斑马鱼 sox9b 基因片段扩增及其同源性分析
斑马鱼sox9b 基因片段扩增及其同源性分析
生命科学学院
葛肖燕
摘 要 斑马鱼Danio rerio 是一种新兴的模式生物由于其具有个体小产卵多发育快体外受精胚胎
透明易于观察饲养简便等优点在发育生物学和遗传学研究中得到了广泛的应用
Sox 家族的主要特征是具有一个与Sry 高度同源的HMG box 由于Sox 家族中的许多基因在胚胎发育过程中起着重要的作用虽然Sox 基因家族的发现历史只有十几年但对这一家族的研究进展非常迅速已经成为一个十分庞大的家族1994年Foster 等人利用和克隆Sry 基因相似的方法分离出了一个位于常染色体上的基因Sox9不久前Chiang E. 等人在斑马鱼中筛选到两个sox9基因分别命名为sox9a 和sox9b
本实验根据sox9基因的保守区域设计了4个引物扩增斑马鱼sox9基因质粒斑马鱼的成熟雄性个体和雌性个体的基因组DNA 中的sox9基因片段以验证sox9基因在鱼类中的存在方式即雌雄个体中的差异并对sox9基因进行生物信息学方面的分析
关键词斑马鱼sox9b PCR 同源性分析
Abstract Zebrafish Danio rerio is a new model organism which is used broadly in developmental
biology and genetics. It is small, cheap, and externally fertilized. It lays a lot of eggs and develops fast. And its embryo is transparent.
Members of the Sox family are characterized by the presence of a DNA-binding HMG domain, which is highly homological to Sry gene. Members of the Sox family are involved in a diverse range of developmental processes. A lot of Sox genes has been identified, which makes the Sox family very big, although it has a relatively short history of research. In 1994, Foster cloned a Sox9 gene which is located in euchromosome, using the method similar to the one used in cloning Sry gene. Several months ago, Chiang E. cloned two sox9 genes in zebrafish, which are called sox9a and sox9b.
We designed four primers according to the sequence of sox9b. We amplified the conserved
sequence of zebrafish sox9b, using the plasmid which contained the zebrafish sox9b gene, the genome of adult male and female zebrafish as the template. Then we can test the difference of sox9b between the male and female zebrafish. We also studied the phylogeny of sox9 genes in vertebrate animals. Key Words: zebrafish, sox9b, PCR, homological analysis
第一部分 前 言
一
斑马鱼的研究历史 斑马鱼是近年来发展起来的一种脊椎动物模式生物由于其具有个体小产卵多发育
快体外受精胚胎透明易于观察饲养简便等优点在发育生物学和遗传学研究中得到了广
泛的应用
斑马鱼zebrafish 学名原为Brachydanio rerio 后更名为Danio rerio 仅有二十多年
的研究历史是一种名副其实的新兴模式生物但它的发展速度却是惊人的其创始性工作由
美国俄勒冈大学已故的著名遗传学家George Streisinger 首先开始1981年他的关于斑马鱼
人工雌核发育的研究在Nature 上发表[1]之后斑马鱼开始受到人们的关注探索的序幕由
此拉开俄勒冈大学特别成立了斑马鱼研究中心全世界越来越多的实验室投身于斑马鱼研究
中积累了丰富的资料1994年以斑马鱼发育和遗传为题的冷泉港会议召开
Nature 和Science 都为此发表了专题述评[23]认为斑马鱼已完全具备作为脊椎动物模
式种的条件此后斑马鱼研究工作取得了飞速的发展美国国立卫生院已经把它列为仅次于
小鼠的第二优先的脊椎动物模式生物英国科学家宣布启动斑马鱼基因组计划[45]
二斑马鱼作为模式生物的优点
斑马鱼原产于印度是一种小型的热带淡水鱼类体长3-4cm, 染色体数为25对斑马鱼
作为模式生物有很多独特的优点主要表现在以下几个方面[6]
1生长发育快速
斑马鱼从受精卵发育到性成熟只要三个月左右有利于缩短研究周期
2优良的繁殖性能
每尾雌鱼每次可产卵数百枚甚至上千枚每星期可产卵一次因此可以提供大量的胚胎作
为实验材料产卵时间易于控制可以采用隔离雌雄或光控制等方法尤其值得称道的是斑马
鱼体外受精胚胎透明且在母体外发育易于观察和实验例如在转基因实验中斑马鱼就不
象胚胎深埋于体内的小鼠那样需要进行手术不仅方便而且提高的存活率
3体积小易于饲养
斑马鱼成体最大仅5cm便于大规模养殖饲养条件粗放既耐寒又耐热对水质要求不严对饵料要求也不挑剔养殖花费很小
4成熟的遗传胚胎操作技术
二十多年的研究经验确立了一系列成熟的操作技术主要有突变技术转基因技术雌
核和雄核发育技术细胞系谱标记技术细胞移植技术和细胞核移植技术等成为斑马鱼研究
的重要手段
三斑马鱼基因组计划
斑马鱼有25对染色体基因组不比人小2000年英国科学家宣布斑马鱼基因组计划即
将启动并计划于2002年底完成这项计划由Wellcome信托公司医学研究慈善组织提供资
金在英国桑格中心Sanger Center进行[45]斑马鱼基因组的破译必将大大促进斑马鱼
的研究帮助研究者破解人类及其它物种基因的功能
四斑马鱼网上资源
与同类研究相比斑马鱼资源共享工作做得很好核心网站首推俄勒冈大学斑马鱼研究中
心的斑马鱼信息网https://www.360docs.net/doc/b38109246.html,它的数据库资料十分全面几乎涵盖了斑马鱼研究中的
所有有用信息如基因组发育突变和野生种系资料和世界各研究团体的资料等[7]此外在
NCBI NIH等的斑马鱼网页上也有关于斑马鱼基因的数据
五Sox基因的研究现状
Sox家族的主要特征是具有一个与Sry高度同源的HMG box由于Sox家族中的许多基因在胚胎发育过程中起着重要的作用虽然Sox基因家族的发现历史只有十几年但对这一家族的研究进展非常迅速已经成为一个十分庞大的家族
1990年科学家成功分离出位于人类Y染色体上的性别决定基因Sry基因Sex
