绿色木霉固态发酵产纤维素酶活力的研究_王仪明
绿色木霉在稻壳和麸皮混合基质上固态发酵生产纤维素酶的研究
图! 稻壳 （未经处理） 含量对发酵 结果的影响
@ ! ／ ・ = > ; < ; + A B ? （干物质）
参照文献， 对稻壳进行如下’种预处理： ： 预处 理 ! ( )* + $ , 溶液( .浸泡% ( ［ ］ 0 ； 预处理 ： 溶 液 煮 沸 / %( )* + $ , ! . ! 1
［ ］ 预处理 ’ ： 液! 2 # 3& ； % ), " $ % -!! % 1 .处 % ( 理( （本实验室酸水解稻壳条件） 。以上预处 /
绿色木霉在稻壳和麸皮混合基质上固态发酵 生产纤维素酶的研究
陈书峰 赵 亮 刘德华
（清华大学化学工程系应用化学研究所，北京， ） ! " " " # $ 摘 要 以稻壳和麸皮的混合物为主要原料， 采用绿色木霉 （! ） 固态发酵生 " # $ % & ’ ( " ) *% ’( ’ ) * $ ) &
利用纤维素酶将植物纤维原料水解成单 糖， 继而发酵成酒精或单细胞蛋白， 是合理利用 可再生资源的一条有效途径， 其关键环节是纤 维素酶的生产， 目前普遍采用液体深层发酵工 艺生产， 由于设备投资大， 生产成本高， 此工艺 仍缺乏足够的竞争性。固态发酵由于其特有的 经济、 实用性， 在纤维素酶的生产方面已经引起
09c显示了稻壳含量对发酵结果的影响当稻壳含量为酶活分别为191物质比对照酶活提高了91基质含水量对产酶的影响调节基质的初始含水量是控制培养基含水量的有效措施图表明了不同的初始含水量对发酵结果的影响实验结果明当培养基初始含水量为时绿色木霉的产酶效果最好
" " #$ % #! & ’ ( & % ) $ ) * " % + % # , ) ’ * & 食 品与发酵工业 !
绿色木霉ZY-1固态发酵产纤维素酶
绿色木霉ZY-1固态发酵产纤维素酶于莹;姚日生;齐本坤;朱慧霞【期刊名称】《生物加工过程》【年(卷),期】2009(7)1【摘要】利用筛选的绿色木霉ZY-1(Trichoderma viride ZY-1)固态发酵产纤维素酶,采用稻草和麸皮为底物,考察稻草与麸皮比例随发酵时间对产酶的影响.结果表明:底物中,在m(稻草):m(麸皮)为0:5和1:4时,发酵48 h,pH保持4.5左右,还原糖量急剧上升,胞外蛋白产量最低;仅以稻草作底物时,整个发酵过程中pH约为7,还原糖量最低,胞外蛋白产量较高而滤纸酶活、羧甲基纤维素酶(CMCase)和β-葡萄糖苷酶(β-Gase)酶活均较低;在m(稻草):m(麸皮)为3:2时,发酵96 h,滤纸酶活达最大值5.01 U/g干曲;m(稻草):m(麸皮)为1:4时,发酵96 h,β-Gase酶活达最大值4.6U/g干曲;m(稻草):m(麸皮)为4:1时,发酵72 h,CMCase酶活达最大值6.01 U/g 干曲.因此,底物中存在适量的稻草和麸皮有利于Trichoderma viride ZY-1产纤维素酶.【总页数】5页(P54-58)【作者】于莹;姚日生;齐本坤;朱慧霞【作者单位】合肥工业大学,化学工程学院,合肥,230009;合肥工业大学,化学工程学院,合肥,230009;合肥工业大学,农产品生物化工教育部工程研究中心,合肥,230009;合肥工业大学,化学工程学院,合肥,230009;合肥工业大学,化学工程学院,合肥,230009;合肥工业大学,农产品生物化工教育部工程研究中心,合肥,230009【正文语种】中文【中图分类】Q539.3【相关文献】1.绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶条件研究 [J], 李杰;王景胜;肖连冬;程爽2.绿色木霉固态发酵产纤维素酶条件研究 [J], 陈莉3.绿色木霉JD-1固态发酵玉米芯产纤维素酶条件优化 [J], 武金霞;武建;朱晓;张贺迎4.绿色木霉Sn-9106固态发酵中药残渣产纤维素酶研究 [J], 杜晓兵;郭龙伟;阚国仕;任大明;陈红漫5.绿色木霉的选育及固态发酵产纤维素酶的研究 [J], 梅炼;张爱萍;徐晓立;谢君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
