脲酶测定方法urease(靛酚比色法)
脲酶的测定——精选推荐
一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。
2.试剂2.1尿素:GB696，分析纯。
2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
3.操作方法3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。
3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。
3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。
颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验。
样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。
一般企业认为7、8分钟变色较为合适。
二、半固态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。
2.试剂2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N。
2.2尿素一酚红试剂2.2.1将1.2克酚红溶解于30ml0.2N的NaOH中；2.2.2用蒸馏水将之稀释至约300mL；2.2.3加入90g尿素（分析纯）并溶解之；2.2.4用蒸馏水稀释至2L；2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4；2.2.6用蒸馏水稀释至最后体积3L；2.2.7溶液应具明亮的琥珀色。
3.操作方法3.1在一个150ml的烧杯中倒入少量试剂，注意溶液必须呈明亮的琥珀色。
若溶液已转变为深桔红色，滴人稀硫酸溶液并搅拌之，直至溶液再度呈琥珀色。
3.2量一匙粉末样品，放置于培养皿中。
3.在样品上加入两匙试剂，轻轻搅拌，将样品平铺于培养皿中。
若仍有干样品斑点，则再加入试剂，直至将样品浸湿。
4.放置5分钟后观察：a. 没有任何红点出现：再任其放置25分钟，若仍无红点出现，说明大豆粉过熟。
b. 有少量红点：少量尿素酶活性，可用。
土壤脲酶(Solid-Urease,S-UE)测定试剂盒使用说明
土壤脲酶（Solid-Urease，S-UE）测定试剂盒使用说明分光光度法50管/24样产品简介：S-UE能够水解尿素，产生氨和碳酸。
土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。
土壤脲酶活性反应了土壤的氮素状况。
本法以尿素为基质，利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3-N，生成的蓝色靛酚和氨的浓度成正比。
试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰、甲苯（不允许快递）和蒸馏水。
产品内容：试剂一：甲苯10mL×1瓶，4℃保存；（自备）试剂二：粉剂×1瓶，临用前加入20mL蒸馏水，充分溶解待用，4℃保存；试剂三：液体65mL×1瓶，4℃保存；试剂四A液：液体4mL×1瓶，4℃保存；试剂四B液：液体8mL×1瓶，4℃保存；临用前将A液倒入B液中混合，待用；试剂五：液体10mL×1瓶，4℃保存；标准品：液体1mL×1支，1mg/ml氮标准液操作步骤：1、培养试剂名称测定管对照管风干土样（g）0.250.25试剂一（μL）125125振荡混匀，使土样全部湿润，室温放置15min试剂二（μL）625蒸馏水（μL）625试剂三（μL）12501250混匀，放入37℃水浴培养24h后，10000g常温离心10min，取上清液。
2、将培养结束的上清液稀释10倍（取0.1mL上清液，加入0.9mL蒸馏水）若吸光值仍大于1.5继续稀释。
3、标准品的准备：吸取适量的标准溶液，稀释至10、8、6、4、2、1、0.5、0μg/ml。
4、测氨量测定管对照管标准管稀释后的上清液标准液（μL）400400400试剂四（μL）808080试剂五（μL）606060充分混匀，室温放置20min蒸馏水（μL）460460460混匀，630nm处蒸馏水调零，测A值，ΔA=A测定管-A对照管。
每个测定管设一个对照管。
脲酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内再分光光度计上于578nm处比色。
脲酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内再分光光度计上于578nm处比色。
土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）
土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）一、原理脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。
它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。
土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。
根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。
人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。
土壤中脲酶活性的测定是以脲（尿素）为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的脲（尿素）量来求得。
本方法以脲（尿素）为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。
二、试剂1）甲苯2）10%脲（尿素）：称取10g脲（尿素），用水溶至100ml。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。
将A、B溶液保存在4℃冰箱中。
使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
取10%的次氯酸钠溶液9ml，用蒸馏水定容到100ml。
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。
标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。
再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
脲酶测定试剂盒说明书
脲酶（Urease，UE）测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：UE能够水解尿素，产生氨和碳酸。
UE活性与有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关，反应了氮素状况。
测定原理：利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3-N。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1ml比色皿、研钵、冰、和蒸馏水。
试剂的组成和配制：提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；试剂一：粉剂×1瓶，临用前加入5mL蒸馏水，充分溶解待用，4℃保存；用不完的试剂4℃保存；试剂二：液体12mL×1瓶，4℃保存；试剂三A液：液体×1支，4℃保存；试剂三B液：液体×1瓶，4℃保存；临用前将A液倒入B液中混合，待用；用不完的试剂4℃保存一周；试剂四：液体5mL×1瓶，4℃保存；样本的前处理：1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至578nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应试剂名称测定管对照管样本（μL）20 20试剂一（μL）90蒸馏水（μL）90试剂二（μL）190 190混匀，放入37℃水浴1h后，10000g 25℃离心10min，取上清液。