Determining Region Y gene Sry基因在胚胎发育中决定着睾丸的形成[8]利用人类Sry基因
做探针在小鼠基因组中筛选到几个阳性克隆克隆中的插入片段都含有一个编码70~80个氨基酸的保守序列即HMG box High Mobility Group box [9]此后又发现了更多具有HMG
box 的基因其中包括与Sry有高度相似性的基因因此将HMG box区与Sry基因表达产物具有60%以上氨基酸序列相似性的编码基因都命名为Sox基因( Sry-related HMG box gene)
[10]
Sox基因家族的首要特性是具有HMG box它所编码的L型蛋白质区域是高度保守的具有70~80个氨基酸可以识别特异的DNA序列并与之结合其识别的DNA序列为5’-
(A/T)(A/T)CAA(A/T)G-3’ [11]
目前已在各种不同物种包括哺乳类鸟类爬行类鱼类和昆虫中克隆出至少100多个
Sox基因根据HMG box 的氨基酸同源性可以将所有Sox蛋白分为A~G共7个组[12]同一
组内的Sox蛋白在HMG box区至少有80%的氨基酸同源性此外每一组还有自己的特性
如哺乳动物的编码B组和C组Sox蛋白的基因是不含内含子的而D组的Sox蛋白则含有一个锌指结构它们的功能涉及到许多发育过程的调控如性别决定早期胚胎发生神经系
统发育晶状体的发育软骨的形成以及造血作用等[13]
六Sox9基因的研究现状
在Sry基因发现之后人们发现Sry基因的突变不能解释所有的XY雄性性别逆转的机制部分患者具有正常的Sry基因而一些XX雄性个体中并不存在Sry基因人类有
一种骨骼形成异常综合症Campomelic Dysplasia (CD)其特征为先天驼背长骨弯曲肩
胛骨发育不全盆骨不成形不能形成软骨同时伴有性别逆转组织切片显示有性腺败育
这说明导致CD的基因可能也参与了睾丸的决定和发育1994年Foster等人利用和克隆Sry
基因相似的方法分离出了这个位于常染色体上的基因并根据其结构特点命名为Sox9[14]CD
患者通常在Sox9基因的HMG box区发生错义或无义突变从而阻碍了与DNA的结合
目前对Sox9的研究主要集中在与CD症状有关的骨骼异常和性别逆转上这里主要介绍Sox9基因在脊椎动物性别决定中的作用在雄性小鼠中Sox9基因在Sry基因开始表达之后
立即表达它的表达伴随着睾丸细管中的滋养细胞Sertoli细胞的整个发育过程[15]它的一个
主要的下游基因是AMH (anti-Mullerian hormone)基因这一基因编码脊椎动物早期雄性发育中两大荷尔蒙之一的抗缪勒氏激素另一个是睾丸激素[16]Sox9基因在AMH的激活过程中起了关键性作用
七斑马鱼的sox9基因
不久前Chiang E. 等人在斑马鱼中筛选到两个sox9基因分别命名为sox9a和sox9b[17]
并证明这两个基因与其它脊椎动物的Sox9基因是同源的遗传图谱分析表明它们所在的2个染色体片段是在放射型鳍的鱼类种系发生过程中的一次大规模基因组复制过程中复制形成的
在胚胎发生过程中sox9a和sox9b基因的表达谱是有区别的但是又在中枢神经系统某些
感觉器官发育中的头部骨骼以及胸鳍发生区等区域有重叠表达区在成年鱼中sox9a基因
在许多组织中表达包括脑部肌肉鱼鳍和睾丸等等而sox9b基因的则局限于卵巢中的卵黄前卵母细胞中这些现象说明sox9a和sox9b基因可能在某些组织的发育过程中起着不同的作用
第二部分材料与方法
一材料试剂及仪器
1材料
1 1 菌种
E. coli JM109 基因型?80d lacZ ? M15,recA1,endA1,gyrA96,thi-1hsdR17(r k-,m k+),
supE44,relA1,deoR,? (lacZγ A-argF)U169
1 2 质粒 pcDNA3.0
来自清华大学孟安明教授实验室质粒图参附录
1 3 PCR引物
根据斑马鱼sox9基因保守序列设计由上海生工生物工程公司合成
引物碱基数分子量(Da) 序列
1 20 6110 5’ AAG GGC TAC GAC TGG TCT CT 3’
2 20 6147 5’ CGT CTG GGC TGG TAT TTG TA 3’
3 20 6159 5’ AGG CAG GTA CTG GTC GAA CT 3’
4 20 6017 5’ CGG ATA CTG CAC ACA CAC AC3’
2 主要试剂
Taq DNA多聚酶 5 u/μl (美国Promega)
dNTP 25 mmol/l (美国Promega)
MgCl2 25 mmol/l (美国Promega)
1 Kb DNA Ladder 1 μg/μl (GIBCO BRL PRODUCTS)
DL 2000 DNA Marker 5 μg /次宝生物工程有限公司
其它有机无机试剂均为国产分析纯试剂或自配试剂
3主要仪器
3 1 PCR扩增仪
GeneAmp PCR system 2400美国PERKIN ELMER公司
3 2 离心机
1)Biofuge 15R 高速台式冷冻离心机德国Haraeus公司
2)20PR-52D高速冷冻离心机日本HITACHI公司
3)TGL-16高速台式离心机上海医用分析仪器厂
3 3 电泳分析检测系统
1)PS 500XT DC电泳仪美国HOEFER SCIENTIFIC INSTRUMENTS公司
2)FS312V多功能紫外投射分析仪上海复生生物工程研究所
3)FR200 紫外可见分析装置上海复日生物技术实验研究所
4分析软件
Smart View TM生物电泳图像分析软件升级版上海复日科技有限公司
二实验方法
1.电击法感受态细胞的制备和电击转化
a.过夜菌以1接种量接入LB培养基37 300rpm 2.5h, 至OD 600=0.8
b.培养物倒入预冷离心管冰浴1530min
c.离心4000g 10min 4
d.弃上清收集菌体
e.加40ml10%甘油预冷悬浮沉淀转移至50ml离心管
f.冰浴10min
g.离心4000rpm 10min 4
h. e.f.g.重复一次
i.弃上清用预冷的10甘油洗沉淀2次
j.用预冷的GYT10%甘油0.125% yeast extract, 0.25% tryptone500~1000ul
调节终体积至OD 600=0.20.25
k.分装于30ul/0.5ml试管中液氮冻后置-80保存
转化1取30 μl感受态细胞加入1 μl质粒电击
25 μF200 ? 1.8 KV 4.0毫秒
2将菌液吸入1ml eppendorf 中摇菌45min, 37< 225转/分培养
3涂布于抗生素平板上培养过夜挑选阳性克隆
2.质粒抽提
a. 1 ml过夜菌液4°C 10K rpm离心min弃上清
b.加100 μl预冷sol I以悬浮菌体
c.加200 μl新鲜配制的sol II轻柔混匀冰上放置5 min
d.加预冷sol III 150 μl轻柔混匀冰上放置10 min使沉淀完全
e.4°C 12K rpm离心5 min
f.吸取上清(约500 μl)加等体积异丙醇混匀室温放置20 min
g.4°C 12K rpm离心5 min
h.弃上清以200 μl 70乙醇洗涤60°C 烘干
i.加20 μl 无菌ddH2O 1 μl RNase(100 mg/ml)65°C, 30 min
j.取2 μl电泳其余-20°C 保存
3.PCR
体系程序
10×Buffer 2.5 μl 94°C 5 min
