病原体分离与鉴定实验技术
挑取单菌落的原理
挑取单菌落的原理单菌落挑取是一种实验室技术，用于分离纯净的细菌菌落，以便进行进一步的研究和实验。
在微生物学和分子生物学的研究中，单菌落技术被广泛应用于病原体的鉴定、抗生素敏感性试验以及细菌基因组测序等方面。
以下将详细介绍单菌落挑取的原理和步骤。
单菌落挑取的原理基于稀释的细菌悬浮液在琼脂培养基上形成独立的菌落。
细菌悬浮液中含有数以百万计的不同菌株，但由于其低浓度，使得细菌在琼脂平板上以单独的菌落形式生长。
每个菌落代表了某一种细菌的生长。
单菌落挑取的步骤如下：1. 准备细菌悬浮液。
先从已经培养好的细菌液中取一定量并加入到无菌生理盐水中制备细菌悬浮液。
此时，需要保证细菌悬浮液的稀释度适中，以确保在平板上形成独立的菌落。
2. 稀释和预分配。
用无菌的琼脂液制备琼脂平板，并将适量的细菌悬浮液转移到称量好的琼脂平板上。
通过倒入适量的液体后，轻轻旋转平板使得琼脂和细菌悬浮液充分混合。
3. 均匀涂布。
用无菌的涂布棒均匀涂抹整个琼脂平板，以促使细菌均匀分布在琼脂表面。
碰触到平板上的其他任何物体可能会导致污染，因此需要确保实验环境的卫生。
4. 培养。
将涂抹好的琼脂平板放置在适当的培养条件下（通常是在37摄氏度下培养），等待一段时间（通常是24至48小时）以使菌落生长。
5. 目测分析。
观察琼脂平板上的菌落，识别和区分不同形态的菌落形成。
这通常可以通过颜色、形状、大小和周围环境的变化等特征进行确定。
6. 挑取单菌落。
使用无菌鉴别棒或是其他的细菌鉴别工具，将待分离的菌落挑取到新的无菌琼脂平板上。
通过将棉签或针头轻轻接触到待挑取的菌落，然后轻轻划过新的琼脂平板表面，以便将菌落转移到新的培养基上。
7. 培养后再次观察。
将新的琼脂平板放置在适当的培养条件下，观察待分离的单菌落在新的培养基上生长状态。
通过以上步骤，可以实现对单个菌落的挑取和分离。
这种技术可以确保待分离细菌单一而纯净地生长，并且可以为下一步的研究提供可靠的基础。
总结来说，单菌落的挑取是一种实验室技术，用于分离和纯化细菌菌落。
常用临床病原学检测
药物 AMP AMC TZP KZ COX CTX FEP ATM ETP FM
MIC(µg/ml) 敏感性
药物
MIC(µg/ml)
≥32
R
IPM
≤1
≥32
R
AK
16
≥128
R
GN
4
≥64
LOREM
R
IPSUM
DOTOLBOR
头孢泊肟≤17mm（或MIC≥8ug/ml)
确 头孢他啶≤22mm（或MIC≥2ug/ml) 证 头孢噻肟≤27mm（或MIC≥2ug/ml)
头孢曲松≤25mm（或MIC≥2ug/ml) 氨曲南≤27mm（或MIC≥2ug/ml)
头孢他啶/克拉 维酸-头孢他啶
和 头孢噻肟/克拉 维酸-头孢噻肟
初 头孢泊肟≤22mm（或MIC≥8ug/ml)
氨苄，美洛，替卡
• 头孢噻吩 肠杆菌科
拉定，氨苄，克罗
• 万古霉素s 所有
替考拉宁s
• 奈啶酸 肠杆菌科
所有FQs
报告结果方式
✓ 敏感（S）
▫ 用常规用量治疗有效 ▫ 常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC
5倍以上。
✓ 耐药（R）
▫ 用常规用量治疗不能抑制细菌的生长 ▫ MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度
✓ MRSA对当前所有使用的b-内酰胺类药物均耐药（除具 有抗MRSA活性的新的头孢菌素外，如：头孢洛林）。
✓ 值得注意的是：由于罕见非mecA介导的苯唑西林耐药 机制，即mecA阴性但苯唑西林MIC是耐药（ mecA ≥4 µg/ml）的菌株，应报告苯唑西林耐药。
临床病原学检查知识PPT课件
