血脑屏障体外模型的研究进展(综述)

·91·安徽卫生职业技术学院学报 2019年18卷第5期

◇医学基础与药学研究◇

血脑屏障体外模型的研究进展（综述）

徐 麟 胡凯莉【中图分类号】　R96 【文献标识码】　Ａ 【文章编号】　1671-8054（2019）05-0091-04【摘 要】 血脑屏障（BBB）是位于中枢神经系统（CNS）和中枢系统环境间的一层生理保护屏障。对于治疗脑部疾病的药物来说，需要先通过BBB才能起效。BBB体外模型则是研究药物的BBB透过性或评价脑靶向纳米粒的脑部递药特性的有效工具。近年来，体外BBB模型的应用日趋广泛并在脑部疾病相关研究中发挥着重要作用。该文综述了国内外体外血脑屏障模型的发展现状及其在应用方面的最新研究进展。【关键词】　血脑屏障　体外血脑屏障模型　纳米粒　中枢神经系统

该文综述了国内外体外血脑屏障模型的发展现状及其在应用方面的最新研究进展。1 血脑屏障及其结构血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）是由脑毛细血管内皮细胞、周细胞以及星形胶质细胞足突形成的结构（见图1）[1~3]。脑微血管内皮细胞（BMECs）是内皮细胞的一种，与其他器官中内皮细胞相比，脑中的内皮细胞质厚度均匀、没有窗孔，低胞饮活性和连续的基底膜，并具有大量的线粒体数量，为酶分解化合物提供能量[4]。其能限制大部分外来物质进入脑部的同时，还通过各种选择性运输系统将营养素和其他化合物主动进出入大脑，维持正常的生理代谢功能[5]。星形胶质细胞血管腔周细胞内皮细胞紧密连接神经基膜图1 血脑屏障的结构2 体外BBB模型体外BBB模型作为现今研究神经系统疾病的主要体外模型，具有不同的结构及特征[6]。体外BBB模型能较为准确地预测出药物在体内BBB的渗透率，其中常见的主要有单细胞模型、共培养模型（接触模型、非接触模型）以及3D模型三大类。因此，本文主要介绍常见的三大类型的体外BBB模型及应用，并对各个模型优缺点进行分析。2.1 单细胞模型 体外BBB单细胞模型（见图2）指的是在Transwell膜上培养单一种类的内皮细胞，常用的细胞有犬肾细胞，小鼠脑血管内皮细胞（bEnd3）以及永生化人脑内皮细胞（hCMEC/D3）等。体外BBB单层细胞模型的优点是模型简单，允许以适中的成本进行相对较高的筛选。此模型还具有细胞存活时间长、细胞间连接紧密的一系列优点。但是，由于细胞缺乏邻近细胞信号传导（星形胶质细胞和周细胞）和机械刺激（如剪应力）所提供的屏障性调节刺激，容易出现细胞加速去分化、细胞间形成的紧密连接不完整、细胞黏着不规则、细胞旁扩散等缺陷。通过大量研究证明[3,7]，BBB的性质主要是由大脑中的微环境决定的，而不是内皮细胞自身的性质决定，因此单层模型与体内实际情况并不一致。

图2 体外血脑屏障单细胞模型王利民等[8]通过采用大鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞分别建立了两种体外BBB单细胞模型，研究高温下基质金属蛋白酶9（MMP-9）对BBB微血管内皮细胞紧密连接蛋白（claudin-1）的影响。结果得知，高温可导致体外BBB模型claudin-1表达下降，BBB通透性增加。外源性添加MMP-9能进一步加剧该损伤，提示高温可通过MMP-9加重BBB破坏。Ping Wang等[9]采用hCMEC/D3细胞株建立体外BBB单细胞模型，研究白喉毒素的无毒突变体—交叉反应物质197（CRM197）潜在的作用和机制。结果表明，CRM197表现出更倾向于顶端的细胞转移，而不是基底的细胞转移，这涉及到细胞穴样内陷介导的内吞途径。Caveolin-1的上调和磷酸化-FOXO1A转录因子的下调可能是由CRM197通过PI3K/Akt依赖