绿色木霉WL 0422高产纤维素酶的研究
维素酶菌株 ，由江南大学医学系分子生物学研究室筛选
获得和保藏 。
１ ． ２原料 和 试 剂
和 Ｂ 葡萄糖苷酶（ Ｃ３ ．．１等 ３种酶组成…。它在饲 一 Ｅ ． １ ） ２ ２
料、 纺织 、 食品 、ห้องสมุดไป่ตู้酿造和造纸等工业中有广泛 的应用潜力 ，
饲料和纺织用酶是 当今国内外研究和开发的热点 。含纤
１３培 养基 及 培 养 方法 ．
理或抛光 ， 能改善织物和服饰的手感 、 外观和舒适性ｂ。 ］
国产纤维素酶的发酵酶活力低 ， 生产成本高 ， 限制 了
酶的广泛使用。作者从丝状真菌中筛选获得一株 高产酸 性纤维素酶的绿色木霉 ＷＬ０ ２ ４ ２菌株。为挖掘该菌株产
１． ．１斜面培 养基 ３
反 应 ３ ｍｉ。 以 每 ｈ水 解 滤纸 产 生 １Ｉ ｌ 原 糖 （ 葡 ０ ｎ ｍｏ 还 ￣ 以
萄糖计 ） 所需酶量定义为 １ Ｆ Ａ单位 （ ） 个 Ｐ Ｉ 。 Ｕ
２结果 与 讨 论
２１ 形瓶 固态发 酵 工 艺 条 件试 验 ．锥
２１１培 养 温度 和 时间 ．．
Ｃ Ｃ Ｉ ｇ十 曲 ） １８ ６ １９ ４ １ ８ ０ ２０ ５ １８ ５ １５ ５ Ｍ Ａ（Ｕ／ ３ ０ ９ ６ ８ ７
（ 以葡萄糖计） 所需酶量定义为 １ Ｃ Ａ单位（ 。 个 ＭＣ Ｉ Ｕ）
１４３滤 纸 酶 活 力 （ Ｐ ） 定 ．． ＦＡ 测
０１ Ｌ适 当稀释酶液 ， ．ｍ 加至含一张 １Ｘ６ｅ ｍ新华滤 纸片的 ２ ＬＮ ２Ｐ ． ｍ ａＨ Ｏ一柠檬酸缓冲液（Ｈ ４ ） ５ ℃ ４ ｐ ． 中，０ ６
１３３麸 曲种 子培 养 基 －＿
２ ０ Ｌ三角瓶 装 ＆ ｇ ５ｍ ０ 基料 （ 麸皮 ： 草粉 ＝ ．ｇ１ ） 稻 ６ ： ４ 五ｇ，
绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶条件研究
现 代农 业科技
２１ 年第 １ ０１ ２期
农 业基础 科学
绿 色木 霉 一 １固态 发酵 产 纤 维素 酶条 件 研 究 Ｍ
李 杰 王景 胜 肖连冬 程 爽
（ 阳理 工学 院 生化 学 院 ， 南 南 阳 ４ ３０ 天 冠 集 团 ） 南 河 ７ ０ ４；
摘 要 为 了用廉价 基质 生产 纤维素 酶 ， 对绿 色木 霉一 Ｍ１利 用稻 草和麸 皮 固 态发 酵 生产 纤 维素酶 的条 件进 行 了研 究 。 结果表 明 ， 固态发 酵产 纤 维素酶 的较 优条 件 为培 养 温度 ２ ８℃ ， 液 比 为 ｌ：５ 氮 源浓 度 １ ％ ， 草 和麸 皮 比例 为 ７３ 在 此 条件 下 ， 种 １％液 态种 子进 行 料 ：．， ！ ． 稻 ５ ：； 接 Ｏ 培养 ， 酶活 力在 Ｏ ６ ～ ０ｈ逐渐 上升 ，０ ７ 慢 下降 ，２ｈ岳酶 活 重新上 升 ，０ 活达 最大值 。 ６ ～ ２ｈ缓 ７ １８ｈ酶 关 键 词 稻 草 秸 秆 ； 态发 酵 ； 维 素 酶 固 纤 中图分 类号 Ｔ ９ ９ Ｑ ２ 文 献标 识码 Ａ 文章 编号 １０ — ７ ９ ２ １ ）２ ０ ４ — ３ ０ ７ ５ ３ （０ １ １ — ０ ９ ０
ａｔｒ１ ８ｈ． ｆ ｅ ０
１Hale Waihona Puke １ Ｋｅ ｒ ｓ ｒｃ ｔａ ；ｏ ｉ—ｓａｅｆｒ ｎ ａｉｎ； ｅｌｌｓ ｙｗｏ ｄ ｉ ｅｓｒｗ ｓ ｌｄ ｔｔ ｍｅ ｔｔｏ ｃ ｌ ａ ｅ ｅ ｕ