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那些有正常菌群寄居的腔道分泌物，涂片镜检虽不 能确定诊断，但对进一步检出的步骤、采用的方法 和分离鉴定病原体所需培养基有重要提示作用，如 在米泔水样便的悬滴片动力检查，发现有运动活泼 的鱼群样弧菌，常提示弧菌科细菌感(thiosulfatecitrate-bile saltssucrose，TCBS)选择培养基。组织标本和疱疹分泌 物涂片经瑞特染色后，查见多核巨细胞和核内嗜酸 性包涵体可早期诊断疱疹病毒感染。临床上不常规 应用电镜检查，但对某些病毒感染有确诊价值，如 婴幼儿急性胃肠炎腹泻粪便电镜下查见车轮状的双 层衣壳病毒颗粒即可诊断为轮状病毒感染。常用的 电镜技术有超薄切片标本电镜观察、负染标本电镜 观察和免疫电镜技术。
临床病原学检查
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1
不同病原体(细菌、螺旋体、支原体、放线菌、
衣原体、立克次体、病毒、真菌、原虫、蠕虫)
所致感染性疾病的实验诊断方法各有其特点，
但几乎都遵循以下基本原则：①正确、规范采
集和运送标本；②通过直接显微镜查见病原体
或检出病原体抗原成分；③借助分子生物学的
方法检测病原体核酸；④利用免疫学方法检测
机体对病原体抗原成分产生的免疫产物；⑤对
病原体进行分离与鉴定。在完成病原体的检出
和鉴定任务后，结合病人的病史、症状或体征，
快速作出诊断。并积极参与临床选择抗微生物
药物，指导和监控微生物的治疗方案，避免耐
药菌株的产生。
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2
标本采集和运送 ：
根据各种病原体所致感染性疾病的病程确定 标本采集的时间、部位和种类。所有采集的 标本均置于无菌或清洁容器中，不能接触消 毒剂和抗菌药物。 标本必须注明姓名、年 龄、性别、采集日期、临床诊断、检验项目 等。标本采集后应按要求处理，立即送往病 原学实验室，对于烈性传染病材料的运送需 专人护送。
病原生物与免疫学基础PPT课件
根据免疫应答过程中是否出现抗体，可将免疫应答分为体液免疫和细胞免疫两种类型。体液免疫是指通过抗体与 抗原结合，形成沉淀或细胞毒作用，最终清除抗原的免疫应答类型；细胞免疫是指通过T淋巴细胞与抗原的直接 接触，激活细胞毒T细胞或巨噬细胞等，最终清除抗原的免疫应答类型。
免疫学在医学中的应用
病原生物与免疫学基础 ppt课件
• 病原生物概述 • 免疫学基础 • 病原生物感染与免疫反应 • 免疫预防与治疗 • 病原生物与免疫学基础实验
01
病原生物概述
病原生物的定义与分类
定义
病原生物是指能够引起人类或动物疾病的生物，包括细菌、病毒、真菌、寄生 虫等。
分类
病原生物可根据其形态、遗传特征、致病特点等进行分类，如细菌中的革兰氏 阳性菌和革兰氏阴性菌，病毒中的DNA病毒和RNA病毒等。
抗体的概念
抗体是指机体在抗原刺激下产生的 具有高度特异性的蛋白质分子，能 够与相应抗原发生特异性结合。
抗原与抗体的关系
抗原与抗体之间的结合具有高度特 异性，即一种抗体只能与一种抗原 发生结合。抗原与抗体的结合力取 决于它们之间的亲和力。
免疫应答的过程与类型
免疫应答的过程
免疫应答过程分为三个阶段，即感应阶段、反应阶段和效应阶段。感应阶段是指抗原进入机体后被识别和处理的 阶段；反应阶段是指免疫系统对抗原刺激产生应答的阶段；效应阶段是指免疫应答产生的效应物质与抗原结合， 最终清除抗原的阶段。
疫苗的研制与应用
自身免疫性疾病的诊断与治疗
通过人工制备减毒或灭活的病原微生物或 其代谢产物，研制出各种疫苗，用于预防 和控制传染病的发生和流行。
利用免疫学技术对自身免疫性疾病进行诊 断和治疗，如检测自身抗体、调节免疫功 能等。
病原微生物检测实验原理及流程介绍
华大
