玉米基因组DNA不同提取方法及提取部位的比较研究
玉米基因组DNA不同提取方法及提取部位的比较研究
量 对后 续试 验 结 果 有 较 大 的 影 响 ， 因此 合 适 的 Ｄ ＮＡ提
取方法非常重要。 目前用于制备基因组Ｄ Ｎ Ａ的方法很多，
法等 Ｊ 。 对于 玉米 来讲 ， 不 同部 位 的材料 、 不 同提取 方 法 ， Ｄ Ｎ Ａ 的 得率 不 同 。适 宜 的 Ｄ Ｎ Ａ提 取 方 法不 仅 能 够获 得
农 业 与 技 术
２ ０ １ ６ ， Ｖ ｏ Ｌ ３ ６ ， Ｎ ｏ ． ２ ３ ３ ，
３ ０ ２ ０ １ ６ ， Ｖ ｏ １ ． ３ ６ ， Ｎ ｏ ． ２ ３
农 业 与 技 术
※农业科学
玉米基 因组 Ｄ ＮＡ不 同提取 方法及提取 部位 的 比较研 究
楚 海娇
（ 吉林 农业科技 学院 生物 工程 学 院， 吉林 吉林 １ ３ ２ １ ０ １ ）
摘 要 ：分别 探 讨 Ｃ Ｔ ＡＢ 法和 Ｓ Ｄ Ｓ法对 玉 米 不 同部位 基 因 组 Ｄ ＮＡ 的提 取 效果 。 综合 比较 了 ２种 方 法提 取 的 Ｄ Ｎ Ａ
０ ． ３ ｇ 玉 米 材 料 液 氮 中研 磨 ・加 入 Ｃ Ｔ Ａ Ｂ提 取 液 ８ ０ ０ ｕ Ｌ一 ６ ５ ℃水浴 中提取 一有机溶剂 抽提 ２ 次 一 无 水
总Ｄ Ｎ Ａ 的提 取是 研 究植 物 Ｄ Ｎ Ａ 的结 构 和功 能 ，开 展外 源Ｄ Ｎ Ａ 转 化 和 转导 的前 提 。玉 米 是 重要 的粮 食 和 饲 料 作 物 】 。 目前 ， 国内外 已开 展 了大 量 的 玉米 分 子 生物 学 研 究和 基 因组 学 研 究 。研 究玉 米 基 因 的结 构 与功 能 ，发 现具 有 目标 性 状 的 基 因资 源 ，探 明基 因位 点 与效 应 ，可 解决 一 些 育种 问题 ； 同时 通过 转 基 因 育种 的使 用 ，可 实 现物 种 之 间跨越 。 进行 玉 米 生物 技 术研 究 的基 础 是 大量 高 质量 、高纯
四种提取方法提取玉米基因组的比较
四种提取方法提取玉米基因组的比较作者：周岩王博童文康等来源：《农业开发与装备》 2017年第12期摘要：对改良CTAB法、N-月桂酰肌氨酸钠法、改良SDS法，以及试剂盒法四种方法提取玉米基因组进行对比，确定最适鉴定方法。
紫外和琼脂糖凝胶电泳分析结果表明N-月桂酰肌氨酸钠法操作简单，提取DNA浓度及纯度均最好，并且适用于下一步PCR分子鉴定。
关键词：玉米；基因组；鉴定0 引言为了满足分子生物学研究中PCR检测对植物基因组的需求，根据研究目的不同，对DNA提取的要求也不尽相同。
因此，取得高纯度DNA是提高研究效率的关键。
目前植物基因组的提取有很多，如CTAB法、SDS法、高盐等方法，但是对于不同植物来讲，不同提取方法DNA得率不同。
所以，探索快速，经济有效的DNA提取方法尤为重要[1]。
本研究以玉米叶片为材料，通过比较不同的改良，确定最佳的玉米基因组提取方法，为玉米的大量分子生物学研究及转基因检测提供有效手段。
1 材料1.1 试验材料玉米（吉科3536），由吉林农业科技学院植物科学学院提供。
1.2 主要试剂Dzup（植物）基因组DNA快速抽提试剂盒购于上海生工生物工厂有限公司；DL15000 DNA Marker购于宝生物大连生物工程公司；其他生化试剂和常规试剂均为分析纯。
2 方法2.1 改良CTAB法取0.2g玉米叶，液氮研磨加入800μL预热的CTAB提取液中（100mmol/LTris-HCl，pH值为8.0；20mmol/LEDTA，pH值为8.0；1.4mmol/LNaCl；CTAB2%（W/V）；5%（W/V）PVP；β-巯基乙醇0.1%（V/V））混匀，60℃水浴60min。
12 000r/min离心10min，上清加等体积的氯仿/异戊醇（24：1），静置10min，12 000r/min离心10min。
上清加2倍体积冷95%乙醇，-20℃沉淀30min。
12000r/min离心10min，400μL70%乙醇洗涤沉淀，50μLTE溶解[2]。
玉米种子DNA快速提取及杂交种纯度的快速鉴定ARapidMethodofDNA
分子植物育种，2009年，第7卷，第4期，第811-816页Molecular Plant Breeding,2009,Vol.7,No.4,811-816新思路、新技术、新方法Novel Thinking &Technology玉米种子DNA 快速提取及杂交种纯度的快速鉴定谭君杨俊品*四川省农业科学院作物研究所,国家玉米改良中心成都分中心,成都,610066*通讯作者,****************摘要本研究用玉米杂交种渝单8号及其双亲的干种子作为材料，使用NaOH 溶液研磨玉米种子胚，提取基因组DNA ，并利用多重PCR 扩增进行玉米杂交种子的纯度鉴定。
结果表明，利用玉米种子快速提取方法获得的DNA 可进行正常的SSR 扩增，并且从20对玉米核心引物中筛选出了8对扩增谱带呈双亲互补型的引物，将其中3对引物YISSR 、phi072和phi299852组合起来扩增，扩增谱带清晰可辨，对渝单8号杂交种子的纯度进行准确鉴定。
初步表明利用多重PCR 技术鉴定玉米种子纯度是可行的，不仅简便快速，而且降低了检测成本。