绿色木霉3.3744产纤维素酶固态发酵条件研究
第２ ８卷 第 １期
２０ ０ ７年 ２ 月
河 南工 业 大学 学报 （自然科 学版 ）
Ｊｕｎ ｌ ｆ ｎ ｎＵ ｉ ｒ ｔ ｏ ｅｈ ｏ ｇ （ ａｕａ ＳｉｎｅＥ ｉｏ ） ｏ ｒａ ｏ ａ ｎ ｅｓ ｙ ｆ ｃ ｎｌ ｙ Ｎ ｔｒｌ ｃ ｃ ｄｔ ｎ Ｈｅ ｖ ｉ Ｔ ｏ ｅ ｉ
等 ６个处 理 ， 别加 入 固体 发 酵 基 础 培 养基 进 行 分
基 金 项 目 ： 南 省优 秀 青年 骨 干教 师 项 目 （ ５ ） 河 南 工 业 大学 博 河 １５ ；
士启动基金项 目
试验 ， 每处理 重 复 ３次 ．
关 键词 ： 色木 霉 ；纤 维素酶 ； 酵条件 绿 发
中图分 类 号 ： Ｑ ２ Ｔ ９５ 文献标 识码 ： Ａ 方 为 ： ３ ０ｍＬ的 三角 瓶 中加 入硫 酸 铵 ０ １ ５ ｇ 在 ０ ． ２
０ 前 言
纤 维素 酶 是 重 要 的复 合 酶 产 品 ， 饲 料 、 在 酒 精 、 织 和食 品等 领 域 已广 泛 应 用 ． 我 国 ， 维 纺 在 纤 素酶 是继 糖化酶 、 粉 酶 和蛋 白酶 之 后 的 第 ４大 淀 工业 酶种 ， 至完全 有可 能成 为第 １ 酶种 ， 甚 大 因此
纤 维素 酶是酶 制 剂工业 中的一３ ２混合 的麦 麸／ ， １ ，／ ｄ 麦秸 杆 ５ｇ ２ ５倍 （ ／ ，． Ｗ
） 的水 （ ２ ５ｍ ） 灭菌 后备 用． １ ． Ｌ ，
１ ２ １ 最 佳 氮 源 的 筛选 ． ．
选用 ９种 氮源 进行试 验 ， 分别 为硫 酸铵 、 硫 过
装入 三角 瓶 中 ， 然后 分 别 加 入 １ ０ ｍＬ孢 子 悬 浮 ．
绿 色木 霉是 一 种 纤 维素 酶 高 产 菌 ， 年 来 对 近 其产纤 维 素酶特 性研 究很 多 ， 结果 却 不尽 相 同． 但 通过 比较 发现 ， 同 绿 色木 霉 菌 株 的产 纤 维 素 酶 不 培养 条件 的相差 很 大 ， 养 温 度 由 ２ 培 ５—３ ２℃ ， 培 养初 始 ｐ Ｈ值 从 ４ ０—８ ０不等 ， 养 基 含水 量 从 ． ． 培 １ ０ 一 ０ ％不 等 ． 碳 源 和 氮 源 的 区别 由于 所 ２ ％ ４０ 而 用 的 降 解 材 料 不 尽 相 同 ， 相 互 配 比 也 有 差 其 别¨ 笔 者对绿 色木 霉 ３ ３ ４ 产 纤 维 素 酶 的最 剖． ．７ 佳培 养条件 进行 了研 究 ， 为利 用 该 菌 株 进行 纤 维
绿色木霉H7产纤维素酶条件的研究
王 小涵 周 晶 王仁君 沙未 来 （ 曲阜 师 范大 学生命科 学 学院 ２ ３ ６ ） ７ １ ５
摘 要 ：采 用 摇 床 液 体 发 酵 试 验 ． 对 绿
பைடு நூலகம்
用 价 值 闭。纤 维 素 酶 的 生 产 有 固态 发
酵 和 液 体 发 酵 两 种 方 法 ： 固态 发 酵 劳 动 强 度 大 ，生 产 率 低 ，易 污 染 ， 而 液 体 发 酵 具 有 不 易 污 染 ，培 养 条 件 易 控 制 ，生 产 效 率 高 等 特 点 ， 因 而 适 合 大 规 模 工 业 化 生 产 。 但 目前 发 酵 液 酶
作 为 工 业 酶 解 发 酵 的 原 料 ，纤 维 素 酶 活 力 不 高 而 导 致 酶 用 量 过 大 是 限 制 其
优 良菌 种 性 能 、获 得 高 产 酶 量 ， 对 畜
牧 业 有 很 大 意 义 。 本 文 以 玉 米 秸 秆 为
主 要 原 料 ，研 究 了 产 纤 维 素 酶 菌 株 一
为 粗酶 液 。 １ － 酶 的 活性 测 定 －３ ３
的糖 化 有 酸 解 和 酶 解 法 等 。 酶 解 法 由 于 能 耗 低 ，反 应 条 件 温 和 以及 不 使 用 有 毒 和 腐 蚀 性 的 化 学 物 质 而 倍 受 青 睐 １ 然 而 至 今 未 能 应 用 木 质 纤 维 素 ３ １ 。
