菌种保存与活化
第三章发酵工程与食品产业第四节 菌种的活化与扩大培养
2. 种子罐级数的确定
依据: 依据 菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用 种子制备目的: 形成一定数量和质量的菌体。 种子制备目的 形成一定数量和质量的菌体。 发酵的目的: 发酵的目的 获得大量的发酵产物 并达到一定生长阶段后形成的， 产物是在菌体大量形成 并达到一定生长阶段后形成的， 需要在大型发酵罐内才能进行。 需要在大型发酵罐内才能进行。同时若干发酵产物的产生 菌其不同生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。因此， 菌其不同生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。因此，将 两个目的不同、 两个目的不同、工艺要求有差异的生物学过程放在一个大罐 内进行，既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的浪费。 内进行，既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的浪费。
2.2 生产车间种子制备
1.种子罐种子制备 种子罐种子制备 种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异，一般 种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异， 可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 1) 孢子 或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中，经培 孢子(或摇瓶菌丝 被接入到体积较小的种子罐中 或摇瓶菌丝 被接入到体积较小的种子罐中， 养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子. 养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子 把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。 把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。 2) 如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形 如果将一级种子接入体积较大的种子罐内， 成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子. 成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子 将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。 将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。 同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。 同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
菌种保藏方法及复壮技术
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
菌种保藏的原理和方法.ppt
2.沙土管干燥保藏法（略）
3.真空冷冻干燥保藏法
是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低温度 下，（-18℃），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后 在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢 都暂时停止，不易发生变异。一般可保存5~10年左右。
4.液氮保藏法
是适用范围最广的微生物保藏法，其保存期最长。因为液氮的温度 可达-196℃，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130℃）， 故此时代谢活动已停止。保藏期一般为2~3年，长的可达9年之久。
种时，先将原种制成若干管液氮菌种作为长期保藏用菌种，然后 再制一批冷冻保藏菌种作为用户分发用。约经5年后，假定第一 代（原种）的冷冻干燥保藏菌种已分发完毕，就再打开一支液氮 保藏原种制备大量冷冻保藏菌种，这样下去，至少在20年内，凡 获得该菌种的用户，至多只是原种的第二代，从而保证了保藏菌 种与分发菌种的高质量标准。
保藏斜面活化斜面来自2、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良的生产性能。
保藏斜面 平板分离（自然分离，剔除退化菌种） 活化斜面
六、菌种保藏机构
菌种保藏机构的任务是：在广泛收集生产和科研菌种、菌株的基 础上，把它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于交换使 用的目的。国际上很多国家都设立了菌种保藏机构。