关键词玉米种子,DNA 提取,SSR,纯度鉴定A Rapid Method of DNA Extraction from Maize Seeds and Purity Identifi-cation of Maize HybridsTan Jun Yang Junpin *Chengdu National Corn Improvement Sub-center,Crop Institute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu,610066*Corresponding author,****************DOI:10.3969/mpb.007.000811Abstract A rapid DNA extraction method of genome DNA from maize seeds was established in this study.Dryseeds of Yudan8and its parents were adopted as testing materials,NaOH solution was used as an abrasive for breaking embryo,and multiplex PCR amplification was made use of purity identification of maize hybrids.Test re-sults showed that the resultant DNA was very suitable for SSR.And the core of corn from 20primers were screened out of eight pairs of parents were amplified bands primers complementary.Eight pairs of primers which could make the amplified bands of parents complementary were screened out of 20maize core primers,and three primers of which (YISSR,phi072and phi299852)were combined together to amplify and identify the purity of maize hybrids Yudan8.The amplified bands were clear and discernible.The results preliminarily indicated it is feasible,simple and effective,and expenditure-saving in maize hybrids identification.Keywords Maize seed,DNA extraction,SSR,Purity identification/doi/10.3969/mpb.007.000811基金项目：本研究由国家863计划(2006AA100103;2007AA10Z172-S)、国家科技支撑计划(2006BAD01A03;2006BAD13B03)、农业部转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08003-001)、北京农业育种基础研究创新平台项目(YZPT02-06)、四川省科技支撑计划(2008NZ0004)、四川省国际合作项目(2007HH021)、四川省农作物育种攻关项目和四川省农科院青年科技基金项目共同资助SSR 标记具有快速、准确，信息含量高、呈共显性遗传、易于分析和重复可靠等特点，因此，自1989年该技术产生以来，已被广泛应用于玉米基因定位和QTL 分析(刘福霞等,2005;李凌雨等,2005;杨华等,2005,科学通报,50(8):772-776)、玉米品种DNA 指纹图谱构建(吴渝生等,2003;王凤格等,2003;李晓辉等,2005)、自交系遗传多样性分析(李新海等,2003;王凤格等,2005;聂永心等,2005;肖木辑等,2006;Yao et al.,2007;陈发波等,2007)和分子标记辅助育种等(田清震等,2004;杨华等,2005,科学通报,50(8):分子植物育种Molecular Plant Breeding772-776)。
玉米种子纯度鉴定中DNA提取方法的比较研究
关键词 ： 玉米杂交种 ； Ｎ Ｄ Ａ提取 ； 纯度 ；Ｓ Ｓ Ｒ分 子标记
中 图分 类 号 ：７ １ Ｑ ８ 文献标识号 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ １ ４ ４ （０ １０ ０ ０ ０ １０ － ９２ ２ １ ）９－０ ７－ ３
Ｃｏ ｐ ｒｓ ｎ ｏ ｍ ａ ｉｏ ｆＤＮＡ ｔ ａ ｔｏ ｅ ｈ ｄ ｏ ｒｔ Ｅｘ ｒ ｃ ｉ ｎ Ｍ ｔ ｏ ｓ ｆ ｒ Ｐｕ ｉｙ Ｉ ｅ ｔｆｃ ｔｏ ｆＭ ａ ｚ ｅ ｄ ｄ ｎ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｉｅ Ｓ ｅ ｓ ｉ
．
（ 山西省农 业科 学院食用菌研究所 ， 山西 太原 ， ３０ １ ００３ ）
摘
要： 分别 以玉米干种子胚 、 幼芽 和幼苗 为材料 提取 Ｄ Ａ， Ｎ 并对所 得 Ｄ Ａ的纯度 和质量进行 检测 ， Ｎ 结
果 显示 ， 用玉米干种子胚 提取 的 Ｄ Ａ质量及分 子量大小 与幼苗 法相当 ， 利 Ｎ 完全可 以满 足 ＳＲ分子标记 对玉 Ｓ
Ｙ Ｎ Ｍｉ ｅ ＸＵ Ｊ ｇ ＰＡ ｕ —ｂｎ Ｙ Ａ ｉ —ｍｉ，Ｌ ｕ—ｌ ｇ Ｚ Ａ Ｇ Ｊｎ— ｉ Ａ —ｇ ， ｉ ， Ｉ Ｎ Ｙ ｅ ｉ ， Ｕ Ｎ Ｊ ｎ ａ ｎ Ｉ Ｓ ｉ ， Ｈ Ｎ ｕ ｊ ｎ ｅ
（ ｄｂ ｕ ｇ ｅ ａｃ ｎｔｕ ，ｈｎ ｉ ｃｄ ｍ ｇｉ ｌ ｒｌ ｃ ｎｅ，ａｙａ ３ ０ １ ｈｎ ） Ｅ ｉｅＦ ｎｉ ｓ ｒ Ｉｓｔ ｅＳ ａｘ ａ ｅ ｙｏ ｒ ｕ ｕａ ｉ ｃ Ｔｉｕ ｎ００ ３ ，Ｃ ｉａ ｌ Ｒｅ ｈ ｉｔ Ａ ｆＡ ｃ ｔ Ｓ ｅ ｓ
目前 ，Ｓ 分 子标 记 技 术 已广 泛 应 用 于 品种 ＳＲ
１ 材 料 与 方 法 １１ 供 试 材 料 ．
玉米种子基因组DNA提取及RAPD分析