ｌ ０ ｍ ，ｐ ５ — ． ，碱 处 理 过 的 玉 米 Ｏ０ ｌ Ｈ ． ６ ５ ０ 秸 秆粉 １ ｇ ０。
活 性 偏 低 ，导 致 液 体 发 酵 生 产 的 纤 维
素 酶 产 品 价 格 偏 高 ． 限 制 了 其 在 工 业 中 的 应 用 。 因 此 ，选 育 一 株 适 合 液 体
绿色木霉Tr-A1固体发酵生产纤维素酶
绿色木霉Tr-A1固体发酵生产纤维素酶宋晓妍;孙彩云;张桂香;李强;矫强【摘要】Solid fermentation conditions for cellulase production were optimized by Trichoderma viride Tr-A1 using wheat bran and corn straw as the main substrate. The results show that the optimal culture conditions are wheat bran and corn straw in the ratio of 4:6 (muss fraction) ,5.0 of initial pH,10％(mass fraction) of inoculum size,28 ℃～30 ℃ of culture temperature,55％ (mass fraction) of initial water content of the culture medium and 72 h of culture time. The carboxy methyl cellulase (CMCase) activity is 72.5 U/g at the optimal conditions.%以麸皮和玉米秸粉为主要原料,采用固体发酵技术优化绿色木霉(Tr-A1)菌株固体发酵产纤维素酶的条件.结果表明:当麸皮和玉米秸粉的质量比为4∶ 6,接种量的质量分数为10%, 含水量的质量分数为55%,初始pH值为5.0,28 ℃～30 ℃固体培养72 h时,羧甲基纤维素(CMC)酶活可达到72.5 U/g.【期刊名称】《济南大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(025)003【总页数】4页(P265-268)【关键词】绿色木霉;固态发酵;纤维素酶【作者】宋晓妍;孙彩云;张桂香;李强;矫强【作者单位】济南大学,医学与生命科学学院,山东,济南,250022;山东大学,微生物技术国家重点实验室,山东,济南,250010;济南大学,医学与生命科学学院,山东,济南,250022;济南大学,医学与生命科学学院,山东,济南,250022;济南大学,医学与生命科学学院,山东,济南,250022【正文语种】中文【中图分类】Q939纤维素是自然界中分布最广且储量最丰富的一类可再生资源,一般占植物质量的35%～50%,全球每年可产生纤维素类干物质达 1011 t以上[1-2]。
绿色木霉RW-2纤维素酶的酶学性质研究
绿色木霉RW-2纤维素酶的酶学性质研究
武秀琴
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2009(000)011
【摘要】对由绿色木霉RW-2固态发酵产生的纤维素酶的主要酶学性质进行了研究.结果表明:纤维素酶在40℃和50℃时稳定性较好,当温度高于50℃后,酶的热稳定性显著降低:表面活性剂吐温-80在一定的范围内对纤维素酶有激活作用,最佳作用浓度为0.05%;金属离子K+、Ca2+纤维素酶呈现抑制作用:Cu2+、Zn2+对纤维素酶有激活作用;阴离子I-、CH3COO-对纤维素酶有明显的抑制作用.
