糖皮质激素受体在类风湿关节炎外周血单个核细胞中表达水平的研究

糖皮质激素受体在类风湿关节炎外周血单个核细胞中表达水平的研究李薇１于孟学１＊王国锋２曹金１张红宇３杨玲４刘利成４【摘要】目的探讨类风湿关节炎（ＲＡ）患者外周血单个核细胞中糖皮质激素受体（ＧＲ）α、βｍＲＮＡ的表达水平及其与ＲＡ发病机制、活动性的关系。

方法从４４例ＲＡ患者（活动期２４例、缓解期２０例）、２０例健康对照人群外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）中提取总ＲＮＡ，并逆转录为ｃＤＮＡ。

应用实时荧光定量聚合酶链反应（ＲＴ－ＦＱ－ＰＣＲ）检测ＧＲα和ＧＲβｍＲＮＡ的表达水平，并研究其与血沉（ＥＳＲ）、Ｃ反应蛋白（ＣＲＰ）、类风湿因子（ＲＦ）的相关性。

结果ＲＡ患者ＧＲα和ＧＲβｍＲＮＡ的表达水平均明显高于健康对照人群（Ｐ﹤０．０１）；活动期ＲＡ患者ＧＲβｍＲＮＡ表达水平（－３．５４４２±０．８０１７）明显高于缓解期ＲＡ患者（１．２１７５±１．５９６９）（Ｐ﹤０．０１）；活动期ＲＡ患者ＧＲαｍＲＮＡ表达水平（４．２３３３±２．１７７５）与缓解期ＲＡ患者（４．２９８５±１．６１０９）比较无显著性差异（Ｐ﹥０．０５）；ＲＡ患者ＧＲβ表达水平与ＣＲＰ呈正相关（Ｐ＝０．０１），与ＥＳＲ、ＲＦ均无关；ＲＡ患者ＧＲα表达水平与ＣＲＰ、ＥＳＲ、ＲＦ均无关。

结论ＧＲα和ＧＲβ的表达异常可能参与了ＲＡ的发病；ＧＲβ表达水平与ＣＲＰ呈明显正相关，提示其可能与ＲＡ疾病活动性相关。

【关键词】类风湿关节炎糖皮质激素受体逆转录－实时荧光定量聚合酶链反应ＴｈｅｌｅｖｅｌｏｆｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒｏｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｃｙｔｅｓｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＲｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓＬＩＷｅｉ，ＹＵＭｅｎｇ－ｘｕｅ，ＷＡＮＧＧｕｏ－ｆｅｎｇ，ｅｔａｌ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＲｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７３０）【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｃｌｕｄｉｎｇｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ－α（ＧＲα）ａｎｄｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ－β（ＧＲβ）ｍＲＮＡｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣｓ）ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＲｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＲＡ）ａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｉｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｗｉｔｈＲＡ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｏｔａｌＲＮＡｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＰＢＭＣｓｉｎ４４ＲＡｐａｔｉｅｎｔｓ（２４ｏｎａｃｔｉｖｅｓｔａｇｅａｎｄ２０ｏｎｓｔａｂｌｅｓｔａｇｅ）ａｎｄ２０ｈｅａｌｔｈｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓｗａｓｒｅｖｅｒｓｅｌｙｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｉｎｔｏｃＤＮＡ．Ｔｈｅｒｅａｌｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓ－ｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ＦＱ－ＰＣＲ）ｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｘａｍｉｎｅｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＧＲαａｎｄＧＲβｍＲＮＡ．ＴｈｅｌｅｖｅｌｏｆＥＳＲ，ＣＲＰａｎｄＲＦｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｌｅｖｅｌｏｆｂｏｔｈＧＲαａｎｄＧＲβｍＲＮＡｆｒｏｍＲＡｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ｐ﹤０．０１）．ＴｈｅｌｅｖｅｌｏｆＧＲβｍＲＮＡｆｒｏｍａｃｔｉｖｅＲＡｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉ－ｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｓｔａｂｌｅＲＡｇｒｏｕｐ（Ｐ﹤０．０１）．ＴｈｅｌｅｖｅｌｏｆＧＲαｍＲＮＡｂｅｔｗｅｅｎａｃｔｉｖｅＲＡｇｒｏｕｐａｎｄｓｔａｂｌｅＲＡｇｒｏｕｐｈａｄｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＲβｉｎＲＡｐａｔｉｅｎｔｓｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＣＲＰ（Ｐ＝０．０１），ｂｕｔｉｔｈａｄｎｏｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈＥＳＲａｎｄＲＦ．ＴｈｅｌｅｖｅｌｏｆＧＲαｗａｓｎｏｔａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＣＲＰ，ＥＳＲａｎｄＲＦ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓＴｈｅａｂｎｏｒｍａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＲαａｎｄＧＲβｍａｙｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＲＡ．ＧＲβｍａｙｂｅｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＲＡ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ＲｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓＧｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒＲｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｒｅａｌｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ＦＱ－ＰＣＲ）・论著・类风湿关节炎（ＲＡ）是一个以累及周围关节为主的多系统性、炎症性的自身免疫病，病因至今未明。