dNTP (25 mmol/l) 2 μl ↓
MgCl2 (25 mmol/l) 2 μl 94°C 30 s
primer (20 mmol/l) ↓
1 0.5μl 60°C 30 s 35 cycles
2 0.5μl ↓
Taq (5 u/μl) 0.5 μl 72°C 45 s
模板 1 μl ↓
ddH2O 16μl 72°C 10 min
↓
25 μl 4°C ∞
同法PCR引物132434组合
4.抽提斑马鱼基因组 DNA
a.雌雄斑马鱼各一条除去所有的液体各放入合适的容器中在液氮中快速冷冻并
碾磨成粉末
b.准备抽提缓冲液大约10ml/g鱼
抽提缓冲液配方
10mM Tris pH 8
100mM EDTA pH 8
0.5% SDS
200ug/ml 蛋白酶K
c.将碾磨的粉末慢慢加入抽提缓冲液尽量混匀
d.50水浴过夜
e.冷却到室温用一体积饱和酚萃取两次轻轻混合直到形成乳状液
f.离心30005000g, 10min, 将水相移入新管
g.酚氯仿异戊醇25241萃取第三次离心水相移入新管冷却到室温用
一体积饱和酚萃取两次轻轻混合直到形成乳状液
h.离心30005000g, 10min, 将水相移入新管
i.加入NaCl到终浓度为200mM铺上2体积乙醇彻底混合DNA会立即沉淀肉眼可见j.除去液体加入70乙醇
k.离心5min5000g去掉乙醇65烘干
l.将DNA溶解在预先配制的溶液中配方如下
10mM Tris pH8
5mM EDTA
100ug/ml RNAse A
放在37水浴中帮助溶解不时轻轻混合和旋转
m.取2ul电泳其余-20保存
5.雌雄斑马鱼基因组的PCR
体系与质粒PCR相同
第三部分 结果与讨论
1 以质粒含斑马鱼sox9b 基因为模板的PCR 结果 a 引物2-4
结果如左图所示
为DL-2000 Marker
为2-4引物的PCR 产物引物浓度为50μ
M
为2-4引物的PCR 产物引物浓度为5μ
M
为2-4引物的PCR 产物引物浓度为2.5μ
M
批出500bp 大小条带符合引物设计预期
b
引物3-4
结果如左图所示
为DL-2000 Marker
为34引物的PCR 产物
引物浓度为2.5μM 为34引物的PCR 产物
引物浓度为5μ
M 为34引物的PCR 产物
引物浓度为50μ
M
批出400bp 大小条带
符合引物设计预期
序列结果见附录
2雌鱼基因组PCR 结果3-4
引物
为DL-2000 Marker
~10为不同浓度的3-4引物
和模板组合的PCR 产物
3雄鱼基因组PCR 结果引物
2-4
为DL-2000 Marker ~为不同浓度的2-4引物和模 板组合的PCR 产物
4雄鱼基因组PCR 结果引物
3-4
为
DL-2000 Marker
~为不同浓度的3-4引物和模
板组合的PCR产物
讨论
一PCR结果的分析
所用的质粒含有斑马鱼sox9b cDNA由于现有的斑马鱼sox9序列信息均是关于cDNA 的故引物设计时只能按照sox9b的cDNA 设计从sox9b 序列信息分析其基因具有两个保守区段其一即为HMG box我们根据HMG box 设计了一对引物根据sox9b的另一保守序列设计了另一对引物
在以质粒为模板时
扩增出理想的条带在以斑马鱼雌雄成鱼的基因组DNA 为模板时扩增出的条带均大于质粒扩增结果说明sox9b 很可能含有内含子雄性的2-4引物3-4引物均扩增出了条带而雌性只扩增出3-4引物的2-4引物批了几次都没有结果可能雌雄鱼的sox9b 基因有所不同性别决定机制中起重要作用的两个基因分别为Sry 基因和Sox9
基因Sry
基因只在哺乳动物的雄性个体中出现而Sox9基因在雌雄个体中均有而其在雌雄个体中的序列是否有所差别
需要进一步验证
二Sox9基因的进化分析
采用clustalx1.81软件构建脊椎动物Sox9基因进化树如下各物种的Sox9基因序列来源于
GenBank
an
m ous e
c hic k en
z ebra9a
z ebra9b
0从这张进化树
看基本符合经典的进化理论如哺乳类的人猪鼠同属一个分支斑马鱼sox9b基因似乎比其它脊椎动物的Sox9基因进化得更快注意斑马鱼sox9a基因与鳟鱼的Sox9基因同属一支而却不与斑马鱼sox9b基因在一起可能的解释是Sox9基因的duplication发生在斑马鱼和鳟鱼的种系分化之前而鳟鱼的Sox9b基因可能在进化过程中丢失也可能存在而未被发现
三关于质粒的获得
我们使用的质粒是清华大学孟安明教授实验室的pcDNA3.0-sox9b为了方便邮寄采用
了将少量质粒滴入滤纸的方法并用保鲜膜包裹以减少损失使用时将含有质粒的滤纸剪
成碎片溶于4的TE中电击转化后挑阳性克隆抽质粒开始我们担心经过几天的运输后
质粒恐怕已经所剩无几看阳性克隆前很是担心但事实证明这种质粒短期保存方法还是很
不错的虽然阳性克隆浓度有所下降
四关于抽提基因组DNA
由于是抽提组织DNA而非常规的抽提血液DNA斑马鱼的血液非常少抽提血液
DNA不现实我们采用了Westerfield,M. 的“The Zebrafish Book.” (1993), Univ. of Oregon
Press, Eugene, OR.中的方法这种方法可以用于建库等所有用途是一种高纯度的抽提方
法由于我只是需要用于PCR并不需要太高的纯度我们根据实验室的条件对原Protocol进行了一定程度的简化和改进
1在液氮中将斑马鱼碾磨成粉末
这一点很难做到实际操作中改为先快速冷冻一段时间取出后碾磨再冷冻再碾磨
一般5到6个回合后就可以碾磨得比较碎了不过这真的需要不少体力也有别的
Protocol中无需液氮碾磨直接用剪刀剪碎后用蛋白酶K消化但两种方法对比发现液氮碾磨后大大提高了蛋白酶K的消化效率因此提高了此后的DNA抽提效率液氮碾磨后蛋白酶K消化后的产物几乎是澄清的黄色溶液不然的话液体中会有许多不溶物两相对比效
果十分明显
2用TE 融解DNA
基因组DNA不像质粒很难溶解在TE中The Zebrafish Book中的方法是在37水浴中
溶解几个小时而另一份Protocol中是在4中溶解过夜我还是采用了37的方法虽然有
些担心这样会加速DNA的分解所以溶解的时间也不能太长在溶解过程中要常常轻轻混合和旋转
3TE溶解后续步骤
本来还有萃取乙醇沉淀洗涤TE再次溶解等步骤鉴于PCR并不需要太高的纯度
这些步骤都略去不做了
五关于PCR
在实验中我们面临的最主要问题就是PCR正如我们所了解的PCR实在是一门非常博大
精深的技术它的复杂性远远超出了我们的了解范围PCR摸条件实在是一个枯燥而繁琐的过
程需要不断改变离子浓度引物浓度模板浓度以及扩增时的温度时间循环次数等
以获得最优条件质粒PCR还是相对简单的由于使用的是纯的质粒溶液浓度又很高重复了两次就批出来了结果还是令人满意的基因组DNA的PCR就不那么简单了前后批了无数次结果还是不稳定甚至相同条件第一次批出来了第二次又批不出了由于基因组DNA中
可能含有杂蛋白而且在那样庞大的基因组中扩增一个仅有几百bp的片段当然比质粒PCR
要难得多有很长一段时间唯一的事就是反复的PCR对超负荷工作的PCR仪心生愧疚
参考文献
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16Kent J, Wheatley SC, Andrews JE, et al. A male-specific role for Sox9 in verterbrate sex determination.