【总页数】4页(P68-71)
【作者】武秀琴
【作者单位】河南工程学院,河南,郑州,451191
【正文语种】中文
【中图分类】Q556
【相关文献】
1.绿色木霉产纤维素酶菌种的优化及酶学性质研究 [J], 秦涛;李忠玲;张强;马齐
2.里氏木霉产纤维素酶的条件优化及酶学性质研究 [J], 钟桂芳;翟莉莉;樊攀;杨雪鹏
3.绿色木霉F-UV264产纤维素酶酶学性质研究 [J], 林英;曹松屹;曹冬煦;曹慧颖
4.黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵产纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 侯
红萍;杨盛
5.康氏木霉B—7纤维素酶的产生条件及酶学性质研究 [J], 王景林;吴东林
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绿色木霉固态发酵生产纤维素酶的研究
绿色木霉固态发酵生产纤维素酶的研究
武香玉;陈存社;张京;张颖;呼德
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2010(000)005
【摘要】以酒糟为原料,采用实验室分离的绿色木霉固态发酵生产纤维素酶,对发酵培养条件进行了优化.试验结果表明,在250mL三角瓶中加入酒糟与麸皮(7:3)5g,料水比(发酵料:营养盐液)为1:1,其中营养盐溶液pH值自然,黄豆面1.0%,接种1mL 孢子悬液,30%培养3d,CMCase和FPA分别达到7105.92U/g和1463.97U/g.【总页数】4页(P93-96)
【作者】武香玉;陈存社;张京;张颖;呼德
【作者单位】北京工商大学,化学与环境工程学院,北京,100048;北京工商大学,化学与环境工程学院,北京,100048;北京工商大学,化学与环境工程学院,北京,100048;北京工商大学,化学与环境工程学院,北京,100048;北京工商大学,化学与环境工程学院,北京,100048
【正文语种】中文
【中图分类】TQ925
【相关文献】
1.绿色木霉固态发酵啤酒糟生产纤维素酶的研究 [J], 林建国;胡瑛;王常高;蔡俊
2.绿色木霉在稻壳和麸皮混合基质上固态发酵生产纤维素酶的研究 [J], 陈书峰;赵亮;刘德华
3.绿色木霉95106固态发酵生产纤维素酶条件优化研究 [J], 阚国仕;陈春;陈红漫;毕菲
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5.压力脉动固态发酵绿色木霉SD-10生产纤维素酶的研究 [J], 杨革;陈洪章;刘艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
绿色木霉固态发酵啤酒糟生产纤维素酶的研究
酶 活 单 位 定 义 ： 上 述 反 应 条 件 下 ，1min 水 解 底 物 生成1μg葡萄糖的酶量定义为1个酶活单位， 换算成 每克干物料含有的酶活，以u/g(干物质)表示。 1.6 数据处理与统计分析
啤酒糟是啤酒生产中最主要的副产物， 啤酒糟 的 处 理 已 成 为 各 个 啤 酒 厂 家 面 临 的 重 大 难 题 之 一 [1]。 啤酒糟的主要成分是麦芽壳和未糖化的麦芽， 这些 物质含有大量的纤维素， 而纤维素是纤维素酶的诱 导物， 而且啤酒糟中含有一定量的含氮化合物和多 种无机元素及维生素，质地疏松，是固态发酵生产纤 维素酶的优良基质[2,3]。 能产生纤维素酶的微生物有 细菌、青霉、曲霉和木霉等真菌，其中绿色木霉是产 纤维素酶的重要菌株[4]。
件进行了优化。 实验结果表明，发酵培养基组分为：500 mL三角瓶中装入啤酒糟和麸皮30 g，配料比8：2，料水比1：
