动物基因组DNA的提取
动物基因提取实验报告
一、实验目的1. 掌握动物组织基因组DNA提取的操作方法。
2. 理解并应用琼脂糖凝胶电泳技术检测DNA的方法。
3. 学习DNA纯度与含量的测定方法。
二、实验原理动物组织基因组DNA提取的原理主要是通过破碎细胞膜和核膜，释放出DNA分子，然后通过特定的方法去除杂质，最终获得高纯度的DNA。
实验中，常用的破碎细胞膜和核膜的方法有：- 使用十二烷基磺酸钠（SDS）和蛋白酶K等试剂，使蛋白质变性并溶解细胞膜中的脂质，导致细胞裂解。
- 利用溶菌酶、蜗牛酶等酶类，水解细胞壁和细胞膜，释放DNA。
获得细胞裂解物后，通过加入苯酚和氯仿等有机溶剂，使蛋白质变性并形成有机相和水相，从而分离核酸和蛋白质。
由于DNA不溶于有机溶剂，因此可以通过离心分离获得含有DNA的上清液。
上清液中加入无水乙醇，DNA会从溶液中沉淀出来。
将沉淀的DNA溶解于TE缓冲液中，即可获得高纯度的DNA。
琼脂糖凝胶电泳是检测DNA纯度和大小的重要手段。
DNA分子在琼脂糖凝胶中，在电场的作用下，根据分子大小和所带电荷的不同，在凝胶中移动的速度不同，从而实现分离。
DNA纯度可以通过紫外吸收法测定，根据DNA在260nm处的吸光度值计算DNA的纯度。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：动物肝脏组织样本2. 试剂：- DNA提取试剂盒- 十二烷基磺酸钠（SDS）- 蛋白酶K- 溶菌酶、蜗牛酶- 苯酚、氯仿、异丙醇- 无水乙醇- TE缓冲液- 琼脂糖- 电泳缓冲液- 标准DNA分子量标记物四、实验器材与仪器1. 器材：离心管、移液器、电泳槽、凝胶成像系统、PCR仪等2. 仪器：超净工作台、恒温培养箱、高速离心机、微波炉等五、实验步骤1. 取动物肝脏组织样本，称重后加入适量提取试剂，进行细胞破裂和蛋白质水解。
2. 加入苯酚和氯仿，混合均匀，离心分离，取上清液。
3. 上清液中加入无水乙醇，混合均匀，离心分离，收集沉淀。
4. 将沉淀溶解于TE缓冲液中，即为提取的DNA。
动物基因组DNA的提取流程总结
动物基因组DNA的提取1.切取组织5g 左右，用组织粉碎机或研钵将细胞分离。
注：1）少量结缔组织并不影响最后得到的DNA勺质量；2）若标本为血液，则只需肝素抗凝、离心后取白细胞层；3）若为培养的贴壁细胞，则用胰酶消化后收集，PBS洗涤即可。
2.加入5ml DNA提取缓冲液，（10mmol/L Tris-CI ,0.1 mol/L EDTA 0.5% SDS）, 混匀。
注：1）最好先加入Tris-Cl、EDTA再加入SDS 2）最好一边匀浆，一边加入液体，使之充分混匀。
3.加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml，混匀，37C温浴过夜。
注：1）致密组织（如小鼠尾巴）可以适当延长蛋白酶的作用时间；2）若组织量很大且组织比较疏松（如动物脾脏），或对所提取的DNA完整性要求不高时，可以不用蛋白酶K,而是剧烈振荡20分钟，将组蛋白与DNA分离。
此法可能会使部分DNA链断裂，但足以达到一般实验要求，并不影响后续处理；3）也可同时加入RNase。
4.加入等体积的酚－氯仿－异戊醇混合物（25:24:1），剧烈振荡10分钟，冰浴10 分钟，2500rpm 10 分钟离心收集水相。
注：不要混带中间蛋白层。
5.加1/10 体积3mol/L NaAc 及 2 倍体积冰预冷的无水乙醇，颠倒混匀。
冰浴1小时，沉淀DNA注：冰浴时间从10分钟到2小时均可，只是时间太短会影响到最后的产量，但不影响质量。
6.用玻棒轻搅钩出DNA沉淀，置于另一离心管中。
注：如果确信没有混入蛋白，也可用离心的方法去除液体，但应在加入蛋白酶K的同时加入RNaseA7.70%^醇洗涤，晾干，加适量TE或灭菌水溶解，-20 C保存。
注：若要长久保存DNA（数年以上），最好将其沉淀以无水乙醇封闭后，置于-80 °C。
动物基因组DNA的分离和琼脂糖凝胶电泳
每组取1 μL 、2 μL DNA样品，加1 μL电泳上样缓冲液 （含溴酚蓝），少量的水（9、8 ul），混匀后加样于琼 脂糖凝胶孔内。 电泳（小胶100-120V，大胶150-180V）：使DNA移入琼 脂糖胶内。一般为溴酚蓝迁移至中间即可停止电泳。 用短波紫外线（254 nm）进行拍照，比较样品DNA与 DNA标准品（marker）的荧光强度（一般最亮的条带为 750bp，上样5 ul约100 ng），并计算出待测样品中DNA 的浓度。 如果DNA已经降解，DNA的带就会拖尾巴，或出现弥散 性分布，而不能形成清晰、紧凑的带纹，这样的DNA样 品不能用于进一步研究。
ห้องสมุดไป่ตู้
每小组取1.5 ml EP管，加入上述消化细胞液600ul ，加 入等体积酚／氯仿／异戊醇，缓慢颠倒离心管使两相均匀 混合形成乳浊液，12000 r/min，4℃离心10 min。 小心吸出EP管中的上层液体，即为含DNA的水相，注意 不要吸中间界面上一层厚的白色物质（蛋白质沉淀）。然 后加入等体积氯仿／异戊醇，12000 r/min，4℃离心10 min。(如果界面或水相中含蛋白质沉淀较多，可重复操作) 小心吸出上层含DNA的水相，加入1/10体积NaAc，充分 混匀，然后加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，置-20℃ 冰箱约2 h。 12000 r/min，4℃离心10 min，弃上清液，得到的白色 沉淀。加入1 mL 70％冷乙醇洗涤，继续离心，获得沉淀， 室温干燥。加入50 L TE缓冲液溶解，即可得到基因组 DNA。-20℃冰箱保存。 如果要对提取的DNA进行完整性鉴定，可通过琼脂糖凝 胶。方法是取1 l溶解的DNA样品，在1％的琼脂糖凝胶 中进行电泳，用溴化乙锭（或Goldenview）染色观察结 果。