▲ I FO（发酵研究所，日本大阪. Institute for Fermentation, Osaka, Japan ） ▲ NCTC（国家典型菌种保藏中心,英国伦敦. National Collection of Type Culture. London, United Kingdom） ▲ NRRL（Northern Utilization Research and Development Division, U.S Department of Agriculture. Peoria, U.S.A. 美国农业 部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市）
液氮保藏菌种的步骤
液氮保藏菌种的步骤
液氮保藏菌种的步骤包括以下内容：
1.准备安培管：用于液氮保藏的安培管，要求能耐受温度突然变
化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安培
管。
安培管的大小通常使用75×10mm 的安培瓶。
2.加保护剂与灭菌：保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的
细胞时，则将空安培管塞上棉塞，在压力 0.11MPa，温度
121℃条件下灭菌 15min；若保存霉菌菌丝体则需在安培管内
预先加入保护剂，如 10%的甘油蒸馏水溶液或 10%二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌种块为限，而后再
进行高压灭菌。
3.接入菌种：将菌种用 10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装
入已灭菌的安培管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安培管内，然后用火焰熔
封。
浸入水中检查有无漏洞。
4.液氮保藏：把已做好的安瓿菌种管放入具有孔洞的小塑料瓶中
（在塑料瓶的底部放一块铁片，使塑料瓶连同安瓿管能一起可入液氮罐中），盖好瓶盖，在瓶盖上连接一条细绳并作记号，以提出所需的菌种。
把装有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安面管缓慢地降温，大约30分钟后，把安瓿管浸入液氮中
进行长期保存。
启用液氮罐中保存的菌种时，应先将安瓿瓶置
于35～40℃的温水中，使瓶内的冰块迅速融解，然后在无菌
条件下开启安瓿瓶用接种针取菌块移接于适宜的培养基上，置22～24℃活化培养，以检查其存活状态。
以上信息仅供参考，建议咨询专业人员获取准确信息。
地衣芽孢杆菌活化方法
地衣芽孢杆菌活化方法
1.菌种取出：
-从超低温冰箱中取出保存的地衣芽孢杆菌菌种，通常为冻干粉或者以斜面形式保存的菌株。
2.无菌操作：
-在无菌条件下，使用接种环或接种针将菌种接入到适宜的培养基上。
例如，可以将菌种接种到无菌斜面培养基上。
3.恢复培养：
-将接种了菌种的斜面置于恒温培养箱中进行活化，温度通常设定在37℃左右，培养时间一般为24小时，使菌体从休眠状态恢复至生长活跃状态。
4.液体活化培养（如适用）：
-对于需要大量菌液的情况，可能还需进一步将斜面上活化的菌种转接到液体培养基中，在适宜温度和时间内进行扩大培养，如采用含有红糖等碳源以及必要营养成分的液体培养基，并保证充足的氧气供应。
5.条件优化：
-根据具体应用需求和菌株特性，可能还需要调整活化过程中的条件，如有的资料提到按照一定的比例添加红糖和水进行浸泡，增加溶解氧并利于菌种的复苏与增殖。
6.环境因素控制：
-确保环境温度、湿度以及光照等条件适合地衣芽孢杆菌的生长，例如在晴天上午9-11点进行操作，利用自然光合作用产生的氧气有利于某些需氧型芽孢杆菌繁殖。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。
菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。
(一)常规保藏方法1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。
2 原理菌种保藏的方法很多。
其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。
使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。
依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。
一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。
3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。
3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。
3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l 毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。
4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。
在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。
在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。
5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。
5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。
这种方法一船可保藏三个月至半年。