玉米种子基因组DNA 提取及RAPD 分析Ξ徐其放1,朱苏文2,常 弘1(1.中山大学生命科学学院,广东广州510275;2.安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036)摘 要:采用了两种不同DNA 提取方法(常规法及改进法)从玉米Zea mays 种子的胚和胚乳中分别提取基因组。
结果表明,在两种不同的提取方法中,改进法比常规法有提取的DNA 纯度高、RNA 含量少、DNA 降解少等优点。
无论从胚和胚乳中提取的DNA 都可以满足RAPD 的要求。
为玉米RAPD ,分子标记,品质鉴定等研究提供可行的依据。
关键词:玉米;胚;胚乳;基因组;RAPD 中图分类号:Q503 文献标识码:A 文章编号:052926579(2003)0520078204 RAPD (Random Am plified ploym orphic DNA )技术是1990年由William 和Welsh 等发展的一种分子生物学技术,在此前国内外对玉米Z ea mays 自交系和杂交系的室内鉴定工作主要是利用蛋白质及同工酶电泳方法,而RAPD 技术测定是特定的DNA 片段,对于一个特定的基因型来说,这些扩增的片段是唯一的,所以用RAPD 技术来鉴定玉米自交系及杂交种的纯度及真伪有很强的优势,因此它被迅速用于品质鉴定[1]、分子标记、转基因分析及克隆等生物技术领域里。
本实验就是探讨从玉米种子中提取基因组DNA 及用于RAPD 分析,而不同于一般方法的从植株中提取基因组DNA 。
因为从种子中提取DNA 快速,不用等待其萌发,甚至长出子叶,这样就可以随时对其进行DNA 提取作相关的研究。
而且实验又从种子胚乳中提取基因组DNA ,不破坏种子胚,直接切取种子胚乳部分,这样没有受到损伤的种子胚仍可以发芽,长出植株。
1 材料与方法111 材 料以玉米种子(L 173)用做实验材料,分别取种子的胚及胚乳两个不同的部分进行。
112 实验仪器及试剂DNA 提取液(100mm ol ΠL Tris-HCl ,100mm ol ΠL E DT A ,500mm ol ΠL NaCl ,ρ=115%S DS ),氯仿,无水乙醇,φ=70%乙醇,TE (含RNA 酶),PCR 反应体系(bu ffer ,T aq 酶,dNTPs ,MgCl 2,primers ,DNA 模板,无菌水),移液枪(20,200,1000μL ),电泳仪,PCR 扩增仪(HE M A 4800),离心机,冰箱,水浴锅。
转基因玉米植株幼叶DNA快速提取及降落PCR检测研究
转基因玉米植株幼叶DNA快速提取及降落PCR检测研究尹祥佳;李永生;王汉宁【摘要】用农杆菌介导玉米自交系‘掖478’茎尖遗传转化的转基因玉米植株幼叶为材料,进行快速提取玉米叶片DNA方法的研究.在室温下取2cm2大小的玉米叶片,将叶片剪碎置于2.0mL离心管中,液氮处理后使用组织研磨器研磨,然后加入800 μL CTAB提取液,24∶1的氯仿∶异戊醇溶液800 μL,轻摇10 min后于10 000 r/min离心5min,取上清,最后用0.7倍体积冰异丙醇沉淀DNA.应用降落PCR 进行目的基因片段的扩增,并对结果进行测序验证.结果表明,该方法操作简单,省时省力,节约成本,效率高,降落PCR扩增目的基因条带清晰,测序结果与原序列一致.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2012(047)001【总页数】5页(P64-68)【关键词】玉米;转基因植株;幼叶;DNA提取;降落PCR【作者】尹祥佳;李永生;王汉宁【作者单位】甘肃农业大学农学院,甘肃兰州 730070;中国农业科学院作物科学研究所,北京 100081;甘肃农业大学农学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学农学院,甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q78聚合酶链式反应、分子克隆及DNA序列分析三位一体的试验方法是现代分子生物学试验的工作基础［1］.自从 Mullis等［2－5］发明 DNA 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术以来，该技术极大地促进了生物工程技术的发展，特别是在植物基因工程中，由于植物转基因技术的成熟，转基因再生株系初步快速分子检测已成为转基因植株鉴定的重要环节.PCR反应是转基因植株分子检测常用的方法之一.在PCR反应中有一种比较特殊的降落PCR反应［6］，其基本的原理是［7］：根据引物的Tm值，设置一系列从高至低的退火温度，开始选择的退火温度高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降低至Tm 值，从而确保第1个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，并最终低于Tm值.应用降落PCR来快速检测玉米转基因植株是可行的.在PCR检测玉米（Zea mays）转基因植株的过程中，玉米幼叶DNA的快速提取是最基本而且是很重要的环节.研究表明，目前已建立的植物幼叶DNA 提取方法主要有 CTAB 法和 SDS法［8－11］，但是这2种方法都存在一定的缺点，CTAB法具操作步骤复杂、耗时较长、研磨时需要消耗大量液氮、研磨不均匀等缺点；SDS法难以除净多糖或次生物质，由于玉米叶片中酚类化合物、多糖或次生物质含量较多，这些物质严重影响后续分子生物学试验的顺利进行.因此，本文在CTAB法提玉米幼叶DNA的基础上做了些改进，并结合使用高通量组织研磨器，建立了一种玉米幼叶DNA快速提取的方法，该方法操作简单，省时省力，节约成本.