Development, 1996, 122:2813-2822
17Chiang EF-L, Pai CI, Wyatt M, et al. Two Sox9 genes on duplicated zebrafish chromosomes: expression of similar transcription activators in distinct sites. Developmental biology, 2001, 231:149-163
致谢
本文的完成首先要感谢乔守怡教授和邓可京博士感谢他们创造的浓厚的学术气氛和亲切的工作环
境使我能顺利地完成这篇论文乔老师在百忙中依然关心我的实验让我十分感动
同时我要感谢我的师兄陈峻我的实验是在他的手把手的指导下完成的从实验设计的讨论实验技
术的学习实验思路的传授到实验过程中出现的问题的分析与排除都浸透了他的心血他渊博的学识和诚
恳的为人让我深深地敬佩
其次我要感谢金锋同学感谢她对我的无私帮助她极其认真的工作态度也值得我学习实验室中的
周琼琼吴洁和罗轶英等同学也都给予了我很大的帮助在此一并表示我真诚的感谢
最后我还要衷心地感谢我的父母他们永远站在我的身后以全部的爱关心我支持我鼓励我四年
了我陪伴你们的日子太少对于你们除了愧疚就是无尽的感谢在此致以深深的祝福愿你们健康平
安
附
录
1 pcDNA3.0质粒图
Comments for pcDNA35446 nucleotides CMV promoter bases 209-863
T7 promoter bases 864-882
Polylinker bases 889-994
Sp6 promoter bases 999-1016
BGH poly A bases 1018-1249
SV40 promoter bases 1790-2115
SV40 origin of replication bases 1984-2069 Neomycin ORF bases 2151-2945
SV40 poly A bases 3000-3372
ColE1 origin bases 3632-4305
Ampicillin ORF bases 4450-5310
2以质粒含斑马鱼sox9b 基因为模板时的PCR 产物测序结果
文献综述-斑马鱼及其应用
斑马鱼及其研究应用 作者：杜颖指导老师：张源淑 摘要：斑马鱼作为一种新兴的重要模式动物之一，体外受精、胚胎透明，因此可在显微镜下直接观察发育过程及检测药物引起的内脏组织变化，在生命科学领域中应用前景十分广阔。斑马鱼体型小,适合高通量研究,还具有生长繁殖周期短及其与人类高度相似的基因组等优点，已经广泛用于人类疾病模型的建立、新药研发和药物的筛选，此外，斑马鱼还被应用于毒理学、发育生物学和遗传学等的研究。因为斑马鱼对污染物反应灵敏，现已用于监测环境污染物及污水检测。本文主要从几个方面对斑马鱼的研究进展进行了整理和归纳。 关键字：斑马鱼模式动物科学研究发育感染药物 Zebrafish and Its Application Abstract:Zebrafish as an important model animal emerging, its in vitro fertilization, transparent embryo, internal organs can be directly observed during the development and testing organ change caused by drugs under the microscope, has very broad application prospects in the field of life sciences. zebrafish also has a live, high-throughput, growth and short reproduction cycles and highly similar to the human genome, etc., it is widely used in modeling human diseases, drug screening, and secondly, zebrafish also is applied in toxicology research, developmental biology and genetics, etc.. Because of its sensitivity, it has been used to monitor environmental pollutants and water testing.This paper mainly from several aspects of zebrafish research progress has been collated and summarized Key words:zebrafish Animal models Scientific research Development Infection Drug 斑马鱼(Danio rerio)又名蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼、印度斑马鱼,产于孟加拉、印度东部、巴基斯坦、缅甸、尼泊尔等地,是一种常见的热带淡水硬骨鱼。属辐鳍鱼纲( Actinopterygii)鲤科( Cyprinidae)。斑马鱼身体细长,呈纺锤形，成鱼体长约4-6cm,因全身布满深蓝色条纹似斑马样而得名。斑马鱼雌雄鉴别容易,雄鱼体型细长，颜色偏黄，条纹较为显著，纵纹为柠檬色；雌鱼身体肥胖，颜色较淡，纵纹呈蓝色加银灰色，在性成熟后腹部肥大。雌鱼每次可产卵300多枚，鱼卵易收集，其胚胎透明,繁殖能力强且生长发育速度快，对饲养要求低，可高密度饲养，与其他实验动物相比有很大优势，是一种非常受欢迎的实验动物模型。近三十年来，已有约20个斑马鱼品系的基因数据库资料，全球已有超过1500个斑马鱼实验室，而我国也有超过250个实验室利用斑马鱼开展相关研究。英国桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）于2013年完成了斑马鱼的参考基因组，研究人员在此基础上比较了斑马鱼与人类基因组的异同，并进行了系统性的全基因组分析.在此综合近几十年的研究，在胚胎及遗传发育学、基因组学、药物筛选、疾病模型的建立等方向探讨斑马鱼的研究成果及进展。 1.胚胎及遗传生物学方向 斑马鱼的发育分为6个阶段：卵裂期，囊胚期，原肠胚期、分裂期、成形期
临床微生物检测的基因同源性分析
临床微生物检测的基因同源性分析 医院感染的流行病学研究是临床微生物学工作者的重要课题，在医院感染监测的研究中，一个很重要的问题就是如何确定感染途径和传播途径，以采取有效预防和控制措施，从而防止医院感染或者暴发流行，因此对微生物鉴定和菌株同源性分析提出了更高的要求。 目前，传统的细菌鉴定和同源性分析技术已不能很好地满足医院感染诊断和流行病学调查的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变得愈来愈重要了。近年来分子生物学的理论和技术在细菌感染诊断中的渗透和广泛应用，使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学调查变得更加准确、简洁和快速。细菌DNA同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反应、DNA探针杂交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析细菌的主要手段，它在鉴定细菌感染的爆发、确定院内交叉感染、感染病原菌之间的基因同源性等方面有着重要的作用，本文将对常用基因同源性分析方法的机理和过程做简要综述。 一、质粒分型(Plasmid profile assay)： 1、原理： 质粒是可移动的染色体外元件，可以自发丢失或者被宿主稳定地获得，因此流行病学上相关的分离菌株有可能表现出不同的质粒图谱。把质粒提取出来，进行常规的琼脂糖电泳分析，就可以知道分离菌株携带质粒的大小和数目。 2、实验过程：a.质粒抽提；b.0.8%琼脂糖电泳；c.EB染色、凝胶成像。 3、实验方法的评价： 优势： a.步骤比较简单，对实验仪器要求不高。 b.在评价那些从局限的时间和地点（如一个医院中的急性爆发）分离出来的菌株非常有效。 缺点： a.实验结果的重复性不好。 b.分辨力不高。 二、染色体DNA的限制性内切核酸酶分析 (Restriction Endonuclease Assay REA) 1、原理： 限制性内切核酸酶（REA）在特异的核酸识别序列切割DNA，DNA被消化后，所得到的限制性片段的数目和大小是由酶的识别位点和DNA的组成共同决定的。在传统的限制性内切核酸酶分析中，人们用含有相对多的限制性位点的内切核酸酶消化细菌的DNA，这样就会得到成百上千条长度在0.5-50Kb范围内的DNA 片段。恒定的电场琼脂糖电泳，可以根据分子质量的大小将这些DNA片段分开，然后通过EB染色并在紫外灯下观察其图谱。同一种的不同分离菌株的DNA序列的变异可造成限制性位点数目和分布的变化，所以可以导致其REA图谱出现差异。 2、实验流程：a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA（主要是Hind III）； c.0.7%琼脂糖电泳； d.EB 染色、凝胶成像。
斑马鱼动物模型的应用介绍
斑马鱼动物模型的应用 斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。 斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。 一、斑马鱼的品系 经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。 二、斑马鱼突变品系的筛选 斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。插入诱变是以逆转录病毒为载体，用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼受精卵，整合到基因组中，干扰正常基因表达。射线照射产生的突变率是ENU 化学诱导的10倍，但由于突变涉及多个基因，突变的表型是受若干基因调控的结果，不利于基因功能的分析，因此，ENU化学诱导法是斑马鱼突变的主要方法。研究含有纯合致死
