杆状病毒表达系统

抗凋亡Bacmid 将靶向昆虫凋亡效应蛋白 Caspase的小RNA序列克 隆到Bacmid上，使病毒 感染的昆虫细胞抗凋亡， 从而提高外源基因的产量：
Zhang et al. BMC Biotechnology (2018) 18:24
宿主细胞
Spodoptera frugiperda 细胞系 常用的有Sf9、Sf21细胞系 适用于转染后获得重组病毒 适用于蛋白表达
几种获得重组病毒过程的对比
杆状病毒表达系统的优化
启动子、Kozak序列和UTR的优化改造。 虽然p10或polyhedrin启动子已经是强启动子，但通过改变 上下游相关序列依旧能极大地提高外源基因的产量：
PLoS ONE 2014 9(5): e96562
敲除影响外源基因表达/非必需的病毒基因。 比如敲除几丁质酶和组织蛋白酶（ChiA/Cath）有助于分 泌蛋白的表达：
用重组的质粒和野生型的AcMNPV共同感染Sf细胞。
得到的病毒通过空斑筛选(0.5%)，得到重组病毒。
用重组病毒感染Sf细胞，得到β-干扰素。
解决重组效率太低的问题
1990年P. A. Kitts把一个Bsu36I位点引入到多角体基因附近。 用Bsu36I线性化的AcMNPV后，重组效率提高15-150倍， 30%的空斑是阳性克隆。
J Virol. 1993 Aug;67(8):4566-79. Luckow VA, Lee SC, Barry GF, Olins PO.
Bacmid polyhedrin位点附近序列细节： 目前使用的Bacmid大都源于这个Bacmid。
获得重组病毒的方式
转座：先将外源基因克隆到转移载体上，然后在大肠杆菌 中通过转座，将外源基因转移到Bacmid上。提取重组 Bacmid，转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：
同源重组：先将外源基因克隆到转移载体上，然后与线性 化Bacmid上共转染转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：
“转座”和“同源重组”目前都在使用中。 “转座”方式的代表是ThermoFisher的Bac-to-Bac系统。 采用“同源重组”方式的有Clontech的BacPAK系统、OET 的FlashBac系统，以及Bacmid Ltd.的qBac系统。 这两种方式与外源基因的表达量无关。
S.A. Kaba et al. / Journal of Virological Methods 122 (2004) 113–118
敲除p26,p10,p74极大地提高了外源基因的产量：
Cell Biol Toxicol (2010) 26:57–68
糖基化改造 把昆虫细胞中缺少的糖基化酶克隆到Bacmid上，使蛋白的 糖基化更像哺乳动物细胞：
杆状病毒表达载体系统
1981年L. K. Miller根据AcMNPV分子生物学性质及现代分 子生物学技术，从理论上阐述了杆状病毒作为载体表达外 源基因的可行性。 1983年G. E. Smith等成功地利用AcMNPV作为载体在Sf细 胞中表达了人β-干扰素基因，完成了从理论到实践的飞跃。
G. E. Smith将AcMNPV的EcoRI-I片段（包含多角体蛋白基 因）克隆到pUC8质粒上，然后把人β-干扰素基因克隆到 BamHI位点。
1993年P. A. Kitts把两个Bsu36I位点一起引入，结果使重组 效率达到90%，但还是需要空斑筛选（多角体，蓝白斑）。
直接通过病毒基因组DNA与转移载体（Transfer vector）重组示意图
构建Bacmid
1993年V. A. Luckow用miniF-Kan替换了多角体polyhedrin基 因，构建了能在昆虫细胞和大肠杆菌之间穿梭的杆状病毒 重组DNA，命名为Bacmid。该名称取自Baculovirus和 plasmid。
杆状病毒表达系统
西北农林科技大学生命科学学院 2018年
杆状病毒简介
杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒 子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋 形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。模 式种是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）. 核型多角体病毒有两种形式：一种为芽生病毒(budded virus, BV) ，另一种则为包涵体病毒(occluded virus, OV)。
无论如何，相对于其他表达系统，杆状病毒表达载体系统 （BEVS）是个比较均衡的表达系统：
经过长期优化，杆状病毒表达载体系统的产量已经有了极 大的提高：
目前外源蛋白的生产成本大幅度下降，使杆状病毒表达载 体系统能进入到动物疫苗工业领域。
完
budded virus
ห้องสมุดไป่ตู้
occluded virus
杆状病毒生活周期
芽出病毒： 可以通过细胞细胞间感染进 行传播。 包涵体病毒： 释放到环境中 后，通过昆虫 摄食进行传播。 如果仅用于感 染昆虫细胞系， 包涵体形成相 关的基因都不 是必需的。
杆状病毒基因表达的不同表达时相
立即早期 延迟早期 晚期 极晚期：该时相表达 的蛋白（polyhedrin and p10）与包涵体 形成相关，并且表达 量极高。生物工程中 可以利用这两个蛋白 的启动子表达外源蛋 白。
Trichoplusia ni 细胞系 商业化的High Five细胞系 不适用于转染后获得重组病毒 适用于蛋白表达，产量高于Sf细胞
总结
杆状病毒表达载体系统具有如下优点： 1. 快速高产 2. 具备翻译后修饰系统 3. 生物安全性好 4. 表达的蛋白能正确折叠 5. 允许用于人类医学
杆状病毒表达载体系统的缺点： 1. 它是个瞬时表达系统 2. 产量远低于原核系统 3. 糖基化修饰还不理想