DNA纳米球：DNB技术是将基因组DNA首先经过片段化处理，再加上接头序列，并环化成单链环化DNA，随后使用PCR-Free 的滚环扩增技术将单链环化DNA扩增2-3个数量级，所产生的扩增产物为DNA纳米球。
测序-原理
华大
数据质控
表单各项
相关要求解释与要求
备注
样本
样本名称，包括NF及临床样本
敏感性和特异性差、并不是所有病原微生物都有相应抗体、有窗口期、假阳性高。
核酸检测（PCR）
简单、快速、价格低、可定量检测、准确性高。
依赖主观假设、检测已知的微生物、需要引物扩增，但引物并不总是可靠、只能检测微生物基因组的很小部分。
质谱法
过程简单、特异性和准确性高、可进行高通量分析。
基于已培养的阳性菌落，依赖培养、只能检测细菌和真菌约1000种已知微生物、部分病原体不能鉴定到种、只能定性不能定量。
感染人群多新发罕见感染源不断涌现
诊断方法找不到病原/患者等不到诊断结果
经验性用药加剧细菌耐药无药可医、不治而亡
[1]Troeger C, et al, The Lancet Infectious Diseases, 2018. [2]William OC, et al, Nature Reviews Microbiology,2017
优点：理论上能检测全部已知和未知病原体（一网打尽);缺点：灵敏度受宿主背景干扰；
病原宏基因检测（mNGS）-检测流程
1
0.5h
样本前处理+去宿主+破壁
g+DNB
8h
测序
2-3h
病原宏基因检测（mNGS）-去宿主
差异裂解法：利用人源细胞与微生物细胞结构差异，选择性的裂解宿主细胞，利用核酸酶酶解掉释放出来的宿主DNA，最后进行病原体DNA的富集纯化；
ca mrsa判定标准
ca mrsa判定标准CA-MRSA（community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus）是一种常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染，它是在社区环境中传播的病原体。
与传统的医院获得性MRSA（HA-MRSA）不同，CA-MRSA主要侵犯健康的个体，包括儿童、青少年和年轻成年人。
CA-MRSA在全球范围内呈增加趋势，给公共卫生造成了很大的挑战。
为了诊断CA-MRSA感染，需要遵循一系列的判定标准。
首先，CA-MRSA的判定需要基于临床表现。
患者通常在暴露于社区环境后的一到几周内出现症状。
典型的临床表现包括脓包、皮肤和软组织感染、肺炎和败血症等。
另外，流行病学信息也与该病的诊断有关。
CA-MRSA感染通常与个人密切接触、共用个人物品、参与体育活动等有关联。
此外，对没有与医疗环境接触的患者，医院获得性MRSA的诊断需要排除。
其次，实验室检测是判定CA-MRSA的关键。
CA-MRSA的诊断依靠对病原体的分离和鉴定。
在实验室中，采集患者的病原体标本，如皮肤脓液、血液和呼吸道样品等。
然后，通过培养技术使菌株增殖，其中金黄色葡萄球菌能在常见的培养基上生长。
在分离出菌株后，可以使用不同的方法进行鉴定。
传统的鉴定方法包括革兰染色、产酶试验和药敏试验。
除此之外，分子生物学技术也可以用于鉴定CA-MRSA，如聚合酶链式反应（PCR）和DNA测序等。
最后，药敏试验对MRSA耐药性的检测非常重要。
CA-MRSA的特点之一是其常对多种抗生素耐药，特别是对β-内酰胺类抗生素耐药。
因此，在治疗过程中了解MRSA的药敏性是至关重要的。
药敏试验可以通过纸片扩散法、肉汤微量法或自动微量法进行，用于测定细菌对抗生素的敏感性和耐药性。
通常，鉴定CA-MRSA的时候，应该评估其对甲氧西林和其他抗菌药物的敏感性，以确定治疗方法。
总结起来，CA-MRSA的判定标准主要包括临床表现、流行病学信息、实验室检测和药敏试验。
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脓性标本应考虑同时做厌氧培养.