有研究发现，ＲＡ患者体内糖皮质激素调节异常可能参与了发病［１］。

糖皮质激素通过与糖皮质激素受体结合发挥作用，目前发现人类糖皮质激素受体（ｈＧＲ）主要有ｈＧＲα和ｈＧＲβ两个亚型。

近年来，有学者在体外研究中发现某些促炎因子（如ＴＮＦ－α、１．中国医学科学院北京协和医院风湿免疫科（邮编１００７３０）２．中国石油天然气集团公司中心医院风湿免疫科３．首都医科大学宣武医院风湿免疫科４．中国医学科学院北京基因组研究所＊通讯作者表１ｈＧＲα、ｈＧＲβ、β－ａｃｔｉｎ基因引物序列及扩增产物长度引物序列扩增产物长度ｈＧＲα上游引物：５’－ＡＡＴＧＧＴＴＧＣＣＴＴＡＡＡＧＡＡＡＧＴＣＧ－３’下游引物：５’－ＣＡＡＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＴ－３’１３９ｂｐｈＧＲβ上游引物：５’－ＴＧＣＡＣＴＴＣＧＴＴＧＴＣＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＣＡ－３’下游引物：５’－ＴＣＣＴＡＡＡＡＧＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴ－３’１３０ｂｐβ－ａｃｔｉｎ上游引物：５’－ＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴ－３’下游引物：５’－ＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＴＴＣＧＴＧＧ－３’８３ｂｐＩＬ－１等），可上调ｈＧＲβ的表达［２］，而ＴＮＦ－α、ＩＬ－１等促炎因子在ＲＡ的发病中起着重要作用，因此推断糖皮质激素受体很可能参与了ＲＡ的发病。

目前，关于ＲＡ患者体内糖皮质激素受体的表达水平与正常人之间是否存在差异，国内报道较少。

我们于２００６年１０月至２００７年４月应用实时荧光定量聚合酶链反应（ＲＴ－ＦＱ－ＰＣＲ）对我院风湿免疫科门诊４４例ＲＡ患者ＧＲα和ＧＲβｍＲＮＡ的表达水平进行检测，并进一步观察其与血沉（ＥＳＲ）、Ｃ反应蛋白（ＣＲＰ）等炎症活动指标的相关性，报告如下。

对象与方法一、一般资料本组４４例，入选患者均符合１９８７年美国风湿病学会修订的ＲＡ诊断标准，近１年内均未应用过激素治疗。

根据《新药（西药）临床研究指导原则》将患者分为活动期和缓解期［３］。

符合下列５项中的４项即被认为处于活动期：①休息时关节有中度疼痛；②晨僵≥１ｈ；③有３个以上关节肿胀；④关节触压痛﹥８个关节；⑤ＥＳＲ：男﹥２０ｍｍ／ｈ，女﹥３０ｍｍ／ｈ，以及至少伴有１～２项免疫学指标异常。

本组中处于活动期的ＲＡ患者２４例，男５例，女１９例，年龄２３～６７岁，平均４８．３８岁，活动期患者均未应用过激素及免疫抑制剂；处于缓解期的ＲＡ患者２０例，男３例，女１７例，年龄２７～６５岁，平均４６．８０岁；选取同期健康体检者２０例作为对照组，男６例，女１４例，年龄２８～６０岁，平均４３．５１岁。

二、方法（一）试剂与仪器淋巴细胞分离液（北京生化试剂公司），Ｔｒｉｚｏｌ试剂（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司），ＳｕｐｅｒｓｃｉｐｔＩＩ逆转录试剂盒（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司），荧光定量ＰＣＲ反应所用试剂为ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ公司），７３００荧光定量ＰＣＲ扩增仪（ＡＢＩ公司）。

