鱼类雌核发育的鉴定共25页文档
人工诱导斜带石斑鱼雌核发育的研究
人工诱导石斑鱼雌核发育的初步研究摘要：采用灭火的鞍带石斑鱼精子精子遗传物质进行完全灭活，灭活后的精子与斜带石斑鱼卵子相结合，获得单倍体受精卵，经冷休克加倍处理，得到雌核发育二倍体，实验结果显示：鞍带石斑鱼精子在紫外照射强度为160-240lux下，照射4min后能使精子完全灭活，处理水温4-6℃条件下，受精卵最佳处理时刻为受精后第6min，最佳冷休克持续时间为30min。
关键词：石斑鱼，雌核发育，人工诱导，紫外照射，冷休克鱼类雌核发育工作开始于20世纪50年代，淡水鱼类开展的较多[1]，海水鱼类这方面的研究相对比较落后，目前仅在大菱鲆 (Scophthalmus maximus)[2]、牙鲆(Paralichthys oliva-ceus)[3]、真鲷(Pagrosomusmajor)[4]、漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)[5]欧鲈(Dicentrarchus labrax)[6]大黄鱼(Pseudosciaena crocea )[7]、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)[8]等有关的报道。
雌核发育研究作用主要体现在三个方面，一是在一些生长差异大的养殖鱼类中构建全雌鱼或者与性转化技术相结合构建功能性雌雄鱼，然后和正常鱼交配进而得到全雌或全雄鱼，二是人工诱导雌核发育可以快速建立纯系，对提高鱼的种质质量具有重要意义，三是雌核发育后代具有高度的纯合性，能够快速淘汰劣质基因，稳定杂种优势，提高选择效率，对鱼类育种和种质资源保护具有重要意义。
石斑鱼是驰名世界的名贵海产鱼类,是中国南方沿海广东、海南、福建、广西等海水养殖的主要对象，经济价值巨大，中国石斑鱼类养殖和其他海水养殖鱼类是继海藻、贝类和虾类之后第四个海水养殖发展浪潮而兴起的[9]。
斜带石斑鱼石斑鱼在分类学上隶属鲈形目（Perciformes）、鲈亚目（Percoidei）、鳍科（Serranidae）、石斑鱼亚科（Epinephelinae）、石斑鱼属（Epinephalus），有关斜带石斑鱼或者石斑鱼雌核发育的报道国内外均未见报到，本研究采用紫外灭活精子，低温冷休克的方法系统深入的研究了斜带石斑鱼雌核发育的条件，以期为石斑鱼的研究提供基础资料，同时对石斑鱼养殖产业的发展以及种质资源保护提供科学依据。
雌雄核发育
关于鱼类雌核发育的细胞学研究，主要包括卵子发生（oogenesis）和成熟卵的受精生物学两部分。前者涉及鱼类雌核发育子代如何保持倍性（即保持染色体数目），而后者则要了解同源或异源精子进入雌核发育卵后父本染色体在合子中的命运。
1. 天然雌核发育型卵子的发生 天然雌核发育鱼类和许多两性融合生殖鱼类一样，卵子的发生都要经历原始性细胞（由生殖褶上皮细胞转化而成）、卵原细胞、初级卵母细胞、次级卵母细胞。当卵原细胞经过原生质生长期 （小生长期）后，才进入营养质（滋养质）的大生长期。在某些鱼类中，滋养质的生长过程可持续1～2年或更长时间。而银鲫在南方一带（如上海和湖北等省市）因水温较高，从越冬期进入营养质的生长阶段，直至翌年4～5月即达到产卵的程度。一般而言，当初级卵母细胞经过一系列的生长和发育，积累了各种营养物质，完成了卵质的分化，合成和储存了胚胎早期发育所需的发育信息，至此，细胞核极化，核内的核仁从边缘向中央集中，并开始溶解在核浆内。这时，初级卵母细胞才由包裹自己的滤泡膜中解脱出来，即从卵巢中排出停留在卵巢腔或体腔中，在排卵的同时，紧接着核膜溶解，染色体进行第一次成熟分裂，放出第一极体，此时的卵母细胞成为次级卵母细胞。随后，又进行第二次成熟分裂，且停留在中期