11 孙秀梅 病毒基因序列的同源性比较
安徽农业大学 综述性论文 病毒基因序列的同源性比较的应用The Application of Homology Comparison of Viruses Gene 研究生：孙秀梅 学号：11720717 指导教师：潘玲副教授 专业名称：基础兽医学 所在学院：动物科技学院 2011年11月
病毒基因序列的同源性比较的应用 摘要现代分子生物学技术的不断进步和革新极大地提高了人们分析和比较基因序列的能力。这种趋势对病毒学的影响很深远，产生了一门叫做病毒分子生物学的学科，是用现代分子生物学的新理论、新技术和新方法对病毒基因组的结构和功能，基因组的复制、表达和调控，病毒与宿主的相互作用等进行研究的一门学科。病毒分子生物学对现代分子生物学的研究发展做出了重大贡献。它的研究成果揭示了病毒的感染、致病的分子本质，为病毒引起疾病的诊断、预防和治疗提供了重大的理论基础，促进了基因工程疫苗和抗病毒类药物的研制和发展。 DNA序列分析是分子生物学重要的基本技术。无论从病毒基因中筛选的特定基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，比较病毒基因的同源性，进而分析基因的序列对形态功能等各生物学方面的影响。 目前采用的测序技术和策略存在着许多难以逾越的瓶颈问题。以鸟枪法为主的随机测序方法为例，由于并行化程度大大提高，可以较快地对一个基因组完成测序，因此目前被大部分基因组测序中心所采用。随着时间的推移，DNA测序技术无疑将日臻完善，这一便捷精确的方法将成为人们解决生物学问题的重要手段。对本文就病毒基因序列的同源性比较这一方面的状况进行下综述。 关键词毒基因全基因序列同源性比较 我们今天所讲的基因同源性是指不同的DNA分子由于进化上的原因，其核苷酸序列具有相同来源而具有的某些共性，表现在相应的位点具有相同的或相似的核苷酸残基。基因序列分析是分子生物学重要的基本技术。无论从病毒基因中筛选的特定基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，比较病毒基因的同源性，进而分析基因的序列对形态功能等各生物学方面的影响。随着基因大规模自动测序的迅猛发展，序列数据爆炸性积累，以及生物信息学的产生与发展，对基因和蛋白序列资料中各种类型信息进行识别、储存、分析、模拟和分析等方面都得到了很大程度的提高，对于病毒基因序列的同源性比较及分析都有很大的帮助。 1.病毒基因组的研究进程 1.1.病毒的发展简史 关于病毒早在公元前1400年，古埃及象形文字就描述了一位司祭人员的病状是典型的脊髓灰质炎，即小儿麻痹症，这可能是对病毒学的最早记载[1，2]。病毒学也随着现代生物技术的发展而发展，从1953年开始，人们沿着“病毒结构蛋白—基因组核酸—非结构蛋白”的路线研究病毒的侵染、致病、复制、遗传、变异的生化及分子机理，从而对最简单的生物本质有所了解[3]。 不得不提的是，20世纪的下半叶是发现病毒的黄金时代，1957年，马动脉炎病毒和导致牛病毒性腹泻的病毒（一种瘟病毒）被发现；1963年，巴鲁克·塞缪尔·布隆伯格发现了乙型肝炎病
内参基因βActin简介
内参基因βA c t i n简介标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]
内参基因β-Actin简介 日期：2012-05-03来源：未知作者：周慕云点击：次 β-Actin 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的PCR内参有GAPDH 、β- actin 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等。 β-Actin简介 Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin; 其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。不同的actin之间同源性大于90%，但在N-terminal同源性仅50%-60%，因此N-terminal常被用作actin的抗原。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。 β-Actin用途 β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数。内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的蛋白质内参有细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin和GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)等。因此β-Actin
同源性分析标准操作规程
同源性分析标准操作规程 持有部门：检验科 制定部门：丰都县人民医院医院感染管理科执行时间： 2013年11月1日 一、同源性分析的应用 包括感染暴发的判断，感染病原菌的确定及感染源的寻找。 二、基本方法 1．细菌的表型特征分型技术(如血清型、耐药表型等)。 2．基因分型技术(如．PFGE、Rep—PCR、AFLP等)。 三、操作步骤 (一)表型分型(血清型、耐药表型) 1．标本孵育：从患者感染部位采集标本，并接种于相应培养基(培养瓶)中孵育。 2．分离菌种：分离病原菌(细菌或真菌)，并鉴定细菌(真菌)种类。 3．血清分型：如可能则对同种细菌进行血清分型，如军团菌等。 4．药敏试验：根据细菌(真菌)种类选择药敏卡(纸片)，进行药敏试验。 5．结果分析：分析血清型和药敏谱，如结果相同或药敏相差不大则提示有同源性。 (二)基因分型(PFGE) 1．菌栓制备：将细菌悬液与2％低熔点琼脂糖凝胶混合，制备菌栓。 2．细菌消化：分别用含溶菌酶和(或)蛋白酶K的裂解液对菌栓进行消化。 3．洗涤菌栓：可用无菌水反复清洗或PMSF中和多余的蛋白酶K。 4．酶切：按照各种不同限制性内切酶的说明进行酶切。 5．制胶：用PF(讵电泳凝胶模具制备：PF(逼级琼脂糖凝胶。 6．电泳：根据不同细菌酶切片段的大小选择适当的脉冲参数，进行电泳。 7．凝胶成像：胶块染色后在凝胶成像仪下成像。 8．结果分析：根据Tenover等制定的标准对凝胶图像进行分析，判断菌株之间的同源性。 四、注意事项 1．不同的分型方法，在分型能力、重复性、分辨能力、操作和成本等方面都不尽相同，可根据情况进行选择。 2．表型分型方法的分辨能力普遍比基因分型方法低，但简便、快速，适用于对感染暴发的初筛。
常见内参基因
β-A c t i n Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、 β-Actin 移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletalmuscleactin，α-cardiacmuscleactin，α-smoothmuscleactin，和 γ-smoothmuscleactin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin(β-non-muscle)和 γ-non-muscleactin。不同的actin之间同源性大于90%，但在N-terminal同源性仅50%-60%，因此N-terminal常被用作actin的抗原。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。 β-Actin用途 β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是WesternBlot很好的内参指数。内参即是内部参照（InternalControl），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的蛋白质内参有细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin和GAPDH （glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）等。因此β-Actin抗体、β-Tubulin抗体以及GAPDH抗体成为最常见的三个动物细胞内参抗体。β-Actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。Beta-actin 由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右。 β-actin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微丝结构。在用作Western的参照时，Actin抗体和Tubulin抗体的主要不同之处在于两者所识别蛋白的分子量不同，这样可以选择合适的参照在同一块胶同一张膜上实现同时检测目标蛋白和参照蛋白。 GAPDH GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家（housekeeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提totalRNA，poly(A)+RNA，Westernblot等实验操作的标准化的内参。 GAPDH结构图
DNA序列比对同源性分析图解BLAST
1、进入网页：https://www.360docs.net/doc/b38109246.html,/BLAST/ 2、点击Search for short, nearly exact matches 3、在search栏中输入引物系列： 注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’; 5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’ （1）输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的blast程序。 这种方法叫繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。