动物基因组DNA的提取
动物基因组DNA的提取[实验原理]在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。
通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1.台式离心机2.玻璃匀浆器3．高压灭菌锅4．恒温水浴(二)材料1．1.5mL微量离心管2．微量取样器和吸头3．无菌过滤器(一次性)4．10 mL注射器5．鼠肝6．三羟甲基氨基甲烷(Tris)7.十二烷基硫酸钠(SDS)8．乙二胺四乙酸(EDTA)9．蛋白酶K10．RNA酶11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物(三)试剂1、1.5 mol／L NaCl2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.03．0.5 mol／L EDTA pH8.04．3 mol／L NaAc pH5.2以上均高压灭菌。
5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制)6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0)7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0)10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比)11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比)12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液14．λDNA／EcoRI+／HindⅢ相对分于质量标准物片段(bP)21 227，5148，4 973，4 268，3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125[实验步骤]本实验在无液氮的条件下，铡备鼠肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。
动物组织中总DNA的提取
试剂
提取缓冲液：200 mmol/L Tris·Cl (pH8.0), 25mmol/L EDTA, 500 mmol/L NaCl, 0.5% SDS
24：1的氯仿：异戊醇 预冷无水乙醇
SDS抽提液配方(1000ml):
操作步骤
1. 肝脏1g左右, (剪碎) 置研钵中，加入2-3mL提取缓
目前从样品中分离DNA的方法主要有两种，分为 CTAB法和使DNA得以 游离出来）。
SDS法提取动物组织DNA
SDS（十二烷基硫酸钠 ）是阴离子表面活性 剂，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉 淀下来。EDTA 抑制DNA酶的活性。再加入氯仿等 有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因 核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提 液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入 乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中， 即DNA溶液。
絮状DNA沉淀。
结果分析与讨论
DNA提取原则
保证DNA结构的完整性
纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质
排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染
实验原理
细胞内各种DNA（包括基因组DNA和核外DNA） 称为总DNA。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋 白（DNP），能溶解在纯水或1mol/L的NaCl溶液 中，而不溶于有机溶剂。
冲液， 研磨成浆；吸入10mL EP管中，摇动混匀；
2. 60℃水浴保温20min，不时颠倒混匀； 3. 室温下3000rpm离心10min； 4. 小心吸上清于另一只离心管中，加入等体积的24:1
的氯仿：异戊醇，上下颠倒混匀；
5. 室温下3000rpm离心10min； 6. 小心将上层水相吸入另一只离心管中； 7. 重复4-5步2-3次; (此步不做） 8. 加入等体积预冷无水乙醇，室温下放置片刻即出现
动物组织基因组DNA提取
动物组织DNA提取1样品预处理取新鲜组织25-50mg（组织不宜过多，否则裂解不完全堵塞离心柱），组织剪碎或者切成小块，放入预冷研钵，快速加入液氮用力研磨，或直接放入匀浆器中匀浆。
冻存组织同样使用研钵研磨或匀浆器快速用力研磨或匀浆（冻存组织避免反复冻融，使细胞破碎，内源酶外泄影响基因组DNA提取）2.加入100ulPBS到研磨好的样品中，样品均匀悬浮于PBS3.加600ul的Lysis Buffer，颠倒混匀，如需消化RNA，可加入20ulRNase A，颠倒混匀，室温放置5min4.加入10ul ProteinaseK，混匀，56度水浴45-60min，（颠倒混匀数次，裂解完全液体则清亮粘稠，此步骤可过夜）5 .12000rpm 离心10min，上清转入新的离心管，加800ul无水乙醇，混匀6.液体分次转入离心柱（一次加不完可分次加入），12000rpm 离心1min，弃废液。