土壤酶活性测定
土壤与环境微生物研究法／李振高，骆永明，滕应编著．一北京：科学出版社，2008过氧化氢酶（398-399）脲酶（404-405）磷酸酶（412-413）关松荫/土壤酶及其研究法农业出版社 1986年七月第一版蔗糖酶274-276土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。
（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，加蒸馏水90ml。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：取184g柠檬酸溶于300ml蒸馏水中，另取147.5g KOH 溶于蒸馏水，再将二种溶液合并，用1N NaOH将pH调节至6.7，用水稀释至1L。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A 液），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B液）,存于冰箱中。
将A、B溶液保存在冰箱中。
使用前将两种溶液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg 氮的标准液（100ppm）。
（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即为10ppm，吸取0、1、2、3、4、5、10、15、20 mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。
即为0、0.2ppm、0.4ppm、0.6ppm、0.8ppm、1ppm、2ppm、3ppm、4ppm的标准曲线。
将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。
土壤脲酶活性测定(改良靛酚蓝比色法)
土壤脲酶的测定方法（改良靛酚蓝比色法）一、原理以尿素为底物，经培养后根据脲酶酶促产物--氨（忽略硝化过程造成的氨氮损失）在碱性介质中与苯酚、次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚。
该生成物数量与氨浓度成正比。
后即称为靛酚蓝比色法，其结果精确性较高，重现性较好，在脲酶活性测定中的应用最为广泛。
二、试剂1）甲苯1ml/ps注：甲苯易挥发，要在通风条件好的地方操作。
2）5%尿素：称取5g尿素，用水溶至100ml。
10ml/ps3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。
20ml/ps注：柠檬酸和氢氧化钾混合时大量放热，需小心缓慢混合，冷却后定容。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。
将A、B溶液保存在冰箱中。
使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
4ml/ps注：实际配比为：125g苯酚+4ml甲醇+37ml丙酮+25ml乙醇，混合溶解为A液。
54g氢氧化钠溶解为B液，冷却后备用。
A+B,定容至1000ml即得苯酚钠溶液。
苯酚有毒，常温下凝固，不宜称取，需小心。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
3ml/ps注:一般次氯酸钠溶液瓶上标注为活性≥5.5%，163.64ml次氯酸钠定容至1000ml。
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至500ml，得到1ml含有0.2mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取5ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。
二、器材50ml三角瓶，50ml容量瓶，漏斗，25ml试管，定量滤纸，振荡器，分光光度器四、操作步骤1）称取5g过1mm筛的风干土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，盖好；注：实际称取2g土。
脲酶定性的实验
脲酶定性的实验随着膨化技术在饲料工业中推广普及,越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉,与其它蛋白资源一样,大豆的适度熟化非常重要,熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子,熟化度过高又会导致氨基酸利用率低.判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性.脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下,每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数.脲酶本身无营养意义,但它与抗胰蛋白酶的含量接近,并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似,因此,尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标.脲酶活性没有负值,最低为0.在我国现行的国标推荐值为0.3,在美国一般认为以不超过0.2为宜,并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12,当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受.国内很多大企业一般均采用0.2.实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂,有滴定法和pH增值法两种,已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等.目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性,一般来说,主要有如下两种方法.一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨,会使酚红指示剂改变颜色.2.试剂2.1尿素:GB696,分析纯.2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红,加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液,在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀备用.3.操作方法3.1取0.2g粉末样品,置于25mL比色管中.3.2加0.02g尿素,加酚红指示剂2滴,再加水20mL,充分摇匀15s.3.3记录粉红色出现时间,并根据时间判断尿酶活性,颜色出现时间应少于15min. 颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验.样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品),只有上述空白正常时,即酚红指示剂不改变颜色,试验结果才是可靠的.一般企业认为7、8分钟变色较为合适.二、半固态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨,会使酚红指示剂改变颜色.2.