（2）简便的做法是同时输入上下游引物：有以下两种方法。输入上下游引物系列都从5’——3’。 A、输入上游引物空格输入下游引物 B、输入上游引物回车输入下游引物 4、在options for advanced blasting中： select from 栏通过菜单选择Homo sapiens Expect后面的数字改为10
5、在format中： select from 栏通过菜单选择Homo sapiens Expect后面的数字填上0 10
6、点击网页中最下面的“BLAST！” 7、出现新的网页，点击Format！
8、等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。（1）图形格式： 图中①代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40～50分 图中②代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40～50分，而与下游引物不互补 图中③代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配 通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。
关于内参基因的选择
关于内参基因的选择 实验内参，即是在检测细胞内分子表达变化时选择的参照物，其在细胞内的表达相对恒定，在处理因素作用条件下不会发生表达改变的基因。内参同样可以校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 1、管家基因 最普通的内参是内源性参照基因，也就是管家基因（持家基因，house keeping gene）。 管家基因是一类始终保持着低水平的甲基化并且一直处于活性转录状态的基因，高度保守并且在大多数情况下持续表达。其表达水平受环境因素影响较小，而且是在个体各个生长阶段的大多数，或几乎全部组织中持续表达，或变化很小，因此常存在于生物细胞核的常染色质中。它的表达只受启动序列或启动子与RNA 聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。 管家基因维持细胞最低限度功能所不可少的基因, 如编码组蛋白基因、编码核糖体蛋白基因、线粒体蛋白基因、糖酵解酶的基因等。这类基因在所有类型的细胞中都进行表达，因为这些基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。
2、内参基因选择的条件 1、不存在假基因，以免基因组DNA的扩增； 2、高度或中度表达，避免太高或太低的丰度； 3、稳定表达于不同类型的细胞和组织中，表达量无明显差异； 4、表达水平与细胞周期、活化等无关； 5、不受外源性或内源性因素的影响。 3、不同管家基因 在选择管家基因作为内参时，首先要按不同类型的分子选择正确的内参。曾看到有人用检测miRNA时选择了GAPDH作为内参呢。 a、检测mRNA时的内参 通常使用的是GAPDH、beta-actin、tubulin GAPHD
GAPDH GAPDH是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量 146kDa。该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。 beta-actin β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝 的主要成分，具有收缩功能，分布广泛。
内参基因1
内参基因 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达 水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差， 保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样 半定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改 变的基因作内参。 在进行基因研究的过程中,实时反转录 PCR也和传统的mRNA定量方法如 Northern b lot技术等一样, 要求使用参照基因以校正转录效率和 cDNA用量, 弥补制备过程中样本 纯度和浓度的差别, 使不同样本之间目的基因的比较成为可能,以期获得真实可靠的结果。大多数分析方法中这些差别可通过与内参照比较处理消除。最普通的内参照是内 源性参照基因,也叫管家基因。 管家基因：又称持家基因(house-keeping genes)生物体各类细胞中都表达，其产物 是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解 酶系基因与核糖体蛋白基因等。是为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的 基因。 管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、 或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA 聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。管家基因高度保守并且在大多数 情况下持续表达，因此管家基因常被用于分子技术--多位点基因分析。 内参基因通常是各种看家基因，在细胞内组成稳定性表达，有助于保持细胞的 功能。理想的内参基因应该满足以下条件：1, 不存在假基因（Pseudogene），以 避免基因 DNA的扩增； 2,高度或中度表达，排除低表达； 3,稳定表达于不同类型 的细胞和组织（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量是近似的，无显着性差别； 4,表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；5, 其稳定的表达水平与目标基因 相似；6, 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响. 近年来的研究发现：这些常用内参基因均存在缺陷，在不同类型的细胞和组织 细胞增殖和器官发育的不同阶段体外培养各种实验条件等情况下它们的表达量通 常变异较大。正确的选择内参基因, 很大程度上依赖所研究的细胞或组织, 不同的试验 需要寻找适合各自试验体系的特异性稳定表达的内参基因。然而,合适内参基因的选择, 需要在各种类型的细胞或组织和各种试验条件下进行比较选择。理想的内参基因应在 各种试验条件下,各种类型的组织和细胞中均恒定表达,而且其表达量是近似的,无显着 性差别。另外要求不存在假基因以避免基因组的扩增。
斑马鱼简介
它是发育生物学家的得力助手，是医学研究的后起之秀，是环境监测的哨兵，是指示兵，是药物研发的新宠，它就是脊椎类模式动物明星斑马鱼（zebrafish，Danio rario）。 一、斑马鱼基本特点： 原产地：热带淡水鱼，原产于喜马拉雅山南麓的印度、巴基斯坦、孟加拉和尼泊尔等南亚国家。成鱼体长3-100px，略呈纺锤形，头小而稍尖，吻较短，身躯玲珑而纤细，因其体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝色与银色相间的条纹而得名。 http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_03/ch03f09.jpg 斑马鱼是体外受精发育，胚体透明。胚胎发育快，受精后3天左右孵化出膜，天左右开口进食，约3个月达到性成熟，寿命可达2年以上。斑马鱼可常年产卵，繁殖周期3-4天，一对成年斑马鱼每次可产卵200-300枚，受精率通常在70%以上。养殖温度一般在23-31℃，15℃左右仍可存活，最佳养殖温度在25-28摄氏度之间，pH值在6.8~7.8，硬度在2~6之间。 二、斑马鱼作为模式生物的起源和发展 1938年，美国布朗大学Roosen-Rung教授首次报道斑马鱼发育形态学研究成果。1950年代，美国罗格斯大学K. Kenneth Hisaoka教授首次报道斑马鱼毒理学研究成果。1972年，美国俄勒冈大学George Streisinge教授开始斑马鱼发育生物学研究和模式动物建立工作。1989年，美国俄勒冈大学Monte Westerfield教授出版斑马鱼研究圣经The Zebrafish Book第一版。1998年，首个斑马鱼模式生物数据库ZFIN成立（https://www.360docs.net/doc/b38109246.html,）。1998年，全球第一家斑马鱼药物研发
内参基因
何为内参基因 1、我记得常用的就是[color=magenta]GAPDH[/color]（3-磷酸甘油醛脱氢酶）和actin，至于什么是内参，可以打个比方，比如我们要比较两个不一样大的西瓜的含糖量，不好直接比较，那就找他们都有的东西来比较，就拿西瓜子嘛，假设西瓜子是均匀分布的，而且随着西瓜的变大，糖分的增多，西瓜子也变多，那么这个西瓜子就可以作为内参了！ 不知比方准确否，请高手指教，共同进步！ 2、内参基因一般会选管家基因，是维持细胞基本代谢活动所必须的基因，在各组织和细胞中的表达相对恒定，如：GAPDH、Actin、18S rRNA等 3、内参基因,表达稳定，通常用的有GAPDH,beta-actin，18s rRNA等 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。 一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。 4、半定量RT-PCR和qPCR都需要内参，简单的说内参就是在你的那个培养条件下恒定表达的某个基因。做内参就是以内参引物PCR扩增该内参基因，看在你选定的几个时间点是不是都恒定表达，如果恒定才能说明你做PCR选的RNA（一部发RT-PCR）或cDNA(两步法RT-PCR)的量是等量的，这样比较你的目的基因的丰度才有意义。 内参是相对的，不是绝对的，因为内参基因有时会受到影响。 量PCR问题--绝对定量与相对定量有什么区别？ 绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。 绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。 相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。 CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，其计算公式是 绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。