尿液标本的采集
应在用药前或停药3天后留取标本, 并使尿液在膀胱内停留6~8h以上,起床后 第一次尿样阳性率较高.
无菌采集中段尿 如考虑厌氧菌感染，采取膀胱穿刺法采
集标本。 排尿困难者考虑导尿采集标本。
革兰阴性菌主要耐药类型：
ESBLs（+）的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌及 奇异变形杆菌
持续高产染色体Ⅰ型ß-内酰胺酶(AmpC酶)的 阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、 吲哚阳性变形杆菌、铜绿假单胞菌等
多重耐药的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜 麦芽窄食单胞菌等
产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌
直接镜检找到病原体，而培养阴性，应考虑有 L细菌、厌氧菌或苛氧菌感染。
病毒分离培养与鉴定的结果评价
必须结合流行病学资料、临床表现、标本来源 及病毒种类加以分析。
从组织、血液以及脑脊液中分离到病毒可明确 诊断。
从呼吸道、肠道等分离到病毒，如该病毒人体 不能长期携带，有诊断价值，如麻疹病毒、流 感病毒等。反之需相应的临床表现，才有病原 学意义，如巨细胞病毒，肠道病毒等。
（一）MRS（耐甲氧西林葡萄球菌）
(methecillin resistance staphylococcus)
MRS的特点是它们都具有一外来基因 mecA，负责编码PBP2a，当PBP2a占 优势时，由于ß-内酰胺类药对其亲和力 低，使得MRS对青霉素类、头孢菌素类、 碳青霉烯、单环内酰胺类、 ß-内酰胺/ ß-内酰胺酶抑制剂类抗生素均耐药。并 提示对氨基糖甙类、大环内酯类、克林 霉素和四环素等多种抗生素耐药。
感染性疾病:
实验诊断-临床常见病原体检测：性传播疾病病原体检测
实验诊断-临床常见病原体检测：性传播疾病病原体检测性传播疾病病原体检测性传播疾病（sexually transmitted disease， STD）简称性病，是一类能通过各种性接触、类似性行为及间接接触而传播，主要侵犯皮肤、性器官和全身脏器损害的疾病。
包括梅毒、淋病、艾滋病、软下疳、性病淋巴肉芽肿、非淋菌性尿道炎、生殖器疱疹、尖锐湿疣、生殖器念珠菌病、细菌性阴道病、滴虫病等20余种疾病，其中前3种属于《中华人民共和国传染病防治法》规定管理的乙类传染病。
一、流行病学和临床类型（一）流行病学1.病原学细菌（淋病奈瑟菌，杜克雷嗜血杆菌等）、病毒（人类免疫缺陷病毒，人乳头瘤病毒，单纯疱疹病毒-Ⅰ等）、支原体（解脲脲原体，生殖支原体等）、螺旋体（梅毒螺旋体等）、衣原体（沙眼衣原体D-K型，L1，L2，L3型等）、真菌（白念珠菌等）和原虫（阴道毛滴虫等）。
2.传播途径性行为传播、间接接触传染、血液与血制品传播、对胎儿与新生儿的传播、职业传播（二）常见临床类型1.获得性免疫缺陷症（AIDS）又称艾滋病，由人类免疫缺陷病毒（HIV）通过结合细胞表面的CD4蛋白受体进入易感细胞引起部分免疫系统被破坏。
2.梅毒（shyphillis）是由苍白密螺旋体引起的疾病，一般过程可分为三个阶段：一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒。
3.淋病（gonorrhea）由淋病奈瑟菌引起的泌尿生殖系统的急性或慢性化脓性感染。
4.非淋菌尿道炎（non-gonococcalurethritis，NGU）主要是由沙眼衣原体、解脲脲原体等通过性接触所引起的尿道炎症。
