染色体 （2n=104） 2.鲤鱼雌核发育单倍体囊胚细胞 染色体（1n=52） 3.鲤鱼雌核发育个体人工转性精 巢，示放大细胞 4.鲤鱼雌核发育个体的人工转性 精巢 5.鲤鱼雌性个体经人工转性的性 腺切片，示雌雄同体 6.鲤鱼单倍体畸形鱼苗
吴清江，陈荣德，叶玉珍等.鲤鱼人工雌核发育及其作为建立近交系新途径的研究.遗传学报8(1):5055,1981.
21
4.分子标记
遗传标记也能提供到底是由阻止第一有丝分裂还是
由于阻止极体排出而导致雌核发育二倍体的证据。
a.如果二倍体是由第一次有丝分裂的抑制而导致的，由于 它们的两个染色体组来源于一套染色体的复制，因此遗传 组成完全相同，是100%的纯合体。
22
b.第一极体排出的抑制，对接近着丝点的基因来 说，应该导致几乎100%的杂合体后裔，但这未必
12
（二）人工雌核发育二倍体的鉴定 采用与母性有亲缘关系的另一种鱼类的辐射精
子，此时，任何父性遗传可以通过下列几种方法
识别出来：
a.杂种是不能存活的（产生了单倍体后代） b.杂种在形态上是可以识别的 c.杂种在生化上是可以识别的
13
1.形态判别
鲤鱼 体色
青色显性
红色隐性
全鳞显性 鳞片 散鳞隐性
14
第三节 雌核发育二倍体的鉴定
作者：宋庆洋
鱼类的进化地位
• 鱼类最早出现在距今4亿年前 的寒武纪 • 是最早出现的脊椎动物 • 是由水生向陆生过渡的种类
（一） 雌核发育（Gynogenesis）
1.定义 雌核发育是指卵子须经精子激发才能产生只具有母系遗 传物质的个体的有性生殖方式。
雌核发育需要同种精子或异种精子刺激，起诱发作用，
和面积各达到了预定的比例1：1.5和1：1.3
11
天然雌核发育鱼类的鉴别
6.肝脏及肝细胞的大小
方正银鲫的整个肝脏几乎覆盖整个肠管，重量约重体 重的6-7%，胞质稀疏；鲫的肝脏分布肠管之间，胞质浓， 方正银鲫肝重为鲫的二倍 7.体细胞染色体计数 就方正银鲫和普安鲫等天然雌核发育鲫鱼而言，染色 体数目基本为150+-。而一般进行两性生殖的鲫鱼，且雌、 雄性原核融合者，其染色体数目多在100。 8.侧线鳞数目 鲫侧线鳞片数小于30；银鲫侧线鳞大于30。
但不参与发育 (1)天然雌核发育 (2)人工诱导雌核发育
天然雌核发育
•
天然雌核发育卵子的发生与两性融合生殖的鱼类不同 之处，在于它只进行一次成熟分裂，排出的卵子处于第一 次成熟分裂中期。
天然雌核发育
• 1）卵子具有与母本完全相同的染色体组型 • 2）卵子被近缘两性型种类雄鱼的精子激发后才能发育， 但精子只起激发作用，并未发生雌雄原核的融合或配子配