7.加入700ulWash bufferA（用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
8. 加入700ulWash bufferB（用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
9.加入500ulWash bufferB，12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
10.再次12000rpm 离心2min，将离心柱置于心得离心管中，打开离心柱盖，于室温或37度恒温箱放置5-10min，直至无明显乙醇味。
11.在硅基质膜中央加入50-200ulTEbuffer（事先预热55-65度）置于室温2-5min，12000rpm 离心30s。
12. 离心得到的溶液再次加入离心柱中，室温放置2min，12000rpm 离心2min，所得溶液为纯化后的基因组DNA.纯化效果检测：取2-5ulDNA产物，0.7%agarose电泳检测DNA分子的完整性和紫外分光光度计检测浓度和纯度。
动物组织细胞基因组DNA提取
动物组织细胞基因组DNA提取一、实验原理真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。
真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液：Tris (pH8.0) 100 mmol/LEDTA (pH 8.0) 500 mmol/LNaCL 20 mmol/LSDS 10%胰RNA酶20ug/ml（2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。
（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。
（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
三、操作步骤1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。
置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。
在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。
于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
实验六哺乳动物基因组DNA的提取
• 实验材料与试剂：
• 材料：家兔的全血 • 器材：移液器、高速冷冻离心机、
台式离心机、水浴锅等。试源自：1、提取DNA所需的试剂配制
1 M Tris· Cl（pH 8.0） 0.5M EDTA（pH 8.0） 10% SDS STE 氯仿:异戊醇（24:1） 3M无水NaAc（pH5.2） TE缓冲液（pH8.0） 抗凝剂ACD PBS 0.5M NaCl 20 mg/ml 蛋白酶K 酚:氯仿（1:1） 冰乙醇
2、琼脂糖电泳所用的有关试剂
10×TBE缓冲液, 1.2%琼脂糖, 琼脂糖凝胶加样缓冲液, 10mg/ml溴化乙锭（EB）。
实验步骤
1、基因组DNA的提取
将冰冻的家兔血液在室温下溶化； 取0.6ml血液转入一无菌的1.5ml离心管中，加入等体积 的PBS磷酸盐缓冲液，充分混匀后12000rpm离心5min， 弃上清； 加入400µ l STE，14µ l的20%的SDS，37℃水浴1h； 加8µl的20mg/ml的蛋白酶K混匀，55℃水浴消化过夜 （10～14h）；
实验六 哺乳动物基因组DNA的 提取及琼脂糖凝胶电泳检测DNA
6学时
• 实验目的：学习和掌握用酚-氯仿抽提法
提取哺乳动物的基因组DNA的方法。
• 实验原理：真核生物DNA提取的材料来源
可以是培养的细胞、血液、肝、脾、肾等 组织，通常的方法是在有EDTA和SDS等去污 剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚 /氯仿/异戊醇抽提，可能得到哺乳动物基 因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100150kb。
观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化 乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的 一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。 在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙 锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并 通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位臵及其 与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产 率比游离溶液中染料有所增加。 DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染 料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的 能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭 -DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所 以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到 少至10ng的DNA条带。