用此方法快速提取出了经过农杆菌介导遗传转化的玉米自交系‘掖478’转化植株幼叶的基因组DNA，根据所转目的基因序列设计了特异性检测引物，采用降落PCR检测了转基因玉米植株，并进行了测序验证.1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 材料用农杆菌介导玉米自交系‘掖478’转化PKR基因的24株转化植株，取植株3～4叶期的幼叶为试验材料.1.1.2 试剂与仪器主要试剂：Trans 2Kplus DNA Marker、Taq聚合酶等购自大连宝生物工程公司；RnaseA酶购自上海生物工程公司；PCR引物由北京奥科公司合成；其他试剂均为国产分析纯.主要仪器有：PCR 仪（PTC－200Peltier Thermal Cycler）、高速冷冻离心机（Eppendorf Centrifuge 5810R）、高通量组织研磨器（Geno/Grinder 2010）、DNA 浓度测定仪（NANODROP 2000Spectrophometer）、恒温水浴锅、电泳仪和紫外凝胶成像系统等.1.2 试验方法1.2.1 玉米叶片DNA的快速提取取待检测的24株转化植株3～4叶期的幼叶2cm2，将新鲜叶片剪碎装入2.0mL Eppendorf管中，每个离心管中放入直径2mm钢珠1粒后置于冰盒中.将装入样品的2.0mL Eppendorf管放入液氮中冷冻2min后迅速放入组织研磨器支架孔中，盖上底盖和上盖.1次装2个支架，每个支架可放40只离心管，调整组织研磨器的振速，50Hz频率振荡30s.取出离心管在通风橱中加入800μL 65℃预热CTAB提取液（83.5mmol/L Tris－7.5，1.175mol/L NaCL，16.7 mmol/L EDTA－8.0，1.67%CTAB，1%BME）在65℃水浴锅中放置10min后于通风橱中加入氯仿∶异戊醇（24∶1溶液）800μL，混匀，室温下在摇床上轻摇10min；10 000r/min离心5min取上清液于1.5mL Eppendorf管中，加入0.7倍体积上清的冰异丙醇，沉淀DNA；12 000r/min离心3min，弃上清，加入600μL70%乙醇洗涤后12 000r/min离心2min，弃上清，离心管开口朝下放置，室温晾干；加入50μL ddH2O溶解DNA后加入1μL RnaseA酶置于37℃水浴锅，30min后用于后续检测.1.2.2 玉米幼叶DNA浓度和纯度的测定用DNA浓度测定仪（NANODROP2000Spectrophometer）分别测定提取DNA样品的浓度和纯度.1.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量取10μL DNA溶液，加5μL上样缓冲液，在1%琼脂糖凝胶上电泳，用Trans 2Kplus DNA Marker，凝胶用溴化乙锭染色，在紫外凝胶成像系统下观察电泳结果.1.2.4 降落PCR检测转基因植株用提取的玉米幼叶DNA为模板，载体质粒DNA 为阳性对照、非转化植株DNA和水做阴性对照，根据Primer Premier 5软件设计特异性引物，上游引物为：P1：5′－CGCAGCCAAATTAGCTGTTGC－3′；下游引物为：P2：5′－CCATCCCGTAGGTCTGTGAA－3′，做降落PCR扩增检测，扩增目的基因片段大小为1 300bp.采用20μL的反应体系进行降落PCR扩增，体系中含有1.0μL试验提取的DNA、2.0μL 10×Buffer、2.0μL dNTP （2.5mMeach）、0.3μLTaq、2×0.5μLPrimer （10uMeach）、13.7μLddH2O.扩增程序为94℃模板DNA预变性5min；94℃模板DNA变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，4个循环；94℃模板DNA变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，4个循环；94℃模板DNA变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，8个循环；94℃模板DNA变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，24个循环；最后72℃延伸12min，4℃结束程序保存.取降落PCR扩增产物5μL，用1%琼脂糖凝胶电泳检测.1.2.5 PCR扩增产物测序取其中1个降落PCR检测阳性样品的PCR原液和正向引物P1送北京奥科公司测序，进行序列比对，来验证降落PCR检测的可靠性.2 结果和分析2.1 DNA浓度和纯度检测用DNA浓度测定仪（NANODROP 2000Spectrophometer）分别测定提取DNA样品的浓度和纯度，结果见表1.用快速提取玉米幼叶DNA的方法得到的DNA浓度比较高，提取的DNA纯度（D260/D280值）在1.78～1.91之间.根据测定提取样品DNA的浓度，稀释调整到200ng/μL左右.2.2 DNA质量检测每个样品取10μL，分别加入3μL 6×Loading Buffer，然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测.由图1可见，用快速提取法提取的玉米植株幼叶DNA的条带比较透明清晰，可以满足转基因植株PCR检测的要求.