5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。
灰葡萄孢菌的细胞形态观察及菌种保存
野生型与突变型灰葡萄孢菌的细胞形态观察及菌种保存1.实验目的通过灰葡萄孢菌的培养实验，观察灰葡萄孢菌生长过程中菌丝形态的变化及孢子的萌发过程；通过对灰葡萄孢菌孢子的活化与复壮，保存活力强的菌种。
2.实验内容野生型及突变体灰葡萄孢菌的培养、菌丝形态的观察；野生型及突变体灰葡萄孢菌的活化、复壮及保存。
3.实验材料3.1实验菌株灰葡萄孢菌是从典型的患灰霉病的番茄上分离并进行了单孢培养，由浙江大学农业与生物技术学院李红叶教授实验室提供；灰葡萄孢菌突变体由本实验室通过紫外诱变获得。
3.2仪器电子天平，高压灭菌锅，酸度计，蒸馏水器，超净工作台，恒温培养箱，显微镜3.3 试剂PDA培养基：称取马铃薯200g，洗净，去皮，切成小块，加入1000ml水中煮沸30分钟，再用纱布过滤煮过的马铃薯，弃残渣，在滤液中加入蔗糖20g，1.5%琼脂粉，充分溶解，再用蒸馏水定容至1000ml，分装三角瓶，置高压蒸汽灭菌锅中，0.1Mpa的大气压、121℃条件下，灭菌20min，室温冷却待用。
4 .实验方法与步骤4.1血球计数板的使用血球计数板是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，总共400小格。
(1)将孢子从培养皿的菌丝上洗下来。
(2)稀释孢子至每小方格内含有4-5个孢子为宜,一般稀释10倍即可。
(3) 将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的盖玻片。
(4)将稀释后的孢子悬液,用移液器吸取一滴置放大后的计数室于盖玻片的边缘,使孢子悬液液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,稍待片刻,使孢子悬液全部沉降到血球计数室内。
(5)计数时,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的细胞数。
(6) 位于大格线上的孢子,一般只计数大方格的上方和右方线上的孢子(或只计数下方和左方线上的孢子)。
(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数。
细胞数/ml=(80小格内的细胞数/80)×400×1000×稀释倍数。
菌种活化的操作方法
菌种活化的操作方法
菌种活化的操作方法包括以下几个步骤：
1. 选择合适的培养基：根据菌种的特性选择适合它生长和繁殖的培养基，例如普通营养琼脂培养基、选择性琼脂培养基等。
2. 预处理培养基：将培养基加热至融化状态后，待其降温至大约45-50摄氏度时，加入适量的菌种悬浮液。
3. 均匀混合：用铁线或玻璃棒将菌液和培养基充分混合均匀。
4. 倒入培养器：将混合后的培养基倒入培养器（如琼脂培养皿或试管）中，使其均匀覆盖整个培养器底部。
5. 固化培养基：让培养器中的培养基自然凝固，或者将其放置在恒温箱中以加速凝固。
6. 培养：将已固化的培养基置于适当的环境中，如温度、湿度等适宜的条件下培养。
7. 观察生长情况：根据菌种的特性和培养的要求，定期观察并记录菌种的生长情况，如菌落形态、颜色等。
需要注意的是，不同的菌种可能有不同的活化方法，因此在操作前最好查阅相关的文献资料，或者咨询专业人员的建议。
此外，操作时要保持清洁，避免外界微生物的污染。
生产菌种的培养与保存
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面
(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；
(3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几 度的细胞冻结点(通常为-30℃)；
(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生 相变；
(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；
(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或 气相(-156℃)中 保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于-70℃冰 箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。
种子扩大培养是指将保存在砂土管、 冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入 试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种 子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质 量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子 。
种子扩培的目的
接种量的需要
菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染
(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积 20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧， 则需先用玻璃珠打散；0.5-1ml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专 用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置 于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。