（二）ＰＣＲ引物设计根据ＧｅｎｅＢａｎｋ中ｈＧＲα、ｈＧＲβ、β－ａｃｔｉｎ的基因序列设计引物用于荧光定量ＰＣＲ检测（表１）。

引物均由北京华大基因生物技术有限责任公司合成。

（三）实验步骤１．外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）的制备：抽取ＲＡ患者和健康对照者早晨（８：００～９：００）空腹外周ＥＤＴＡ抗凝血８ｍｌ，用淋巴细胞分离液（Ｆｉｃｏｌｌ）分离出ＰＢＭＣｓ，加入１ｍｌＴｒｉｚｏｌ后，－８０℃保存用于ＲＮＡ的制备。

２．总ＲＮＡ的提取：从－８０℃冰箱中取出ＰＢＭＣｓ，彻底混匀，室温静置１０ｍｉｎ；加入０．２ｍｌ氯仿，剧烈震动１５ｓ，室温静置３ｍｉｎ；４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，将上清转入一新离心管，加入等体积异丙醇混匀，－２０℃放置３０ｍｉｎ；４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；弃上清，加入１ｍｌ７５％乙醇洗涤沉淀，４℃８０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；吸干乙醇，空气中干燥；加入４０μｌＤＥＰＣ水（含ＲＮＡ酶抑制剂）溶解ＲＮＡ。

所提取的总ＲＮＡ用紫外分光光度计定量并检测其纯度，Ａ２６０／Ａ２８０≥１．８为合格。

所提取的总ＲＮＡ完整性经琼脂糖电泳鉴定，可见明显的２８Ｓ、１８Ｓ两条带。

３．ＲＮＡ逆转录合成ｃＤＮＡ：ＯｌｉｇｏｄＴ１μｌ、ＲＮＡ５μｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ１μｌ、ＤＥＰＣ水５μｌ混合，６５℃孵育５ｍｉｎ，立即置于冰上；加入０．１ｍｏｌ／ＬＤＴＴ２μｌ、５＊ｂｕｆｆｅｒ４μｌ、ＲＮＡ酶抑制剂１μｌ，４２℃２ｍｉｎ；加入逆转录酶１μｌ，４２℃５０ｍｉｎ，７５℃１５ｍｉｎ。

ｃＤＮＡ产物置于－２０℃保存。

４．实时荧光定量ＰＣＲ检测：将患者及健康人的ｃＤＮＡ在荧光定量ＰＣＲ仪上检测，建立总体积为２０μｌ的反应体系：５×ｒｅａｌｔｉｍｅｂｕｆｆｅｒ４μｌ，上下游引物各０．５μｌ，ＳＹＢＲ２μｌ，Ｍｇ２＋（２５０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．５μｌ，ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．５μｌ，ＥＸｔａｑ０．３μｌ，ｃＤＮＡ２μｌ，Ｈ２Ｏ９．７μｌ。

扩增反应条件为：９５℃５ｍｉｎ；９５℃３０ｓ，６０℃２０ｓ，７２℃２０ｓ，４０ｃｙｃｌｅｓ；９５℃１５ｓ，６０℃３０ｓ，９５℃１５ｓ。

反应结束后，电脑自动分析荧光信号并将其转换为Ｃｔ值。

Ｃｔ值是指每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。

研究表明，每个模板的Ｃｔ值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起表２各组ｈＧＲαｍＲＮＡ、ｈＧＲβｍＲＮＡ的相对定量表达水平（用ΔＣｔ表示）及ｈＧＲβ／ｈＧＲα的比较（用ΔΔＣｔ表示）（ｘ!±ｓ）组别例数ｈＧＲαｍＲＮＡｈＧＲβｍＲＮＡｈＧＲβ／ｈＧＲαＲＡ活动组２４４．２３３３±２．１７７５－３．５４４２±０．８０１７－７．７７７５±２．４６８３ＲＡ缓解组２０４．２９８５±１．６１０９１．２１７５±１．５９６９－３．０８１０±１．６９７９健康对照组２０６．９８２０±１．０２４８８．６７４３±０．５６０３１．６９２４±０．８６２９始拷贝数越多，Ｃｔ值越小，也就是说目的基因含量越高，Ｃｔ值越小。