试剂2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N.2.2尿素一酚红试剂2.2.1将1.2克酚红溶解于30ml0.2N的NaOH中；2.2.2用蒸馏水将之稀释至约300mL；2.2.3加入90g尿素（分析纯）并溶解之；2.2.4用蒸馏水稀释至2L；2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4；2.2.6用蒸馏水稀释至最后体积3L；2.2.7溶液应具明亮的琥珀色.3.操作方法3.1在一个150ml的烧杯中倒入少量试剂,注意溶液必须呈明亮的琥珀色.若溶液已转变为深桔红色,滴人稀硫酸溶液并搅拌之,直至溶液再度呈琥珀色.3.2量一匙粉末样品,放置于培养皿中.3.在样品上加入两匙试剂,轻轻搅拌,将样品平铺于培养皿中.若仍有干样品斑点,则再加入试剂,直至将样品浸湿.4.放置5分钟后观察：a. 没有任何红点出现：再任其放置25分钟,若仍无红点出现,说明大豆粉过熟.b. 有少量红点：少量尿素酶活性,可用.c. 样品表面约有25％为红点覆盖：少量尿素酶活性,可用.d. 豆饼表面约有50％为红点覆盖：尿素酶活性较高,不可以使用.e. 豆饼表面的75％－100％为红点覆盖：尿素酶活性很高,样品过生,不能使用. 以上两种简易脲酶活性估测方法在国内各饲料厂被广泛采用,尤其是后者在膨化大豆粉生产的在线检测上很普遍.尽管这两种方法原理一样,但是,因其操作过程差异,所以对膨化大豆粉品质的反映内容也不尽相同.三、液态法和半固态法之比较首先需要说明的是,这两种脲酶活性快速检测方法没有行业约定俗成的名称,笔者接触过的企业均只采用其中的一种方法,对前者可以称之为“试管法”,后者称之为“表面皿法”,根据其实施的过程及样品的状态,笔者将其区分为“液态法”和“半固态法”.从实施方法来看,液态法是过程检测,从开始一直到规定时间段结束,而半固态法属于断点检测,是5分钟后看结果；液态法通过控制各个体合格,总体自然合格,而半固态法要求的是总体符合统计学上的合格,即允许部分个体不合格.简单地说,液态法要求每一个微粒的熟化程度均要满足5分钟以内不变色,如果一个不合格,整个批次为不合格；而半固态法允许部分微粒在5分钟内变色,部分不合格,总体可以是合格的.从这点上来说,液态法对膨化大豆粉的品质要求更高,控制更严格,不仅要求熟化,而且要均匀熟化.举例说明,如果在熟化完全的大豆粉样品中掺入微量（可以是一粒）生大豆粉,液态法会立即变色从而判定为不合格,而半固态法只是增加了一个变色点,总体上仍是合格的.从上可以看出,这两种检测方法对膨化大豆粉品质的反映内容是不一样的.半固态法反映的是产品符合统计学上的合格,而液态法反映的是完全合格.这两种不同检测方法对膨化设备的要求也是有差别的,液态法要求设备能均匀熟化,而半固态法允许产品出现部分不合格,只要总体上符合就可以,对膨化设备的要求自然要低. 可能会有人疑问,膨化大豆粉出来的不都应该是均匀一致的吗?其实不然,物料在膨化机内受到湿、热、机械剪切的共同作用从而熟化,机械剪切对膨化大豆粉所起的作用大约能占三成多,如果结构设计上缺陷或部件磨损,就会导致熟化不均匀.目前湿法膨化大豆粉的出料温度大都在135度左右（对家禽和猪要求可能低点）,六年前,笔者曾遇到过膨化大豆粉出料温度在170度,用液态法检测仍不合格,出来的料有熟的,有褐变的,还有少许夹生的,如果用半固态法检测,估计就合格了.次年,一膨化厂使用某企业膨化机生产膨化大豆粉,因不熟被退货六十吨,根据大部分企业采用半固态法检测的情况,将其以一定比例掺入熟化料中,最终符合统计学上的合格.上述事件,大概就是这两种不同测定方法的实践意义吧.脲酶urease（水解酶）：脲酶试验原理：存在于大多数细菌、真菌和高等植物里.它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解.脲酶的作用是极为专性的,它仅能水解尿素,水解的最终产物是氨和碳酸.土壤脲酶活性,与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关.根际土壤脲酶活性较高,中性土壤脲酶活性大于碱性土壤.人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况.土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量,也可以通过测定未水解的尿素量来求得.本方法是测定生成的氨量.试剂：1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素,用水溶至100ml.3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水.将两溶液合并,用1mol/LNaOH将PH调至6.7,用水稀释至1000毫升.4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇,加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮,用乙醇稀释至100毫升（A）,存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）.将AB溶液保存在冰箱中.使用前将2溶液各20毫升混合,用蒸馏水稀释至100毫升.5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂,至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定.6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,得到1ml 含有0.1mg氮的标准液标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml,定容至100ml,即稀释了10倍,吸取1,3,5,7,9,11,13ml移至50ml容量瓶,加水至20ml,再加入4ml苯酚钠,仔细混合,加入3ml次氯酸钠,充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度.将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定,以标准溶液浓度为横坐标,以光密度值为纵坐标绘制曲线图.取新鲜土壤7份,每份30g,装于棕色广口瓶中,先将1,3－二氯丙烯溶于丙酮（定量）,6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1,3－二氯丙烯,使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500µg/g,另1份相应加入1.5ml的丙酮作为对照,然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量,以便补充水分）.放置于25℃恒温培养箱,培养后第0d、1d,5d,10d（前10d密封,后来测定的敞口）、20d,30d,40d,50d分别取土样检测脲酶的活性.取样前,反复旋转广口瓶,混匀土样,一个处理随机取3个重复.1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中.2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7）,并仔细混合4) 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中,培养24h5) 培养结束后,用热至38摄氏度水稀释至刻度,仔细摇荡,并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中.6) 显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中,加入10ml蒸馏水,充分震荡,然后加入4ml苯酚钠,仔细混合,再加入3ml次氯酸钠,充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度,溶液呈现（青定）酚的蓝色.7) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽,于578nm处将显色液进行比色测定.8) 无土对照：不加土样,其他操作与样品实验相同.