菌种科学保藏常用方法
菌种科学保藏常用方法中华保健食品商务网 2004-5-31生产母种通常用PDA培养基，选用180×18毫米试管，制成斜面试管接种而成。
PDA培养基配方：土豆（去皮、去芽）200克（也可用淀粉，用量为6克/1000毫升）葡萄糖20克琼脂20克磷酸二氢钾2克复合维生素B 2克旦白胨5克硫酸镁0.3克加水1300毫升本刊记者高级农艺师丁湖广菌种是国家重要的生物资源，是以微生物为对象的研究和生产所必不可少的材料。
因此，世界各国对菌种的保藏极为重视，有55个国家专门设菌种保藏机构。
国际微生物学会设有世界菌种保藏机构，简称WFCC，编写有《世界菌种保藏名录》。
我国菌种保藏机构，有中国微生物菌种保藏管理委员会（设在北京），共保藏有8000多个菌株，其任务是收藏、供应各种优良菌种。
菌种保藏的目的是：使菌种长期保藏之后，仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征，以及不污染杂菌和不发生虫害。
菌种保藏的原理是通过低温、干燥、隔绝空气（真空）和断绝营养等手段，以达到最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制菌丝的生长的繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，所以能够保藏较长时间。
现将菌种保藏的几种主要方法介绍如下。
一、斜面低温保藏这是一种常用最简便的保藏方法。
首先将需要保藏的菌种移接到PDA培养基上。
为了减少培养基水分散发，延长保藏时间，在配制时琼脂用量加到2.5％，再加入0.2％磷酸氢二钾、磷酸二氢钾及碳酸钙等缓冲剂，以中和保藏过程中产生的有机酸。
如果是保藏香菇和木耳菌种，应把配方中的葡萄糖换成麦芽糖，培养基装入量不少于12毫升。
菌种接种后置于用适宜温度下培养至菌丝长满斜面，然后选择菌丝生长健壮的试管，先用硫酸纸包扎好管口棉塞，再将若干支试管用牛皮纸包好。
也可以用无菌胶塞代替棉塞，既能防止污染，又可隔绝氧气，避免斜面干燥。
具体做法是：选择大小合适的橡皮胶塞，洗净晾干，在75％酒精液中消毒1小时后，用无菌纱布吸去酒精，在火焰上方烧去残留的酒精液；于无菌条件下，将试管口在火焰上灼烧灭菌，拔出棉塞，换上胶塞，再用石蜡密封，放入4℃左右的电冰箱内保存。
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菌种保存与活化
（一）培养基保存法
利用各种斜面和半固体培养基，加上石蜡油保存菌种，是一种最常用而又简易的保存方法。
1.普通琼脂斜面保存法：肠道杆菌、葡萄球菌等一般细菌可接种于不含糖的普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无糖肉膏汤，以防干涸。
经35℃培养18～24h后，移种于4℃冰箱中，一般可保存一个月，
每月传代一次。
2.血液琼脂斜面保存法：链球菌、肺炎链球菌应接种于血液琼脂斜面上，35℃培养生长后，置4℃冰箱中保存，链球菌须半个月至1个月移种一次，肺炎链球菌的新分离菌株须2～4天移种一次，以后逐渐
延长移种时间，在适应后可延至半个月移种一次。
3.巧克力色斜面保存法：宜保存脑膜炎奈瑟菌，并在35℃孵箱中保存，一般每2天移种一次。
4.鸡蛋斜面保存法：适于保存含有Vi抗原的沙门菌属及其他含表面抗原的细菌，一般可保存一个月。
5.半固体穿刺保存法：将细菌接种于琼脂半固体或血清琼脂半固体内，经35℃培养18～24h，再以
无菌方法加入灭菌的液体石蜡。
高度约lcm，置4℃冰箱保存。
保存时间可达3～6个月。
（二）干燥保存法
原理是将细菌体内的水分蒸发掉，使其处于休眠和代谢停滞状态，从而达到长期保存菌种的目的。
菌种干燥后低温保存，可保存数年至十几年医学教|育网搜集整理。
（三）冷冻干燥保存法
本法又称冷冻真空干燥法。
它综合利用了各种有利于菌种保存的因素（低温、干燥和缺氧等），是目前最有效的菌种保存方法之一。
用本法保存的菌种具有成活率高，变异性小等优点，保存期一般3～5年，
有的可长达10年以上。
菌种保管要求
2009-11-16 15:32【大中小】【我要纠错】
1.应充分了解每种细菌的不同生物性状及营养要求，以选择适宜的培养基。
一般原则是使细菌能够生长而不易变异的前提下，必须选择营养丰富的培养基，一般不用含糖的培养基。
液体培养基不适于保存菌
种。
2.培养后最好在细菌尚未旺盛发育之前取出，放冰箱内保存。
但应注意，一般细菌大多保存于4℃冰箱中，但真菌，霍乱弧菌、铜绿假单胞菌及粪产碱杆菌需在室温保存。
而脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌及初
次分离的流感嗜血杆菌需保存于37℃孵箱中。
3.保存菌种应做鉴定记录。
在主要培养基上生长情况、菌落特征、形态及革兰染色或特殊染色反应、
生化反应、血清学性状以及个别菌种需要的动物试验结果等。
4.保存的菌种应有两套，一套供保存传代用，一套供实验用。
5.定期转种，每转种三代作一次鉴定医学教|育网搜集整理。
6.专人保管和发放，严格保管和发放制度。
菌种保藏技术
菌种是主要的生物资源，也是食用菌生产首要的生产资料。
一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低生产性能，能长期在生产中使用。