表1 样品DNA浓度和纯度Tab.1 The concentration and purity of DNA samples序号 DNA浓度/（ng·μL－1）D260 D280 D260/D280 1 282.5 5.650 3.035 1.86 2 218.5 4.370 2.401 1.82 3 445.2 8.904 4.745 1.88 4 647.8 12.9576.771 1.91 5 381.17.623 4.177 1.82 6 382.8 7.656 4.129 1.85 7 699.2 13.9837.503 1.86 8 249.6 4.993 2.724 1.83 9 223.2 4.465 2.372 1.88 10 333.1 6.662 3.573 1.86 11 261.1 5.223 2.833 1.84 12 313.8 6.276 3.369 1.86 13 407.18.141 4.335 1.88 14 597.2 11.945 6.310 1.89 15 263.8 5.276 2.971 1.78 16 244.8 4.896 2.699 1.81 17 423.6 8.471 4.523 1.87 18 333.1 6.662 3.620 1.84 19 230.5 4.611 2.564 1.80 20 375.3 7.506 4.078 1.84 21 207.9 4.157 2.294 1.81 22 217.4 4.349 2.426 1.79 23 469.7 9.395 5.135 1.83 24 840.3 16.807 9.031 1.86图1 快速提取DNA质量的电泳图谱Fig.1 The electrophoretogram of rapid extraction DNA quality2.3 降落PCR检测以所提取的玉米幼叶DNA作为模板，利用目的基因序列设计的特异性检测引物P1和P2，对其进行降落PCR扩增检测，结果见图2.结果表明，泳道2～10，13～18，22均能扩增出特异性条带，说明该方法提取的DNA纯度在不同样本间存在差异，但不影响PCR扩增，完全可用于降落PCR扩增检测.扩增阳性率高是因为在遗传转化的过程中用除草剂筛选的缘故，转化植株的阳性率为66.7%.图2 快速提取DNA的降落PCR电泳图谱Fig.2 The amplified results of rapid extraction DNA by touchdown PCR2.4 测序结果比对将10号降落PCR检测阳性的剩余15μL扩增原液送北京奥科公司进行测序，所得结果与已知所转目的基因序列进行比较，结果见图3.根据测序结果可知，与原序列比对完全一致，说明降落PCR检测出的转化植株是阳性植株.3 讨论提取较高质量的DNA是转基因玉米检测试验研究的一项最基本的工作，因此，使用一种简便高效的DNA提取方法是非常必要的.与常用玉米叶片DNA提取的CTAB和SDS方法相比，本试验采用的提取方法省时、省力，成本较低，并且所需要的玉米幼叶极少（2cm2）.此方法用冰异丙醇沉淀对基因组DNA进行纯化，纯度较高，在D260/D280值在1.78～1.91之间.从琼脂糖凝胶电泳检测快速提取DNA结果来看，该方法提取的DNA可用于玉米转基因植株的降落PCR检测.从DNA的提取到降落PCR检测的完成只需1d时间，可加速整个试验的进程，提高试验效率.除了应用于转基因玉米植株检测，还可以用于玉米分子标记辅助育种工作的大量群体的个体样本幼叶DNA的快速提取，进行SSR等分子标记研究.此外，在使用该方法时还需要注意，转基因植株叶片取样量不能过多，否则会造成研磨不均匀而影响试验结果；在使用组织研磨器研磨前必须放入液氮中冷冻一定时间，最少需要2min，且使用组织研磨器时一定要按照操作说明进行，注意安全.图3 PCR原液测序结果比较图Fig.3 The sequencing comparison of PCRliquid在转基因植株检测中普通PCR检测的假阳性结果较多，对于更进一步的分子检测造成麻烦.最初设计降落PCR是为了降低普通PCR中出现的假阳性［12］.降落PCR反应在基因克隆上有着较强的优势，对于不确定退火温度基因的PCR扩增为首选［13］，从而获得较理想的扩增产物.虽然降落PCR的程序设计比较繁琐，但是可以提高PCR扩增的特异性和效率，在植物转基因检测中应用广泛［14－16］.本试验中将引物退火温度设为63～57℃以阻止非特异性扩增产物的形成，用于农杆菌介导玉米自交系遗传转化的初步检测.本试验选取其中一个降落PCR检测阳性植株进行了测序，测序结果验证了降落PCR检测的正确性和可靠性.随着研究的深入，该方法将会得到不断完善.致谢：中国农科院作物科学研究所翁建峰老师等在试验设计和整个试验过程中给予悉心指导，特此致谢！参考文献［1］萨姆布鲁克J，拉塞尔 D W.分子克隆实验指南［M］.北京：科学出版社，2002：597－598［2］Saiki R K，Scharf S，Faloona F，et al.Enzymatic amplification of beta －globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia［J］.Science，1985，230：1350－1354［3］Mullis K，Faloona F，Scharf S，et al.Specific enzymatic amplification of DNAin vitro：the polymerase chain reaction［J］.Gold Spring Harbor Symp Quant Biol，1986，51：263－273［4］Mullis K B，Faloona F A.Specific synthesis of DNAin vitro via apolymerase－catalyed reaction［J］.Methods Enzymol，1987，155：335－350［5］Mullis K B.The unusual origin of the polymerase chain reaction ［J］.Sci Am，1990，262：56－65［6］Don R H，Cox P T，Wainwright B J，et al.Touchdown PCR tocircumvent spurious priming during gene amplification［J］.Nucleic Acids Research，1991，19（14）：4008［7］季策，张立军，阮燕晔，等.