一步法构建同源重组载体

一步法构建同源重组载体

王海艳

（中国农业大学）

同源重组载体构建需要分别克隆目的片段两端的同源臂（长度~1kb），并与Marker基因进行连接。传统的构建方法是两段同源臂分别克隆构建到目的载体，

费时费力。在本例中，本人已经成功应用汉恒生物科技（上海）有限公司的

HB-Infusion TM无缝克隆试剂盒，将同源臂及Marker基因一步成功构建到载体上，

现将实验过程及结果分享如下：

1. 目的片段引物的设计

用NEB builder（https:///watch?v=8_-t5xtJ3y8），或snapgene，genome compiler等软件，将三个目的片段的基因序列、线性化载体的基因序列按照软件使用说明依

次填入，将自动生成所需要的引物序列（如下表）。将引物提交华大基因进行合成。

引物序列列表

Primers Seq Tm GC(%) Len Fragment dDNA-P1 attgggtaccgggccctctagATATACTCGACAGGGCCCGC 73.5 61 41

3'-flank dDNA-P2 gtcactgtacGTGTGGCATTGCCCAGTCA 64.3 55 29

dDNA-P3 aatgccacacGTACAGTGACCGGTGACTCTTTCTG 66.8 51 35

5’-flank dDNA-P4 atcggtgcTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG 65.7 59 29

dDNA-P5 atctccactcgaGCACCGATGTCGCCACGC 68.5 63 30 Marker

fragment dDNA-P6 aagggaacaaaagctggagctGTAGTAGAGAACTTGGACTTCGGCG 70.8 50 46

2. 目的片段的扩增

反应体系

DNA(248ng/μL) 1 μL

Forward Primer (10μM) 2 μL

Reverse Primer(10μM) 2 μL

ExTaq premix 25 μL

DDW 20 μL

Total 50 μL

（注：此步反应中的酶最好用高保真酶，以免产物出现错配）PCR反应程序

95℃ 4 min

95℃30 s

65℃30 s

72℃1~2.5 min

72℃10 min

将扩增到的PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳后，进行胶回收并用Nanodrop 测量核酸浓度。

图1. 三个目的片段凝胶电泳结果

3. 载体的线性化

酶切：

34cycles

Plasmid 2 μg SacI 2 μL XbaI 2 μL 10×M b μffer 5 μL DDW 39 μL Total

50 μL

37℃酶切4h 后，用1%凝胶电泳进行分析，并用Axygen 凝胶回收试剂盒进行胶回收。

图2. 载体酶切及胶回收实验结果

A ：质粒；

B ：质粒酶切产物；

C ：目的片段胶回收产物。

4. 冰上融化并且充分混匀HB-inf μsion TM Master mix ，配制反应体系

将各个片段按照说明书的要求计算用量并配制反应体系，如下表所示：

片段

碱基对数

（bp ）

浓度

（ng/μL) OD260/280 所需mol 数

所需质量

（ng ） 所需体积

(μL) 3'-flank 1000 129.5 1.84 0.2 130.00 1.00 5’-flank 1000 141.4 1.89 0.2 130.00 0.92 Marker fragment 2518 184.9 1.88 0.2 327.34 1.77 Lineared vector 2875 95.2 1.85 0.1 186.88 1.96 HB-inf μsion MIX 10 DDW 4.34 Total

20

5. 将上述反应体系置于50℃孵育60min 。

6. 转化感受态大肠杆菌 1) 在冰上融化一支50 μL 的DH5α感受态菌。

2)

取20 μL 反应样品加入融化好的感受态菌中，轻轻混匀，将该混合物至

于冰上30 min 3) 放入42℃金属浴中热激90s ，迅速放入冰中静置5 min

4)

在超净工作台中，向上述管中加入1 mL LB （不含抗生素），然后固定到

摇床上37℃震荡1 h ，摇床转速180 rpm 。 5)

在超净工作台中，取上述转化混合液200 μL ，滴到含有Amp+抗性的LB

固体平板上，用酒精灯烧过的涂布棒将液滴涂布均匀，37℃恒温箱中倒置培养过夜。 6) 挑取平板上的单克隆，用载体上的引物M13F/M13R 对目的片段进行扩

增。 7)

用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，实验结果如图。

8)

将5号转化子提交华大生物科技有限公司进行测序。结果表明重组片段

的序列与目的序列信息一致。

图3. 菌落PCR 试验结果