1.5，在30℃发酵66 h，滤纸酶活和羧甲基纤维素酶活分别达到577.0±4.1 u/g和9818.9±4.2 u/g (干物质)；而在含氮量
相等的条件下，实验所添加的几种无机氮对酶活影响不显著。
啤酒糟与麸皮的比例
FPA/u/g
CMCase/u/g
10∶0
45.9±2.1
260.6±7.3
9∶1
252.4±7.2
5023.7±6.2
8∶2
542.5±8.1
9597.0±11.7
7∶3
537.3±6.2
9459.6±11.4
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草地畜牧业绿色木霉固态发酵产纤维素酶 活力的研究 王仪明1,张宗舟1,2,蔺海明1,孙小弟3,雷艳芳1,王东明4(1.甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070;2.天水师范学院生命科学与化学学院,甘肃天水741001;3.天水师范学院工学院,甘肃天水741000;4.甘肃省科学院自动化研究所,甘肃兰州730000)摘要:以麦秆和麸皮为主要原料,通过正交试验和单因素试验优化绿色木霉T richderma v iride固态发酵产纤维素酶的最佳工艺条件,并研究绿色木霉对小麦秸秆纤维素降解的影响,为绿色木霉降解小麦秸秆纤维素提供最佳条件,进而提高小麦秸秆的利用率。
结果表明,不同条件下绿色木霉产纤维素酶活力存在显著差异(P<0.05),最佳培养基为:氮源为(N H4)2SO4,pH值5.5,含水量为200%,麦秆∶麸皮质量比为4∶1;最佳发酵条件为:培养时间为96h、温度35℃、初始pH值6.0、含氮量0.4%、接种量15%,培养方式为半密闭;发酵后小麦秸秆中中性洗涤纤维(N DF)、酸性洗涤纤维(AD F)、纤维素含量和半纤维素含量比发酵前分别下降5.22%、6.88%、4.73%和4.16%,木质素含量无明显变化。
关键词:绿色木霉;发酶条件;纤维素酶活;小麦秸秆;纤维素中图分类号:T Q925.9 文献标识码:A 文章编号:1001-0629(2009)05-0123-05 纤维素类物质是世界上最丰富的可再生资源[1]。
纤维素材料可转化为具有商业价值的乙醇、乙酸、单细胞蛋白等纤维素的产品[2-3]。
纤维素的生物转化近些年受到了极大的重视,大规模纤维素生物转化工艺的发展,将有效解决食品和动物饲料不足的问题[4-6]。
利用微生物所产生的纤维素酶将秸秆转化为营养价值较高的单细胞蛋白饲料倍受人们的青睐[7]。
纤维素酶作为一种高活性生物催化剂使其成为研究新型蛋白饲料开发与利用的重要内容[7-8]。
纤维素酶不是一个单种酶,而是参与纤维素降解的多组分酶的总称,一个完整的纤维素酶系,通常由作用方式不同而能相互协同催化水解纤维素的3类酶组成:内切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(EX)和β-葡萄糖苷酶(BG),在分解纤维素时,任何一种酶都不能单独裂解纤维素,只有3种酶共同存在并协同作用才能完成水解过程[9]。
目前,用于研究生产纤维素酶的真菌大多数属于曲霉属Aspergillus、木霉属Trichderma、青霉属Penicillum、根霉属Rhizopus等。
曲霉和根霉产β-葡萄糖苷酶活性较高,而在天然纤维素降解中起重要作用的β-葡聚糖纤维二糖水解酶活力较低[10]。
木霉菌株是公认产纤维素酶最高的菌种之一[11]。
因此,研究绿色木霉T.v iride 的培养条件及其对纤维素酶活的影响为纤维素酶的工业化生产奠定一些试验基础,为更好地利用秸秆开辟新的途径。
研究以麦秆和麸皮为主要原料,通过正交试验和单因素试验对绿色木霉固态发酵产纤维素酶的最佳培养基组分、时间、最适温度、pH值、接种量和含氮量等工艺条件进行优化,并比较发酵前后小麦秸秆的化学成分,研究绿色木霉对小麦秸秆纤维素降解的影响,为绿色木霉降解秸秆生产蛋白饲料提供最佳条件。