应用降落PCR和正交设计优化 AtSUC9PCR反应体系［J］.生物技术，2007，17（3）：40－42［8］雷开荣，石春焱，李明顺，等.一种玉米叶片基因组DNA快速提取新方法的初步研究［J］.华北农学报，2006，21（2）：10－12［9］王伟威，孟庆虹，张瑞英，等.5种主要农作物DNA快速提取方法研究［J］.黑龙江农业科学，2008（5）：1－2［10］卢振宇，李明顺，谢传晓，等.玉米叶片DNA快速提取方法改进研究［J］.玉米科学，2008，16（2）：50－53，55［11］杨芳，尚勋武，王化俊，等.小麦基因组DNA快速提取及SSR标记PAGE 的银染检测［J］.甘肃农业大学学报，2008，43（2）：46－50［12］Piraee M，Ving L e of degenerate primers and touch down－PCR to amplify a halogenase gene fragment from Streptomyces venezuelae ISP5230［J］.Ind Microbiol Biotechnol，2002，29（1）：1－12 ［13］王天云，张贵星，薛乐勋.一种简便高效的改良降落PCR［J］.中国生物工程杂志，2003，23（11）：80－82［14］陈彦，潘见，王亚，等.大豆DNA提取方法及降落PCR检测转基因成分的研究［J］.食品科学，2009，30（4）：355－358［15］徐伟丽，徐德昌，刘巧红，等.第三代转基因甜菜植株的检测［J］.中国甜菜糖业，2001（1）：22－23［16］田路明，黄丛林，张秀海，等.降落PCR法快速检测高羊茅转基因植株［J］.生物技术通报，2006（3）：85－87。
玉米基因组DNA的提取 实验设计
去除酚类和多糖等次生物质已成为研究提取DNA中的重要工作。在样品液氮研磨及提取缓冲液中加入高分子螫合剂PVP(聚乙烯吡咯烷酮)或PVPP(聚乙烯聚吡咯酮)等能络合多酚和萜类物质，能有效防止多酚物质氧化成醌类，避免溶液变褐而具有抗氧化作用。因此，在提取液中加入适量的PVP或PVPP能提高DNA的纯度，其用量视杂质的多少而定(1％～6％)，PVP能有效去除多糖。因此将PVP和巯基乙醇配合使用并调整用量，能够有效地防止多酚污染。
⑥用2 mL 70%乙醇洗涤两次，空气干燥10 min，使乙醇充分挥发；
⑦加入300 μL TE溶解沉淀，DNA完全溶解后4℃或- 20℃保存备用。
2、凝胶电泳检测
①制胶槽水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与制胶槽之间留1mm空间
②制胶：称取DNA电泳用琼脂糖0.4g放入250ml的三角烧杯中，加入50ml 0.5×TBE缓冲液，混匀后，将烧瓶放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解。（每块胶用20 ml左右融化的0.8%的琼脂糖凝胶）
2. 去除多糖
糖污染是提取植物DNA时常遇到的另一问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与DNA很相似。近年来，国内外有一些去除多糖的相关报道，如Dellaportarta等]认为加入高浓度的KAc有利于除去多糖。Fang等认为在1.0～2.5mol·L-1NaCl的高盐TE中，用无水乙醇沉淀DNA能除去多糖。SuePorebskib等在沉淀粗提DNA时，将NaCl的浓度提高至2.5mol·L-1以除去多糖。
EDTA-Na2·2H2O
9. 306 g
加水35 ml，剧烈搅拌，用约1 g NaOH颗粒调pH至8.0，定容至50 ml。
1 M Tris-HCl (pH 8.0)1ml，0.5 M EDTA（pH 8.0）0.2 ml，加入蒸馏水至100ml
玉米单株幼芽DNA快速提取新方法
玉米单株幼芽DNA快速提取新方法郭景伦;赵久然;辛景树;赵建宗;贾希海;田雷;律宝春【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2005(020)001【摘要】为了攻克利用DNA指纹技术进行玉米种子纯度鉴定中存在的技术难关,对玉米单株幼芽DNA快速提取方法进行了研究,结果表明:利用新方法提取DNA,不用液氮、不用研磨、不用离心、不用沉淀,不用SDS、不用CTAB、不用氯仿,并且提取的DNA不降解、完全可以满足利用SSR分子标记进行DNA指纹分析的需要.一个人提取100株幼芽(1个检测样品)DNA只需30 min左右,1 d可以提取2000株幼芽(20个检测样品)的DNA,为DNA指纹技术在玉米种子纯度及真伪快速鉴定中的广泛应用解决了关键性技术难题.【总页数】3页(P38-40)【作者】郭景伦;赵久然;辛景树;赵建宗;贾希海;田雷;律宝春【作者单位】北京市农林科学院玉米研究中心,北京,100089;北京市农林科学院玉米研究中心,北京,100089;全国农业技术推广服务中心,北京,100026;全国农业技术推广服务中心,北京,100026;北京市种子管理站,北京,100088;北京市种子管理站,北京,100088;北京市种子管理站,北京,100088【正文语种】中文【中图分类】S513【相关文献】1.快速提取玉米叶片DNA的新方法 [J], 张书红;席章营2.一种玉米叶片基因组DNA快速提取新方法的初步研究 [J], 雷开荣;石春焱;李明顺;李晓辉;李新海3.一种水稻幼苗单株DNA的快速提取及PAGE银染改良法 [J], 陈罡;钟鸣;徐正进;张丽;刘少霞;李敏4.玉米种子DNA快速提取及纯度鉴定新方法 [J], 张文兰;李群;段乃彬;李汝玉;戴双;颜廷进5.适用于SSR分子标记的玉米单粒种子DNA快速提取新方法 [J], 郭景伦;赵久然;王凤格因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