5.生殖器疱疹（genitalherpes）和尖锐湿疣(condyloma acuminatum) 分别由单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒所引起的性病。
6.软下疳（chancroid）由杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi) 感染而引起的性病。
二、检查项目和临床应用（一）AIDS病原体检测1.HIV的分离培养病毒培养是检测HIV感染最精确的方法。
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病原体分离与鉴定实验技术病原体分离与鉴定是微生物学研究中的重要环节，其结果对于疾病的诊断、预防和治疗具有重要意义。
本文将介绍一些常用的病原体分离与鉴定实验技术。
一、细菌的分离与鉴定
1. 样本采集与处理
首先，我们需要从患者的体液、组织或病灶中采集样本。
常见的样本包括血液、尿液、痰液、伤口分泌物等。
采集后，样本需要进行适当的处理，如离心沉淀、过滤等，以获取纯净的菌种。
2. 培养与分离
将经过处理的样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件，如温度、湿度等控制。
通过观察培养的菌落形态、色素、气味等特点，选择单个菌落进行分离。
3. 形态学鉴定
通过显微镜观察菌体的形态特点，如形状、大小、结构等，可以初步判断细菌的分类。
4. 生理生化鉴定
细菌具有各种代谢特点，可通过测定其对营养物质的利用能力、产酶能力、产气或产酸能力等特性，进行病原菌的初步鉴定。
5. 血清学鉴定
血清学鉴定是通过观察病原菌与抗血清或其他特定蛋白质结合反应，来确定病原菌的种属或亚种属。
该方法常用于鉴定沙门菌、流感嗜血
杆菌等。
二、病毒的分离与鉴定
1. 细胞培养法
病毒的分离最常用的方法之一是细胞培养法。
将待测样本接种于合
适的细胞系，并观察细胞的形态变化、细胞的病变以及病毒是否复制
等现象，可以初步判断是否存在病毒感染。
2. 核酸扩增技术
核酸扩增技术是近年来病毒鉴定的重要方法之一。
通过PCR、实时
荧光定量PCR等技术可以快速、准确地检测病毒的核酸序列，从而进
行病毒的鉴定。
3. 血清学检测
病毒感染后，机体会产生特异性的抗体。
通过血清学检测，可以检
测患者血清中是否存在特定病毒的抗体，从而进行病毒鉴定。
三、真菌与寄生虫的分离与鉴定
1. 样本采集与处理
对于真菌和寄生虫的分离与鉴定同样需要采集患者的组织、分泌物
等样本，样本的处理与细菌类似，需要消毒、离心等步骤。
2. 培养与分离
将样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件控制，如温度、湿度等。
通过观察培养的菌落特点、形态等，选择纯净的菌落进行分离。
3. 显微镜鉴定
通过显微镜观察菌丝的形态、孢子的产生情况等特征，可以初步判断真菌的分类。
4. 生长特性鉴定
真菌和寄生虫具有各自的生长特性，如耐热性、光照要求、培养基偏好等。
通过在不同条件下培养并观察生长特性，可以进一步判断其分类。
5. 分子生物学鉴定
对于一些种类繁多或形态相似的真菌和寄生虫，分子生物学方法如PCR、序列分析等技术可以提供更准确的鉴定结果。
以上是一些常用的病原体分离与鉴定实验技术。
根据具体研究目的和实验条件的不同，选择适当的分离和鉴定方法，能够帮助科研人员准确判断疾病的病因，从而为临床诊断和治疗提供依据。