这对提高秸秆的利用率和缓解我国高蛋白饲料严重紧缺的局面起到重要的促进作用。
1 材料与方法1.1试验材料小麦秸秆粉(当地农户提供,粉碎过40目筛),麸皮(市售)。
26卷5期V ol.26.No.5草 业 科 学P RA T ACU L T U RA L SCI ENCE123-1275/2009＊收稿日期:2008-09-01基金项目:国家科技支撑计划“西北内陆灌区农田循环生产技术集成研究与示范”(2007BAD89B17)作者简介:王仪明(1981-),男,甘肃天水人,硕士,研究方向为纤维素降解及蛋白饲料生产。
通信作者:张宗舟绿色木霉由天水师范学院微生物实验室提供,保存于PDA斜面培养基。
1.1.1主要试剂 DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸显色液);0.05mol/L pH值4.5和pH值5.0的柠檬酸缓冲液;质量分数0.5%水杨酸苷溶液;质量分数0.51%羧甲基纤维素钠(CMC)溶液;中性洗涤剂;酸性洗涤剂。
1.1.2培养基斜面培养基:将孢子接种于斜面培养基,35℃培养,待形成一层灰绿色孢子后4℃保藏备用。
种子培养基:小麦秸秆粉10g,营养液[质量分数2%(NH4)2SO4,质量分数0.08%M gSO4·7H2O,质量分数0.04%KH2PO4]25m L。
固体产酶培养基:麦秆6g,麸皮4g,营养液[2.0%(NH4)2SO4,0.08%Mg SO4·7H2O, 0.04%KH2PO4]25m L。
上述培养基均需在1.0×105Pa,121℃灭菌30min,pH值自然。
1.2酶液的制备 取生长良好的固体发酵曲5 g,加水50m L,于30℃保温1h,用沙芯漏斗过滤,然后在转速10000r/min冷冻离心机上离心10min,提取上清液定容至100m L,得到体积比为1∶20粗酶液。
1.3试验方法 葡萄糖酶活力采用标准曲线确定[12];纤维素酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)[13];中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的测定采用范式(Van So-est)法[14];优化培养基采用L16(44)正交设计[15],进行4因素(pH值、氮源、含水量、麦秆∶麸皮)4水平的正交试验,共16个组合(见表1);秸秆发酵前后成分的测定均采用3次重复试验。
1.4数据处理 利用Excel和SAS9.0软件做方差分析。
表1 培养基正交试验因素和水平设计组合pH值氮源含水量麦秆∶麸皮14.5(N H4)2SO4150%2∶325.5(N H4)3PO4200%3∶236.5CO(N H2)2250%4∶147.0N H4Cl300%5∶02 结果分析2.1正交试验筛选绿色木霉的最佳培养基 培养基组分对纤维素酶的形成有很大影响,方差分析结果表明,不同培养基对绿色木霉产纤维素酶的影响存在显著差异(P<0.05)。
氮源为(NH4)2SO4,含水量为200%,pH值5.5,麦秆∶麸皮为4∶1,绿色木霉产β-葡萄糖苷酶、FPU 酶和CM C酶活力最大,分别为1.31、0.39和5.92U/m g;氮源为(NH4)3PO4,含水量为150%,pH值5.5,麦秆∶麸皮为5∶0,绿色木霉产C1酶活力最大,为1.40U/m g。
通过新复极差分析发现(NH4)2SO4作为绿色木霉发酵的氮源较好(图1)。
图1 不同处理组合对纤维素酶活力的影响2.2单因素试验优化绿色木霉的发酵条件2.2.1培养时间对纤维素酶活力的影响 不同培养时间影响绿色木酶产纤维素酶活力,在96h绿色木霉产4种纤维素酶活力达到最大,随后下降。