玉米基因组DNA的提取及SSR分析
植物总 ＤＮＡ 的提取在分子生物学实验中占有 很重要的地位， 其提取质量对后续实验有很大的影 响。从植物材料中提取基因组 ＤＮＡ 的方法有很多： 一步法提取虽然提取速度很快， 但提取的植物 ＤＮＡ 质量较差， 只能用于 ＲＡＰＤ 等技术， 不 能 用 于 ＤＮＡ 酶 切 、ＲＦＬＰ 等 技 术 ； 用 传 统 的 ＣＴＡＢ 法 提 取 植 物 ＤＮＡ， 操作步骤复杂， 较费时， 而且不是玉米基因组 ＤＮＡ 提取的最佳方法。因此， 探讨既快速提取， 又能 获得较好的 ＤＮＡ 质量， 用于 ＳＳＲ、ＲＡＰＤ 及 ＲＦＬＰ 等 技术的玉米基因组 ＤＮＡ 提取方法对玉米分子辅助 育种是极其重要的。
ＷＡＮＧ Ｆａｎｇ， ＷＡＮＧ Ｈｕａ－ ｊｕｎ， ＷＡＮＧ Ｈａｎ－ ｎｉｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ： Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＣＴＡＢ， ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｙｅｌｌｏｗ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ， ｔｈｅｎ ｄｅ－ ｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ０．８％ ｇｅｌｏｓｅ ｇｅｌａｔｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ． Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｐ－ ｐｒｏａｃｈｅｓ， ｔｈｅ ｈｉｇｈ ａｍｙｌｏｓｅ－ ｅｘｔｅｎｄｅｒ ｍａｉｚｅ ｐａｒｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＳＳＲ－ ＰＣＲ， ｔｏｏ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｍ－ ｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＣＴＡＢ ｈａｄ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｍａｎｙ ｆｉｎｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ， ｐｅｒｆｅｃｔ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｐｕ－ ｒｉｔｙ， ａｎｄ ｉｄｅａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｒｅｃｅｉｖｅｄ． Ｓｏ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＣＴＡＢ ａｎｄ ＳＳＲ－ ＰＣＲ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｆｏｕｎ－ ｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ－ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍａｉｚｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ． Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： Ｍａｉｚｅ； Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ质量好和纯度高等优点。对所构建的选育高直链淀粉玉米群
f.快速CTAB法提取玉米种子胚基因组DNA
点样顺序 : 1. 亲本郑 58 (传统 C TAB 法 ,叶片) ; 2. 郑单 958 (传统 CTAB 法 ,叶片) ; 3. 郑单 958 (快速 CTAB 法 ,种子胚) ; 4. 郑单 958 (快速 SDS 法 ,种子胚) ; 5. 亲本昌 72 (传统 CTAB 法 ,叶片) 图 2 引物 Bnlg1250 对 5 份样品进行 SSR 扩增后 的聚丙烯酰胺电泳图谱
取样品 DNA 各 1μL ,分别加入 49μL T E ,用紫 外分光光度计检测其纯度和浓度 ; 取样品 DNA 各 10μL ,分别加入 3μL 溴酚蓝和 2μL L EB ,在 0. 8 % 琼脂糖凝胶上电泳 ,经凝胶成像系统检测 ,其符合 PCR 要求 ,留样品做 SSR 分析 。 1. 3. 2 SSR 分子标记检测 PCR 反应总体积为 25 μL : 10 ×Buffer 2. 5μL , 25 mmol/ L MgCl2 1. 5μL ,
5μmol/ L 的 引 物 1μL ( L + R ) , 5 U/μL TaqE 0. 2μL , 10 mmol/ L dN TPs 0. 25μL , 模 板 DNA 2. 5μL ( 根 据 紫 外 分 光 光 度 计 检 测 结 果 , 将 样 品 DNA 母 液 用 T E 稀 释 50 倍) 。扩 增 程 序 : 94 ℃, 5 min ;94 ℃, 30 s , 60 ℃, 1 min , 72 ℃, 1. 5 min , 40 个 循 环 ; 72 ℃, 7 min ; 4 ℃保 存 。SSR 引 物 序 列 来 自 MA IZEDA T EBA SE (表 1) ,由上海博亚生物技术有 限公司于 2004 年合成 。
表 1 试验所用引物名称 、序列 、所在染色体位置