又有10±的超数染色体或称为B染色体。由于B染色体的存在，它在减数分裂和有丝分裂中不稳定，可以不均衡地分向两个子细胞，这是银鲫染色体数量变化大的一种解释。不过，很难从核型上区分开A和B染色体。Fan等（1990）对具有156条染色体的雄鱼研究发现，它不仅能产生形态、泳动速度正常的精子，而且精子受精能力正常。同时，精子的DNA含量为其体细胞的一半。这说明雄性银鲫能减数分裂形成正常的配子，换言之，其红细胞和精子DNA含量的比值与具有 100条染色体的野鲫（C．auratus auratus）DNA含量的比值均为2：l。因此，可以判定鲫是二倍体（2n=100，n=50）银鲫也是二倍体（2n=156，n=78）这样说来，把银鲫的染色体称为3n＝156或162，或者称为2n=156或162均可。但是将其称为2n=150±则更为确切。首先2n表示银鲫的两性可育性，150±表示了其染色体数的代表性和变异性。此外，银鲫染色体数为156～162的分裂相中具有相近似的臂数（NF）推论银鲫的染色体数变异是由罗伯逊易位（Robertsonian translocation）造成的，不过仍需证实。今后，为减少染色体分析上误差，最好由同一人进行外，还可借助染色体图相分析仪，以求技术日臻完善（范兆廷等，1998）。
(完整版)鱼类性腺发育
鱼类卵细胞的发育与成熟1.卵原细胞反复进行有丝分裂，细胞数目不断增加，经过若干次分裂后，卵原细胞停止分裂，开始生长，向初级卵母细胞过渡。
此阶段的卵细胞为第I时相卵原细胞，以第I时相卵原细胞为主的卵巢称第I期卵巢。
2. 小生长期是卵母细胞的生长期，开始时，细胞质呈微粒状，细胞核卵形，占卵母细胞的大部分，其内壁四周排列着许多小核（或称核仁），中央为粒状的染色质，有时细胞质中可见卵黄核。
卵母细胞进一步发育，卵膜外出现了一层滤泡膜，由单层上皮细胞组成，内有长形的核。
小生长期发育到单层滤泡为止，这时的卵母细胞，称为卵母细胞成熟的第n时相，以第n时相卵母细胞为主的卵巢称为n期卵巢。
性未成熟的鱼，常有相当长的时期停留在n期。
第一时相图（1-3）：卵母细胞一般出现在体长为 6.0 cm 以下的当年生幼鱼卵巢中。
生殖上皮具有2—3 层增殖分生而成的密集的卵原细胞, 其大小不一。
胞径3.6—16.0卩m胞核2.5 —10.0卩m,浅紫色，可见交织状粗丝形染色质（图1）,附于生殖上皮的第 1 时相卵母细胞形态不规则, 浅紫色, 具 1 个巨大的深紫色核仁（图2）。
基质中第 1 时相的卵母细胞长椭圆形, 质膜外出现一层滤泡膜, 具2— 4 个深紫色滤泡细胞（图3）。
第二时相（4-7）（1）早期图: 卵母细胞排列紧密, 形态不一;多数呈多角形、少数为卵圆形。
细胞核透亮, 核中染色体逐渐解散, 但仍可看到呈细丝状残迹。
胞质显嗜碱性, 成细颗粒状分布。
核椭圆, 染色浅。
核仁大小不一, 数量增多, 一般位于核膜内缘。
单层滤泡膜, 5—7 个扁平滤泡细胞围绕着卵母细胞（图4）。
⑵中期：卵母细胞一般呈椭圆形，胞质深紫色。
核与胞质间形成一条宽为0.2 —0.5卩m勺透明层（图5）, 透明层内物质密度很稀, 显得透亮。
（3）晚期：卵母细胞排列松散。
一般呈圆球形, 胞质呈弱嗜碱性, 油球数量明显增多, 分布均匀。
胞质中出现许多呈网状分布的纤维结构, 在网眼中仍有许多被苏木精染成深紫色的微细颗粒。
锦鲤人工雌核发育早期胚胎观察-最新年精选文档
锦鲤人工雌核发育早期胚胎观察锦鲤属鲤形目鲤科鲤鱼属，原产于我国，后传入日本[1]，其色彩鲜艳，神态雍容华贵，观赏价值高，是一种高档观赏鱼，也是一种高度杂合体，花色遗传机制复杂。
目前，大部分锦鲤品种主要是通过杂交以及长期人工选育而得到的。
可见，通过纯系亲本来揭示花色遗传机制是目前锦鲤育种方面最亟待解决的问题。
因此，雌核发育在锦鲤选育和亲市品种开发研究方面具有重大意义[2]，它利用灭活的外源精子刺激卵子发育，再通过人工染色体加倍处理获得雌核发育后代，能快速建立遗传纯系，加快发育速度[3]。