作者单位：上海中医药大学 上海 201203 通信作者：胡凯莉,女，教授2019-07-09收稿，2019-08-27修回医学基础与药学研究·92·通路介导导致的，以上研究结果表明，载体蛋白CRM197介导的跨BBB传递参与了FoxO1a转录活性的诱导和Caveolin-1表达的上调。2.2 共培养模型 由于单独培养的脑微血管内皮细胞会逐渐丧失血脑屏障特性，因此开发了共培养模型。共培养模型是指，采用两种或两种以上细胞共同培养来构建体外BBB模型，目前较多为二元共培养模型和三元共培养模型。共培养模型的优点是适用范围广泛，是研究神经退行性疾病的损伤机制、渗透率、细胞间相互作用等的理想模型。但是它不提供对于内皮极化和紧密连接至关重要的剪切力，从而导致模型缺乏BBB的特征以及其内皮渗透性高于生理渗透率。刘潜等[10]通过建立接触型和非接触型体外BBB共培养模型，研究了帕金森病（PD）细胞旁路开放对FLZ体外跨血脑屏障模型转运特性的影响，其中FLZ是是全合成的新型番荔枝酰胺（squamosamide）衍生物。得出结论，生理和PD病理状态下影响FLZ透过BBB的主要因素还是由BBB中P-gp介导的外排。为了模拟星形细胞对血脑屏障内皮细胞的影响，建立了不同的实验系统，其中根据细胞在插板中的位置分为接触型和非接触型。2.2.1 接触型 接触型共培养模型是将一种细胞（如内皮细胞）接种于插板内侧，另一种细胞（如星形胶质细胞）接种于插板底部进行共培养的模型（见图3）。虽然这种排列允许内皮细胞和星形胶质细胞直接接触，然而与体内相比，人工膜相对较厚，因此限制了细胞与细胞的相互作用。图3 接触型共培养模型Guang-Yun Wang等[11]通过建立了星形胶质细胞（AC）与人脐静脉内皮细胞（ECV304）共培养的接触型体外BBB共培养模型，研究麝香酮是否能够通过调节P-糖蛋白（P-gp）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达来改变血脑屏障的通透性。结果表明，在BBB模型中加入麝香酮（8 IM）前后，TEER值无显著性差异；用麝香酮（4 IM、8 IM、16 IM）处理24 h后，P-gp表达显著下降；在糖氧剥夺状态下，不同浓度的麝香酮组中P-gp和MMP-9的表达均有不同程度的降低。结果表明，麝香酮可以渗透到BBB模型中，并与P-gp的抑制和MMP-9的表达有关。该研究结果对了解麝香酮在BBB中的作用机制以及对治疗脑血管疾病具有重要意义。2.2.2 非接触型 非接触型体外BBB模型是将一种细胞（如内皮细胞）种在transwell上，另一种细胞（如星形胶质细胞）种在培养皿的底部（见图4）。张乐裕等[12]通过建立Aβ1-42诱导的小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3和原代大鼠星形胶质细胞As非接触式共培养BBB模型，探究黄芪甲苷对纤维状Aβ1-42诱导的体外BBB模型损伤的影响及其可能机制。MTT结果显示，与模型组比较，黄芪甲苷低、高剂量组均能显著提高bEnd.3细胞活性（P＜0.001），且保护作用与黄芪甲苷对的浓度呈正相关；荧光素钠通透性实验结果显示，与模型组相比较，黄芪甲苷预处理可显著降低BBB的通透性（P＜0.001）。Western blotting 结果显示，与模型组比较，黄芪甲苷预处理后，cleaved Caspase-3/Caspase-3显著降低，ZO-1、Claudin-5、Occludin 蛋白的表达水平显著增加（P＜0.001）。由此得出结论，黄芪甲苷可能是通过抑制Aβ1-42诱导的脑微血管内皮细胞 bEnd.3 的凋亡及增加其连接蛋白表达而发挥 BBB 保护作用。

图4 非接触型模型2.3 新型体外血脑屏障模型—3D模型 3D NVU装置主要采用玻璃和聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行制备，该模型常见的细胞为bEnd.3、C8D1A，该装置可进行3D细胞培养并提供5 dyn/cm2左右的剪切应力。该装置的优点是可以进行3D细胞培养、和细胞共培养，提供剪切应力，同时可以进行细胞的实时显微观察，但其依然存在无法实时监测转移上皮电阻值（TEER）值等问题[13]。Alcendor DJ等[14]采用NVU芯片来制备体外3D BBB模型，NVU芯片由神经模块（神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）和血管模块（BMECs）组成，两个模块分别细胞培养完成后再组装在一起，通过该装置研究神经血管间的相互作用。相关研究表明[15]，在装置中加入肿瘤坏死因子α（TNF-α），可使葡萄聚糖的通透性增加2倍，说明NVU芯片形成的体外3D BBB模型具备正常的功能。另外在血管模块中添加TNF-α，也可促进神经模块中小胶质细胞形态的变化并显著增强胶质纤维酸性蛋白的表达，表明神经与血管间存在信息交换，表明该装置在中枢神经系统相关药物·93·安徽卫生职业技术学院学报 2019年18卷第5期

筛选应用中具有一定的优势。3D BBB模型[16]主要采用PDMS进行制备，其常用的细胞类型是hCMEC/D3和人星形胶质细胞，该模型可进行3D细胞培养并提供0.7 dyn/cm2左右的剪切力，该模型可用于药物筛选，研究剪切应力、血管周期性收缩对BBB的物质运输以及内皮细胞功能的影响等。该模型的优点是能够实现3D细胞的培养、细胞共培养，提供剪切应力和周期性收缩等力学变化。但是该模型在TEER的实时监测和药物高通量筛选方面还存在一定的缺陷[17]。3 总结与展望对体外血脑屏障模型的研究，以往文献大多是使用细胞株来建立模型，且模型的功能性可靠性较差。近年来，体外血脑屏障模型包括不同的实验细胞模型，达到了很好的效果。单细胞培养模型和多细胞模型相比，二元共培养模型优于一元模型，星形胶质细胞对血脑屏障的诱导调节具有促进作用[18]。尽管各种体外血脑屏障模型的发展迅速，但是仍然具有很大的局限性，没有已被确定的理想模型。模型的选择是至关重要的，经常由具体研究目的决定。总之，创新型纳米制剂正变得越来越多，随着体外血脑屏障模型的发展，能更准确地评价纳米制剂在中枢神经系统疾病中的治疗意义。体外血脑屏障模型的应用范围广泛，并不局限于在纳米制剂中，仅仅用于评价纳米制剂的模型文献就有数百篇，体外血脑屏障模型能够有效地对CNS疾病研究以及药物的研发起到良好的推动作用。

参考文献[1] Patabendige A,Skinner RA,Abbott N J．

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