以检验试剂纯度,整个实验设置一个对照9)无基质对照：以等体积的水代替基质,其他操作与样品实验相同.每个土样都设此对照.结果计算：土壤脲酶活性以24小时后100g土壤中NH3－N的毫克数表示.M＝（X样品－X无土－X无基质）*100*10式中：M－土壤脲酶活性值X样品――样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数X无土――无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数X无基质――无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数100 ――样品定容的体积与测定时吸取量的比值10 ――酶活性单位的土重与样品土重之比值注意事项：当脲酶活性为3-80微克NH3-N时,本法能获得可靠结果.当脲酶活性小于3微克NH3-N,培养时间需增至24小时（已经24h了）（计算时应考虑这一点）计算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg数表示.NH3-N（mg）＝a*2A：从标准曲线查得NH3-N毫克数2 ：换算成1k土的系数.。
脲酶试验操作规程(3篇)
第1篇一、目的本规程旨在规范脲酶试验的操作流程，确保试验结果的准确性和可靠性。
二、原理脲酶是一种催化脲分解成氨和二氧化碳的酶。
在本试验中，脲酶将脲分解，产生的氨与酸化后的水杨酸酚反应，生成紫色化合物，通过比色法测定脲酶的活性。
三、试剂与材料1. 试剂：- 脲酶试剂：含有脲、水杨酸酚、氢氧化钠、硫酸铜等成分的溶液。
- 酸化试剂：含有硫酸的溶液。
- 标准氨溶液：已知浓度的氨溶液。
- 比色试剂：用于比色的溶液。
- 比色仪：用于测定吸光度的仪器。
2. 材料：- 试管：用于加样和反应的容器。
- 移液器：用于精确量取试剂的仪器。
- 磁力搅拌器：用于混合溶液的仪器。
四、操作步骤1. 标准曲线制备：- 准备一系列已知浓度的氨溶液。
- 将氨溶液加入试管中，每组加入2ml。
- 加入等体积的酸化试剂，混匀。
- 加入等体积的脲酶试剂，混匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用比色仪测定吸光度，以氨浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 脲酶活性测定：- 准备待测样品，按需稀释。
- 将样品加入试管中，每组加入2ml。
- 加入等体积的酸化试剂，混匀。
- 加入等体积的脲酶试剂，混匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用比色仪测定吸光度。
- 根据标准曲线，计算样品中脲酶的活性。
五、注意事项1. 试剂应保存在阴凉、干燥、避光处，避免与有机溶剂接触。
2. 操作过程中应避免样品污染，确保实验结果的准确性。
3. 试剂加入顺序应严格按照操作规程进行，避免产生误差。
4. 实验过程中，严格控制反应时间，确保反应完全。
5. 使用比色仪时，注意校准仪器，确保测量结果的准确性。
六、结果记录与分析1. 记录每组实验的吸光度值。
2. 根据标准曲线，计算样品中脲酶的活性。
3. 对实验结果进行统计分析，判断脲酶活性是否符合预期。
七、质量控制1. 定期进行空白试验，以排除试剂和操作过程中的干扰。
2. 使用已知脲酶活性的标准样品，对实验结果进行校准。
3. 定期对仪器进行维护和校准，确保实验结果的准确性。
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脲酶urease（水解酶）：
脲酶试验原理：
存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。
它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。
脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。
土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。
根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。
人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。
土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。
本方法是测定生成的氨量。
试剂：
1）甲苯
2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。
将AB溶液保存在冰箱中。
使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液
标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取0，1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml 苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。
将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。
操作步骤
1) 称取5g过1mm筛的风干土样于50ml容量瓶中。
2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟
3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔细混合
4) 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h
5) 培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。
6) 显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸馏水，充分震荡，然后加入4ml苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现靛酚的蓝色。
7) 1h内在（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm 处将显色液进行比色测定。
8) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。
以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照
9)无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。
每个土样都设此对照。
结果计算：
脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg数表示。
NH3-N（mg）＝a*2
A：从标准曲线查得NH3-N毫克数
2 ：换算成1g土的系数。
以24h后1g土壤中释放出的酚的质量（mg）表示磷酸酶活性。
脲酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m
式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；
a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；
a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；
V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；m表示烘干土重。