因此，菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。
一、菌种保藏原理
菌种保藏的方法很多，但原理大同小异。
首先要挑选优良纯种。
利用微生物的孢子、芽孢及营养体；其次，根据其生理、生化性，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状，防止变异。
不管采用哪种保藏方法，在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不退化。
二、菌种保藏的方法
1、低温定期移植保藏法。
将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3-5℃低温干燥处或4℃冰箱、冰柜中保藏，每隔4-6个月时间移植转管一次，具体应根据菌种特性决定。
保藏时要注意环境温度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。
因此，若用棉塞，可用干净的硫酸纸或牛皮纸包扎棉塞，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。
除草菇菌种外，其他食用菌菌种都能采用此法保藏。
2、液体石蜡保藏法。
取化学纯液体石蜡（要求不含水分、不霉变）装于三角瓶中加棉塞并包纸，在1公斤/平方厘米压力下灭菌1小时，再放入40℃恒温箱中数天，以蒸发其中水分，至石蜡油完全透明为止。
将处理好的石蜡油移接在空白斜面上，28-30℃下培养2-3天，证明无杂菌生长方可使用。
然后用无菌操作的方法把液体石蜡注入待保藏的斜面试管中。
注入量以高出培养基斜面1-1.5厘米，塞上橡皮塞，用固体石蜡封口，直立于低温干燥处保藏。
保藏时间在一年以上，在低温下，保藏时间还可延长。
3、沙土管保藏法。
取河沙用水浸泡洗涤数次，过60目筛除去粗粒，再用10%盐酸浸泡2-4小时，除去其中有机物质，再用水冲洗至流水的ph达到中性，烘干备用。
同时取贫脊土或菜园土用水浸泡，使呈中性，沉淀后弃去上清液，烘干碾细，用100目筛子过筛，将处理好的沙与土以（2-4）:1混匀，用磁铁吸出其中的铁质，然后分装小试管或安瓿内，每管装量0.5-2克，塞棉塞，用纸包扎灭菌（1.5公斤/平方厘米，1小时），再干热灭菌（160℃，2-3小时）1-2次，进行无菌检验，合格后使用。
将已形成孢子的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水3-5毫升，刮菌苔，制成菌悬液，再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土为止。
将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内，接上真空泵抽气数小时，至沙土干燥为止。
真空干燥操作需在孢子接入后48小时内完成，以免孢子发芽。
制备好的沙土管用石蜡封口，在低温下可保藏2-10年。
4、滤纸片保藏法。
取白色（收集深色孢子）或黑色（收集白色孢子）滤纸，剪成4×0.8厘米的小纸条，平铺在培养皿中用纸包裹进行灭菌（1公斤/平方厘米，30分钟）。
采用钩悬法收集孢子，让孢子落在滤纸
条上。
将载有孢子的滤纸条放入保藏试管中，再将保藏试管放入干燥器中1-2天，除去滤纸水分，使滤纸水分含量达2%左右，然后低温保藏。
5、自然基质保藏法
⑴麦粒保藏法：取无瘪粒、无杂质的小麦淘洗干净，浸泡12-15小时，加水煮沸15分钟，继续热浸15分钟，使麦粒胀而不破，沥干水分摊开晾晒，使麦粒的含水量在25%左右。
将碳酸钙、石膏拌入熟麦粒中（麦粒、碳酸钙、石膏比例为10公斤:133克:33克），拌和均匀后装入试管中，每管约2-3克，然后清洗试管，塞棉塞，灭菌1.5（1.5公斤/平方厘米，2小时），经无菌检查合格后备用，试管基质冷却后接种，适温培养，待菌丝长满基质后用石蜡涂封棉塞，放低温保藏。
2年左右转接一次。
⑵麸曲保藏法。
取新鲜麸皮，过60目筛除去粗粒。
将麸皮和自来水按1:1拌匀，装入小试管，每管约装
1/3高度，加棉塞用纸包扎，高压灭菌（1.5公斤/平方厘米，30分钟），经无菌检查合格后备用，将生长在斜面培养基上的健壮菌种，移种至无菌麸曲管中，移种时注意尽管捣匀小试管中的麸皮，呈疏松状态，在适温下培养至菌丝长满麸皮为止，将麸曲小管置干燥器中，在低温或适温下保藏。
6、生理盐水保藏法。
取纯氯化钠0.7-0.9克，放入100%毫升蒸馏水中，搅拌均匀分装试管，每管5-10毫升，进行灭菌（1公斤/平方厘米，30分钟），经无菌检查合格后备用，将待保藏的菌种接入马铃薯葡萄糖液体培养基中适温振荡培养5-7天。
无菌操作吸取少许培养菌种注入经检验合格的生理盐水试管中，塞上无菌橡皮塞，用石蜡涂封，在室温或低温保藏。
7、冷冻真空干燥法。
将已培养、生长丰富的菌体或孢子悬浮于灭菌的血清、卵白、脱脂奶制成菌悬液，将悬液以无菌操作分装于灭菌的玻璃安瓿瓶中，每管约0.3-0.5毫升，然后用耐压橡皮管与冷冻干燥装置连接，安瓿瓶放在冷冻槽中于-30℃至-40℃迅速冷冻，并在冷冻状态下抽空干燥，并在真空状态下熔封安瓿，在-20℃保存，一般可保存十年以上，但成本较高。
8、液氮超低温保藏法。
首先将要保藏的菌种制成菌悬液备用；其次，准备安瓿瓶，每瓶加入0.8毫升冷冻保护剂10%（体积比）甘油蒸馏水溶液，塞棉塞灭菌（1公斤/平方厘米，5分钟）。
无菌检查后，接入要保藏的菌种，火焰熔封瓶口，检查是否漏气，将封好口的安瓿瓶放在冻结器内，以每分钟下降1℃的速度缓慢降温，使保藏品逐步均匀地冻结，直至-35℃，以后冻结速度就不需控制，安瓿冻结后立即放入液氮罐内，在-150至-196℃保藏，该法只有少数科研院所使用。