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
样品滴加于超微量紫外可见分光光度计 Ｂ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｏ 上 ，测 吸光度值。由吸光度值计算核酸分子浓度的公式如下 ：
ｄ ｓ Ｄ Ｎ Ａ浓 度 （ ｕ ｇ ／ ｍ Ｌ ）＝ Ｏ Ｄ ２ ６ ｏ ×５ ０ ｕ ｇ ／ ｍＬ× 稀 释 倍
３ ０ ２ ０ １ ６ ， Ｖ ｏ １ ． ３ ６ ， Ｎ ｏ ． ２ ３
农 业 与 技 术
※农业科学
ห้องสมุดไป่ตู้
玉米基 因组 Ｄ ＮＡ不 同提取 方法及提取 部位 的 比较研 究
楚 海娇
（ 吉林 农业科技 学院 生物 工程 学 院， 吉林 吉林 １ ３ ２ １ ０ １ ）
摘 要 ：分别 探 讨 Ｃ Ｔ ＡＢ 法和 Ｓ Ｄ Ｓ法对 玉 米 不 同部位 基 因 组 Ｄ ＮＡ 的提 取 效果 。 综合 比较 了 ２种 方 法提 取 的 Ｄ Ｎ Ａ
数
用于植物基因组提取的方法有 Ｃ Ｔ Ａ Ｂ法 、Ｓ ＤＳ 法及尿素 定玉米基因组 Ｄ Ｎ Ａ在 ２ ６ ０ ｎ ｍ和 ２ ８ ０ ｎ ｍ紫外光波长下的
程序简便 、快速、成本低的特点。
基 因组 Ｄ Ｎ Ａ纯 度 根据 Ｏ Ｄ ２ 。 ／ Ｏ Ｄ ８ ｏ 的 比值来 衡 量 。 纯净的Ｄ Ｎ Ａ样 品 Ｏ Ｄ ｏ ／ ２ ８ ０ 在１ ． ８ － ２ ． ０ 之间， 比值 小 于 １ ． ８ ， 说 明蛋 白质或酚 未除净 ；比值大 于 ２ ． ０ ，说 明有 Ｒ Ｎ Ａ
污染。
ｌ 材料与方法
１ ． １ 试验 材料
玉 米材料 为 “ 吉科 ３ ５ ３ ６ ” ，由吉林 农业 科 技学 院植 物 科 学 学院 提 供 。玉 米 种 植 采 用 盆栽 法 ，待玉 米 长 至 ２
１ ． ３ ． ４ １ ％ 琼 脂糖 凝胶 电泳进行 基 因组 Ｄ Ｎ Ａ 完整 性 的检
度 的玉 米基 因组 ＤＮＡ 的提 取 ｐ ，提 取 的 ＤＮＡ浓 度 和 质
乙醇沉淀 Ｄ Ｎ Ａ一 ７ ０ ％ 乙醇洗涤沉淀一 Ｒ Ｅ缓 冲液溶 解
ＤＮＡ 。
１ ． ３ ． ２ Ｓ ＤＳ法
０ ． ３ ｇ 玉 米 材 料 液 氮 中 研 磨 一加 入 Ｓ Ｄ Ｓ提 取 液 ８ ０ ０ ｕ Ｌ一 ６ ５ ℃水 浴 中提 取 一有机 溶 剂 抽提 ２ 次 一无 水 乙
农 业 与 技 术
２ ０ １ ６ ， Ｖ ｏ Ｌ ３ ６ ， Ｎ ｏ ． ２ ３ ３ ，
浓度 、 纯 度 及 完 整 性 ，结 果 表 明 Ｓ ＤＳ 法是 比较 适 合 玉 米 基 因组 ＤＮ Ａ 提 取 的方 法 ； 同 时比 较 了以玉 米 叶 片、 幼 根
和 成 熟 胚 为材 料提 取 的 Ｄ ＮＡ 质 量 ，发现 以新 鲜 叶 片 为材 料 提 取 的 Ｄ ＮＡ 浓度 和 纯度 较 高 ， 更适 合 用于 玉 米 基 因组
测
叶期时取不同部位 ，用于 Ｄ Ｎ Ａ的提取纯化。
１ ． ２ 主要试 剂 和药 品
２ 结果 与讨论
２ ． １ 不 同方 法提 取 玉米 基 因组 Ｄ Ｎ Ａ 的结 果分 析
１
Ｃ Ｔ Ａ Ｂ提取液 、 Ｓ Ｄ Ｓ 提取液 、 饱和酚 、 氯仿、 异戍醇、
５ Ｍ Ｋ ｍ ｃ 、无 水 乙醇 、Ｔ Ｅ缓 冲 液 、５ ｘ Ｔ Ｂ Ｅ电 泳缓 冲 液 、 ６ ｘ凝胶上 样缓 冲液 、Ｄ Ｎ Ａ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ 、核酸 染料 。
量 对后 续试 验 结 果 有 较 大 的 影 响 ， 因此 合 适 的 Ｄ ＮＡ提
取方法非常重要。 目前用于制备基因组Ｄ Ｎ Ａ的方法很多，
法等 Ｊ 。 对于 玉米 来讲 ， 不 同部 位 的材料 、 不 同提取 方 法 ， Ｄ Ｎ Ａ 的 得率 不 同 。适 宜 的 Ｄ Ｎ Ａ提 取 方 法不 仅 能 够获 得
ＤＮＡ 的提 取 。
关键 词 ：玉 米 ；基 因组 Ｄ Ｎ Ａ；Ｃ Ｔ Ａ Ｂ 法 ；Ｓ Ｄ Ｓ法
中图分 类号 ：ｓ ５ １ ３
文献标 识 码 ：Ａ
Ｄ ０ ｌ ：１ ０ ． １ １ ９ ７ ４ ／ ｎ ｙ ｙ ｊ ｓ ． ２ ０ １ ６ １ ２ ３ ２ ０ ０ ６
基 因组 ＤＮＡ是 生 物 体 所 有 遗 传 信 息 的 总 和 。植 物
０ ． ３ ｇ 玉 米 材 料 液 氮 中研 磨 ・加 入 Ｃ Ｔ Ａ Ｂ提 取 液 ８ ０ ０ ｕ Ｌ一 ６ ５ ℃水浴 中提取 一有机溶剂 抽提 ２ 次 一 无 水
总Ｄ Ｎ Ａ 的提 取是 研 究植 物 Ｄ Ｎ Ａ 的结 构 和功 能 ，开 展外 源Ｄ Ｎ Ａ 转 化 和 转导 的前 提 。玉 米 是 重要 的粮 食 和 饲 料 作 物 】 。 目前 ， 国内外 已开 展 了大 量 的 玉米 分 子 生物 学 研 究和 基 因组 学 研 究 。研 究玉 米 基 因 的结 构 与功 能 ，发 现具 有 目标 性 状 的 基 因资 源 ，探 明基 因位 点 与效 应 ，可 解决 一 些 育种 问题 ； 同时 通过 转 基 因 育种 的使 用 ，可 实 现物 种 之 间跨越 。 进行 玉 米 生物 技 术研 究 的基 础 是 大量 高 质量 、高纯
１ ． ３ 试 验方 法
１ ． ３ ． １ ＣＴ Ａ Ｂ法
２ ． １ ． １ Ｄ Ｎ Ａ浓度和纯度检测 使用紫外分光光度计分别对 Ｃ Ｔ Ａ Ｂ法和 Ｓ Ｄ Ｓ法提取
的玉米基因组 Ｄ Ｎ Ａ 样 品进 行浓 度 和 纯 度 测 定 ，检测 结
果如 表 １ 所示 。
※农、 Ｉ 利 ．
醇和 ５ ｍｏ ｌ ／ Ｌ Ｋｍｃ沉 淀 ＤＮＡ 一 ７ ０ ％ 乙 醇 洗 涤 沉 淀 ２次
一
Ｒ Ｅ缓 冲液 溶 解 Ｄ Ｎ Ａ。
１ ． ３ ． ３ 基 因组 Ｄ Ｎ Ａ浓 度和 纯度 的测 定 采 用 紫 外 分 光 光 度 法 进 行 定 量 分 析 。取 ｌ ｕ Ｌ Ｄ Ｎ Ａ