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动物基因组DNA的提取
[实验原理]
在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。
通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。
[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1.台式离心机
2.玻璃匀浆器
3．高压灭菌锅
4．恒温水浴
(二)材料
1．1.5mL微量离心管
2．微量取样器和吸头
3．无菌过滤器(一次性)
4．10 mL注射器
5．鼠肝
6．三羟甲基氨基甲烷(Tris)
7.十二烷基硫酸钠(SDS)
8．乙二胺四乙酸(EDTA)
9．蛋白酶K
10．RNA酶
11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物
(三)试剂
1、1.5 mol／L NaCl
2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.0
3．0.5 mol／L EDTA pH8.0
4．3 mol／L NaAc pH5.2
以上均高压灭菌。
5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制)
6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0)
7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS
8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存
9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0)
10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比)
11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比)
12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液
14．λDNA／EcoRI+／HindⅢ相对分于质量标准物片段(bP)21 227，5148，4 973，4 268，3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125
[实验步骤]
本实验在无液氮的条件下，铡备鼠肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。
整个操作过程中，应尽量避免DNA酶的污染，特g4注童动作温和，减少对DNA的机械捌伤。
1、取0.2g鼠肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于2.0mL匀浆掖中，用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作，切匆将细胞破碎，可镜检观察)。
2、将组织细胞移至1.5ml离心管中，50000rpm离心30-60sec，(尽可能在低温下操作)，弃上清，若沉淀中血细胞较多，可再加入1倍于细胞体积的匀浆液洗一次。
3、沉淀加0.8mL无菌水迅速吹散，分两管，再加0.4mL酵解液，翻转混匀(动作一定要轻)55℃水浴处理12-18 h；
4、沉淀加RNase至终浓度200µg／mL，37℃水浴1 h；
5、加入等体积酚／氯仿／异戊醇抽提一次，(慢慢旋转混勾，倾斜使两相接触面增大)。
4℃、10min、10000rpm离心；
6、有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时应注意观察。
用扩口吸头移出含DNA 的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀)，加等体积氧仿／异戊醇，4℃、
10 000rrpm离心10rain (若界面或水相中蛋白含量多，可重复1．6操作)。
7、用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，加1／10体积的NaAc，小心混匀(要充分)，再向每管中加入2.5倍体积的无水乙醇，-20 过夜。
8、12 000rpm离心19min，弃上清，75％冷乙醇洗涤一次，12000rpm离心15min室握温干燥(不要大干，否则DNA不易溶解)，加入适量TE缓冲液，存放于4℃，轻摇溶解过夜，即可得到实验动物基因组DNA。
9、电泳鉴定DNA，由于基因组DNA相对分子质量较大，用0.3％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，先在底部锦一层1％的支持胶，凝固后再铺上一层0.3％琼脂糖凝胶，插上梳子(枚子不能瑾到的支持胶)。
取1.5µL溶解的DNA、1µL上样缓冲液和35µl无菌水混匀后小心上样(可在另一孔加DNA相对分于质量标准)，观察基因组DNA大小，用溴化乙锭染色观察结果。
[注意事项]
1、操作过程尽量在低温下进行，避免DNA降解。
2、琼脂糖凝胶脆弱，应小心操作。
3、提取得到的基因组DNA应为单一条带，DNA降解可形成弥散带型。
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