产C1酶活力最大为3.06U/mg,产CMC酶活力最大为2.44U/mg,产β-葡萄糖苷酶活力最大为0.39 U/mg,FPU酶活力最大为0.05U/mg(图2)。
2.2.2培养温度对纤维素酶活力的影响 经不同温度培养结果表明,在25℃条件下培养,酶活力随温度的升高而增大,一定温度时酶活力达到最大,在35℃产纤维素酶活力较高,随后酶活力下降。
产C1酶活力最大为2.38U/mg,产CM C酶活力最大为1.97U/mg,FPU酶活力最大为0.47 U/m g,产β-葡萄糖苷酶活力最大为0.32U/m g (图3)。
124P RA T AC U LT U RA L SCIENCE(Vo l.26.N o.5)5/2009图2 培养时间对纤维素酶活力的影响图3 培养温度对纤维素酶活力的影响2.2.3培养基初始pH 值对纤维素酶活力的影响 试验从pH 值为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.57个水平中筛选出最适产纤维素酶的pH 值。
结果表明,pH 值5.5时CMC 酶活力最大,为5.5U /mg ;pH 值6.0时FPU 酶、β-葡萄糖苷酶和C1酶活力最大,分别为0.42、0.32和3.51U /mg (图4)。
图4 不同pH 值对纤维素酶活力的影响2.2.4接种量对纤维素酶活力的影响 按接种量质量分数5%、10%、15%、20%、25%和30%接种于麦秆∶麸皮质量比为4∶1的固体培养基中发酵。
接种量为15%时酶活力最高(图5)。
图5 不同接种对纤维素酶活力的影响2.2.5含氮量对纤维素酶活力的影响 改变营养液中氮的含量,在0.2%～1.6%内测定纤维素酶活力,接种后35℃培养96h ,发现纤维素酶活力随含氮量的增加逐渐增大,当含氮量在0.4%酶活力较高,随后逐渐下降(图6)。
图6 不同含氮量对纤维素酶活力的影响2.2.6培养方式对纤维素酶活力的影响 在氮源为(N H 4)2SO 4,含水量为200%,pH 值为5.5,麦秆∶麸皮为4∶1,含氮量0.4%的固体基质上,在接种量为15%,温度35℃,分别选择密闭和半密闭的方式培养96h ,测定纤维素酶活力。
结果表明,半密闭条件下培养,营养生长旺盛,产纤维素酶活力较大(表2)。
1255/2009草 业 科 学(第26卷5期)表2 培养方式对纤维素酶活力的影响 U/mg培养方式FP Uβ-glua se CM C C1密闭0.310.182.132.98半密闭0.420.253.263.46 注:密闭———保鲜膜封口,半密闭———麻纸封口。
2.3绿色木霉发酵对秸秆纤维素的影响 在最佳条件下用绿色木霉发酵秸秆与未发酵的秸秆相比,发酵后秸秆的成分有不同程度的变化, NDF、ADF、纤维素和半纤维素含量分别为4.73%、4.16%、5.22%和6.88%,木质素含量无明显变化(表3)。
表3 发酵对秸秆纤维素的影响%秸秆成分发酵前发酵后降解率纤维素 53.650.85.22半纤维素18.917.46.88木质素 18.518.31.08ND F 91.086.74.73AD F 72.169.14.163 讨论3.1纤维素酶是一种诱导酶,在发酵过程中,纤维素酶的大量合成必须有诱导物的作用,在培养和发酵过程中加入适当的诱导物可以增加酶的产量。
麸皮富含微量生长因子或诱导物和纤维素等碳源物质,这些物质促进菌体的营养生长,比秸秆纤维素更易诱导菌种纤维素酶的产生[16]。
本试验选择麦秆∶麸皮为4∶1。
底物含水量的变化对微生物的生长及代谢能力有重要影响,含水量太小,物料容易因水分蒸发而变干,含水量太大,造成环境缺氧,影响菌体生长。
本试验采用200%的含水量有利于菌体生长。
3.2一般菌种生长的最适pH值与产酶的最适pH值不一致,发酵产纤维素酶过程中pH值变化总趋势是不断下降,pH值较小既适于产酶也能使已产生的酶失活。