目前，我国水产行业中鲤[4-5]、草鱼[6]、白鲫[7]、虹鳟[8]等10多种鱼类进行雌核发育研究，但由于人工雌核发育的孵化率低，在生产上很难推广。
因此，本试验以锦鲤为母本，以灭活的团头鲂精子为外源诱导精子，采用热休克处理假受精卵，受精卵和孵化率分别可达56.54%、 68.71%，并定期观察研究胚胎发育，为今后锦鲤人工雌核发育的推广提供参考资料。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验鱼母本体质健壮，腹部膨大，色泽鲜艳，成熟度一致的2+龄锦鲤，来自湖南省渔缘生物XX公司；父本为2+龄性成熟团头鲂，来自湖南省渔缘生物XX公司。
1.1.2 药品实验室内配制Hanks’液，冰箱4 ℃保存备用。
催产素于注射前配制，现配现用。
1.1.3 设备 Olympus显微镜及其摄像系统，紫外灯2个（30 W），灯架，摇床、纱布，温度计，加热棒，鸡毛等。
1.2 试验方法1.2.1 催产锦鲤亲本进行2针催产，催产药物注射时间与量根据当时水温、亲本成熟度、方便操作等多因素来确定，团头鲂注射1次，用量为锦鲤亲本一半。
锦鲤与团头鲂分池养殖。
1.2.2 精子灭活[9] 人工挤出团头鲂精子（挤之前必须用毛巾擦干净鱼身上的水，沿着胸鳍至泄殖腔轻轻挤压），立刻加Hanks液，精子∶Hanks液=1 ∶4，然后充分摇匀，在培养皿上铺成约1 mm的液层，放距紫外线15～20 cm处垫有冰板的摇床上处理10～20 min，显微镜下定期检查精子活性。
雌核发育
七、雄核发育
雄核发育（Androgenesis）
指因经过紫外线、X射线或 γ射线处理的卵子与正常的精 子受精，再在适当时间施以 冷、热或高压等物理处理，使 进入卵子内的精子染色体加 倍，而发育为完全为父本性状 的二倍体。 雄核发育均为人工诱导产 生，天然雄核发育未见报道。
雄核发育
雌核发育
保留极体 抑制卵裂
第七章 性别控制技术 Sex control
一、研究鱼类性别控制的意义
性别控制对于水产养殖具有重要的实用意义，因为鱼类生 物学或经济学性状（生长、成熟、繁殖方式、体色、体型 和个体大小等）雌雄鱼之间存在差异。 生产单性鱼类（全雌或全雄）的意义 --- 提高生长速度：e.g. 雄性罗非鱼、雌性鲤、鲫、草鱼和 鳗鲡等都较异性生长快。 --- 控制过度繁殖： e.g. 单性罗非鱼可避免其过度繁殖。 --- 延长有效生长期 --- 提高商品鱼质量 --- 提高观赏鱼的价值（雄鱼较雌鱼体色光彩夺目）
人工雄核发育的诱导（方法与雌核发育相似）
1）卵子染色体的遗传失活 放射线处理或卵子的过熟或老化 2）雄核二倍体的产生 ---自发雄核发育（Spontaneous diploid androgenesis） 人工受精卵不经过特殊处理而自然发生的二倍体雄核发 育，出现频率近0.02% 或更低。 通过单倍体或二倍体精子与失活卵或正常卵人工受精； 杂交。 --- 人工诱发雄核发育（Induced diploid androgenesis） 产量可达48%; 方法：静水压、热休克或雄核移植。
三、雌核发育二倍体的鉴别
1）天然雌核发育鱼类的鉴别（以天然雌核发育方正鲫为例） --- 辐射精子人工繁殖 与遗传失活的鲤鱼精子人工受精，发育的胚胎不出现雌 核发育单倍体综合症，孵出的仔鱼正常而成活率高。 --- 人工受精卵的细胞学观察 受精卵切片光镜观察，精子入卵后，精核不发育成雄性 原核，始终保持致密状态，此为典型雌核发育特征。 --- 初泡期胚胎脑部形态观察 天然雌核发育及人工雌核发育二倍体脑部正常，人工雌 核发育单倍体胚胎脑部呈“S”型畸形。
雌核发育银鲫原肠期胚胎和尾芽期 胚胎差异表达基因的呈现
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经过两轮杂交和两轮120后在第次120产物中那些在原肠期胚胎和尾芽期胚胎表达没有差异的基因的拷贝数已大大地减少了差异表达的基因得到了富集