生物信息学分析
4、生物信息学分析 通过核苷酸序列数据库和基因序列同源性在线分析途径初步对Rv2029c基因进行分类整理。由于结核分枝杆菌耐利福平野生株与核苷酸序列数据库KEGG GENES中的结核分枝杆菌标准株H37Rv的匹配率为100%，以下对基因的分析按照结核分枝杆菌标准株H37Rv的数据库信息进行，即完全匹配的1020bp长度序列（本次提取基因中包含上下游引物等序列，较长，1346bp）。 4.1基本信息 表1 基因基本信息 4.2基因组信息 表2 基因组信息
5、PLN02341（PfkB型碳水化合物激酶家族蛋白），位点208-294 6、PTZ0029（核糖激酶），位点205-301 药物靶点1、同源基因没有药物靶点 2、非同源但序列相似基因没有药物靶点 图3 蛋白结构域 4.3蛋白表达 4.3.1 二级结构分析 预测结果显示，PfkB蛋白的二级结构中β转角占46.61%，α螺旋占33.63%，β折叠占19.76%。转角结构和螺旋结构构成了结核分枝杆菌PfkB蛋白二级结构的骨架。
图4 蛋白二级结构 4.3.2 跨膜区分析 Tuberculist跨膜蛋白预测结果表明：蛋白长度339aa，预测跨膜蛋白数0。 图5 蛋白跨膜区分析 4.3.3 信号肽预测 Predict Protein分析表明PfkB蛋白氨基酸残基没有信号肽，由此推断此蛋白不包含信号肽，不是分泌型蛋白质。
图6 蛋白信号肽预测 4.3.4 疏水性分析 分析结果显示，蛋白最大疏水指数为2.411，最小疏水指数为-2.372。
图7 蛋白疏水性分析 4.3.5 DNA同源性分析 表3 基因同源性分析 菌株序列覆盖 率 E值一致性 Mycobacterium tuberculosis strain Beijing-like, complete genome 100% 0.0 100% Mycobacterium bovis subsp. bovis AF2122/97 complete genome 100% 0.0 100% Mycobacterium tuberculosis 18b genome 100% 0.0 100% Mycobacterium tuberculosis H37RvSiena, complete genome 100% 0.0 100% Mycobacterium tuberculosis str. Kurono DNA, complete genome 100% 0.0 100% Mycobacterium tuberculosis 49-02 complete 100% 0.0 100%
小麦TaeEF1β基因的克隆、同源性及表达分析
浙江农业学报ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＺｈｅｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ?２０１９?３１(１):９８－１０３ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｚｊｎｙｘｂ.ｃｎ陈炫?张天烨?羊健?等.小麦ＴａｅＥＦ１β基因的克隆二同源性及表达分析[Ｊ].浙江农业学报?２０１９?３１(１):９８－１０３. ＤＯＩ:１０ ３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００４￣１５２４ ２０１９ ０１ １３ 收稿日期:２０１８￣０３￣２５ 基金项目:国家自然科学基金(３１５０１６０)?国家农业产业体系(ＣＡＲＳ￣３￣１)?国家小麦转基因专项(２０１６ＺＸ０８００２００１) 作者简介:陈炫(１９９２ )?女?陕西咸阳人?硕士研究生?主要从事植物病理学研究?Ｅ￣ｍａｉｌ:ｖｉｖｉａｎｃｃｘ＠１６３.ｃｏｍ?通信作者?陈剑平?Ｅ￣ｍａｉｌ:ｊｐｃｈｅｎ２００１＠１２６.ｃｏｍ小麦ＴａｅＥＦ１β基因的克隆二同源性及表达分析 陈一炫１?张天烨１?羊一健２?张恒木２?陈剑平２?? (１.浙江农林大学林业与生物技术学院?浙江杭州３１１３００?２.浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所?浙江杭州３１００２１) 摘一要:真核翻译延伸因子(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ?ｅＥＦｓ)是一种重要的多功能调控蛋白?ｅＥＦ１β是ｅＥＦ１的组成部分?在蛋白质生物合成过程中发挥着重要的作用?本文通过ＲＴ￣ＰＣＲ扩增克隆小麦(ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ.)的ｅＥＦ１β基因?并命名为ＴａｅＥＦ１β?氨基酸同源性分析发现?ＴａｅＥＦ１β具有高度保守性?且其保守结构域位于１３７~２２６ａａ处?ｑＲＴ￣ＰＣＲ结果表明?中国小麦花叶病毒(Ｃｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉ￣ｒｕｓ?ＣＷＭＶ)侵染小麦植株后?可以诱导ＴａｅＥＦ１β基因转录水平的上调表达?另外?本文也进一步分析了ＴａｅＥＦ１β基因在小麦根二茎二叶的表达水平和ＣＷＭＶ侵染不同时间点的表达情况? 关键词:真核翻译延伸因子?中国小麦花叶病毒?同源性分析 中图分类号:Ｓ４３５ １２文献标志码:Ａ文章编号:１００４￣１５２４(２０１９)０１￣００９８￣０６Ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ?ｈｏｍｏｌｏｇｙａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＴａｅＥＦ１βｉｎＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ.ＣＨＥＮＸｕａｎ１?ＺＨＡＮＧＴｉａｎｙｅ１?ＹＡＮＧＪｉａｎ２?ＺＨＡＮＧＨｅｎｇｍｕ２?ＣＨＥＮＪｉａｎｐｉｎｇ２?? (１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ＺｈｅｊｉａｎｇＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１１３００?Ｃｈｉｎａ?２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｉｒｏｌｏ￣ｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ＺｈｅｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ?Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００２１?Ｃｈｉｎａ) Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ(ｅＥＦｓ)ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎ.ｅＥＦ１βｗａｓｓｕｂ￣ｕｎｉｔｏｆｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ￣１(ｅＥＦｓ￣１)ｃｏｍｐｌｅｘａｎｄｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｉｏ￣ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ.ＴｈｅｅＥＦ１βｇｅｎｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｃｌｏｎｉｎｇｗｉｔｈＲＴ￣ＰＣＲｆｒｏｍｗｈｅａｔａｎｄｎａｍｅｄａｓＴａｅＥＦ１β.ＴｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＴａｅＥＦ１βｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｎｄｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｗａｓｌｏｃａｔｅｄｉｎ１３７￣２２６ａａ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｑＲＴ￣ＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴａｅＥＦ１βｗｅｒｅｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｔｈｅＣＷＭＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄｐｌａｎｔｓ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ?ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴａｅＥＦ１βｉｎｔｈｅｓｔｅｍｓ?