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鱼类的性别
2、其他
另外，还可用电离辐射和化学绝育等方法产生中性 不育鱼。分子遗传技术的发展，为SRY基因的研究和鱼 类的基因定位、基因谱系的建立，提供了新的有效的方 法。转基因技术用于鱼类性别控制的研究也已经开始起 步，但离应用于生产尚有一定的距离。
应用意义
1．提高群体生长率。对于雌、雄鱼生长速度 不一样的鱼类，通过性别控制，实行单性养殖将会 提高产量，降低成本，获得良好的经济效益。 2．控制繁殖速度。对于性成熟周期短，繁殖 力强的鱼类，可通过单性养殖控制其过度繁殖，避 免幼鱼与商品鱼争夺饵料和空间。 3．延长有效生长期。对于性周期较短，雌、 雄性成熟年龄不同的鱼类，单性养殖可延长有效生 长期，避免因性腺的发育而降低生长速度。
雌雄差异 性转变 孤雌生殖与雌核发育 性别控制及其在生产上的应用
一、鱼类的性别表型模式
• 雌雄异体 • 雌雄同体（现在发现约有300~400种，8目，34科
鱼中存在）
鱼类中有三种雌雄同体： 1、精巢、卵巢同步发育：如一些鮨科鱼类， 可自体受精；鳕，鲱等 2、雌性先熟，转为雄性：如黄鳝，剑尾鱼等 3、雄性先熟转为雌性： 如金鲷、平鲷、黄鳍 鲷等
4、营养及性内分泌因素引起性转变：
许多学者在研究硬骨鱼类卵母细胞最后成熟 的调控机理时，发现鱼类卵母细胞的最后成熟 是由促性腺激素(GTH)、成熟诱导激素(MIT)和 成熟启动因子(MPF)等多种因子连续作用下完成 的
性转变的进化
1、如果性转变的个体生存到其生命的中期， 则性转变的群体可以比其他群体产生更多的后 代。 2、个体大小优势模型：
在波罗的海鲱中约有50%的未受精卵能够发育成为正 常胚胎及幼体；江鳕中该比例为10%
2、雌核发育：精子在卵子和胚胎的发育过程中只 起诱发作用并不参与发育。
金鱼人工雌核发育的胚胎发育过程研究
金鱼人工雌核发育的胚胎发育过程研究摘要开展了金鱼人工雌核发育的胚胎发育过程研究，用紫外线灭活的鲤鱼精子激活金鱼卵子，采用热休克处理卵子使其染色体加倍，获得雌核发育的二倍体金鱼苗。
将假受精的金鱼卵放入室温（21±2）℃室内塑料盒里孵化，10 min 后卵膜吸水膨胀，60 min后开始卵裂，8 h后出现囊胚期，29 h后出现原肠胚期，39 h后出现神经胚期，56.8 h后器官开始形成，3 d后孵化出小苗，受精率为65.16%；平均孵化率为50.28%；诱导率15.80%，正品率为67.90%。
关键词金鱼；人工雌核发育；鲤鱼；胚胎发育金鱼起源于中国，是很受人们喜爱的观赏鱼。
目前大部分金鱼品种主要是通过杂交以及长期人工选育得到的，但变异大、纯度差，不能满足观赏和生产的需要。
雌核发育是特殊的有性生殖方式，属于“染色体组工程”范畴，原理是人工遗传上失活的精子进入未受精的成熟卵，引起卵细胞的发育，是一种快速有效的遗传改良方法[1]。
因此，雌核发育在金鱼选育和新品种开发研究方面具有重大意义。
金鱼与鲫鱼同属于鲤科[2-3]，属不同，亲缘关系较近。
本次试验用鲤鱼的精子诱导金鱼人工雌核发育的方法对金鱼进行遗传改良。
1 材料与方法1.1 试验材料供试雌金鱼购自湖南柳吉现代农业科技有限公司；雄性鲤鱼来自湖南农业大学水产教学基地。
1.2 试验方法1.2.1 人工催产。
在繁殖季节，选取已经达到性成熟的雌金鱼和雄性鲤鱼注射HCG与LHRH-A1合剂进行催熟，约10 h采集精液。
催产药物注射时间与量根据当时水温、亲本成熟度、方便操作等诸多因素来确定，鲤鱼注射1次，用量为金鱼亲本的1/2。
1.2.2 精子灭活。
人工挤出鲤鱼精子，立刻加Hanks液，精子∶Hanks液=1∶4，然后充分摇匀，在培养皿上铺成1 mm左右的液层，放距紫外线20 cm处垫有冰板的摇床处理15 min左右，显微镜下定期检查精子活性。
当90%精子失去活性时停止紫外线照射，收集失活精子，储存在冰块中备用。