ｌｅａｖｅｓａｎｄｒｏｏｔｓｏｆｗｈｅａｔａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆＣＷＭＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗａｓａｌｓｏｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴ￣ＰＣＲ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ?Ｃｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ?ｈｏｍｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓ 一一真核翻译延伸因子(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅ￣ｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ?ｅＥＦｓ)最早作为一个对噬菌体Ｑβ 的依赖于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶(ＲＮＡ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ?ＲｄＲｐ)活性具有重要作用的辅助因子被发现并鉴定[１]?在真核细胞中包括３类延伸因子?分别为ｅＥＦ１α(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ１α)二ｅＥＦ１β和ｅＥＦ２[２]?ＥＦ１β在真核生物中的结构比在细菌中更复杂?该蛋白由ＥＦ１β￣ａｌｐｈａ二ＥＦ１β￣ｇａｍｍａ和ＥＦ１β￣ｂｅｔａ三个亚基组成?在蛋白质的合成过程中?ｅＥＦ１β主要作为
嗜麦芽窄食单胞菌基因同源性分析_吴锦
◇临床医学◇ 嗜麦芽窄食单胞菌基因同源性分析 吴 锦1，胡立芬1，2，沈为华2，朱玉林2，刘艳艳2，李家斌 2(1．安徽医科大学第一附属医院中心实验室;2．安徽医科大学细菌耐药研究所，安徽合肥230022) 摘要：目的 了解2005—2010年安徽省临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌并通过基因同源性分型，推测菌株地流行性趋势，为控制 医院感染的发生提供科学的理论依据。方法收集安徽省细菌耐药监控网中的34家不同级别医院2005—2010年（每年9月1日—30日）临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌188株，采用全自动微生物分析仪对标本进行重新鉴定。提取全基因组DNA ，应用随 机引物PCR 方法对菌株进行基因分型分析菌株克隆流行传播情况。结果对188株基因分型，发现2005、2007及2009年的菌株均表现不同的基因亚型；2006年678和702号、2008年的824和826号、2010年的186和18号菌株分别是同一基因亚型，追 踪临床资料发现它们均来自于同一医院同一科室，说明可能存在同一克隆株在院内传播的情况。结论同一克隆株的嗜麦芽窄食单胞菌在同一医院同科室的出现，提示该菌有造成医院感染流行的隐患，因此临床医生在控制基础疾病抗感染的同时，应该高度警惕此菌的存在，及时采取措施，减少该菌的临床感染及流行。关键词：嗜麦芽窄食单胞菌；基因同源性；聚合酶链反应 Detection of β-lactamase and quinolone resistance gene in Stenotrophomonas maltophilia WU Jing 1，HU Li-fen 1，2 ，SHEN Wei-hua 2，et al （1．The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University ；2．Institute of Bacterial Resistance in Anhui Medical University ，Hefei ，Anhui 230022，China ） Abstract ：Objective To investigate the epidemiology by genotyping among isolates ，in order to provide a scientific basis for the control of nosocomial infection．Methods In this study ，during the month of September from 2005to 2010，188clinical S．maltophilia isolates were collected from 34different graded hospitals which were the members of Anhui Center for Surveillance of Bacterial Resistance．The i-solates were identified by using the Microscan Walkaway-40System．Total DNA of the 102clinical isolates from 2005to 2008collection was extracted by suspending several overnight colonies in 0．5mL of double-distilled water and heating the mixture at 100?for 10min．The epidemic spread of S．maltophilia isolates was detected by random primer PCR method for genotyping．Results By genotyping of the 188isolates ，we found that all the isolates in 2005，2007and 2009showed different geneotypes ，but isolate 678and 702in 2006，isolate 824and 826in 2008，isolate 186and 187in 2010shared the same geneotypes respectively．After tracking clinical data we found that they were from the same department in the same hospital respectively．Our results revealed that cross-colonization might be possible among the patients who are followed up at the same center．Conclusions The occurrence of the same geneotype isolates in the same department suggests that the bacteria have the risk of causing nosocomial infection epidemic．Therefore ，clinicians should be aware of the bacteria in control underlying debilitating diseases of patients ，and take measures to reduce the infection of the bacteria．Key words ：Stenotrophomonas maltophilia ；geneotype ；PCR 基金项目：国家自然科学基金（No 81101313；No 81172737） 通信作者：李家斌，男，教授，博士生导师，研究方向：临床细菌耐药机 制， E-mail ：lijiabin948@vip．sohu．com 嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas Maltophilia ， SMA ）属于非发酵菌，随着各种抗菌药物在临床中的广泛使用及辅助医疗设备对人体有创治疗的进展，该菌的感染率不断上升，已成为医院感染的重要病原菌之一，主要导致身体衰弱患者和免疫受损患者的院内感染，它的临床致病性越来越受到重视。为了进一步提高对嗜麦芽窄食单胞菌医院感染的预防和诊治水平，本研究通过基因同源性分型，推测菌株地流行性趋势，为控制医院感染的发生提供科学的理论依据。1材料与方法 1．1 菌株来源与分离鉴定 收集2005—2010年6年期间9月份安徽省临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌188株（不包括6 名感染者二次分离的菌株），菌株主要来源于呼吸科、血液内科、胸腹外科、急诊ICU 、血透科、消化内科等，质控菌株ATCC 27853，大肠埃希菌ATCC 25922均由安徽省细菌耐药性中心保存。1．2 主要仪器与试剂Mueller-Hinton （M-H ）培养基，琼脂粉 等均购自英国Oxiod 公司。多点接种仪（AQS Manufacturing 公司，英国）、电热恒温培养箱（上海精宏公司）、细菌比浊仪器（Oxiod ，英国）、超低温冰箱（日本三洋制冷设备公司）、移液器（Eppendorf 公司，德国）、一次性玻璃试管及一次性细菌 培养皿（杭州爱思进生物技术有限公司）。ND-1000紫外分光光度计（基因公司，美国），DNA 扩增仪（Biometra 公司，德 国），电泳仪（北京六一仪器厂DYY．10C 型），凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司），引物由上海生工公司合成；ExTaqDNA 聚合酶、dNTPs 、Taq buffer 、loading buffer 和DNA marker 均购自大连宝生物公司，琼脂糖购自美国Invitrogen 公 · 34·安徽医药Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2013Jan ;17(1)