DNA 酶切、回收和连接
dna片段的连接,转化及酶切鉴定
dna片段的连接,转化及酶切鉴定
DNA片段的连接、转化和酶切鉴定是基因工程中常用的实验
技术。
下面是这些步骤的详细描述：
1. DNA片段的连接（Ligation）：将两个或多个DNA片段连
接在一起。
这通常使用DNA连接酶（ligase）来催化连接反应，其中DNA连接酶通过形成磷酸二酯键将DNA片段连接起来。
2. DNA转化（Transformation）：将连接好的DNA片段转化
进入宿主细胞。
转化是通过加入特定的化学物质（例如钙离子和热激冷冻）或基因枪等方法，使细胞质膜对DNA片段通透，使其能够进入细胞内。
3. 酶切（Enzyme Digestion）：使用限制性内切酶（restriction enzyme）对转化后的DNA进行酶切，以确认连接是否成功。
限制性内切酶具有特异性，能够识别特定的DNA序列并在其
附近切割DNA链。
4. 鉴定（Identification）：通过凝胶电泳（gel electrophoresis）等方法对酶切后的DNA进行分离和鉴定。
凝胶电泳是一种基
于DNA分子的大小和电荷的分离方法，可以将DNA分子按
照大小分开，并可根据标准样品和分子量标记DNA片段等进
行鉴定。
通过上述步骤，可以实现DNA片段的连接、转化和酶切鉴定，从而用于基因工程研究和应用中。
质粒的酶切、连接、与转化
质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定(2011-04-29 10:42:22)转载▼质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法5、掌握α互补筛选法的原理6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法实验原理重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。
限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。
限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。
质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。
DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。
T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。
目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种：（一）、具互补粘性末端片段之间的连接大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。
当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。
（二）、平末端的连接载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
dna回收原理
dna回收原理
DNA回收原理是指通过提取、纯化和重组DNA分子，使其具备特定的目的和应用价值。
DNA回收的过程涉及以下几个主
要步骤。
首先是细胞裂解。
DNA回收的第一步是将含有目标DNA的细胞或组织完全裂解，以释放DNA分子。
这可以通过机械破碎、酶解或溶剂处理等方法实现。
细胞裂解后，DNA便与其他细
胞组分分离。
接下来是蛋白酶处理。
细胞裂解后，DNA通常与蛋白质、酶
和其他附着物混合在一起。
为了去除这些干扰物，需要使用蛋白酶将其消化降解，以纯化DNA。
然后是DNA纯化。
DNA纯化的主要目的是从细胞裂解液中分离纯净的DNA。
这可以通过常用的方法，如酚-氯仿提取、硅
胶柱层析、离心、滤膜过滤等完成。
纯化过程中，可以根据目标DNA的大小、特性和应用需求来选择合适的纯化方法和试剂。
最后是DNA重组。
DNA回收的最终步骤是对纯化后的DNA
进行重组，以达到特定的目的和应用需求。
这可以包括酶切、连接、变性、合成等技术，以改变DNA序列、结构和功能。
重组后的DNA可以进一步用于各种应用，如基因克隆、PCR、测序、基因编辑等。
总体而言，DNA回收的原理基于对目标DNA的提取、纯化和
重组，以获得纯净、有效且适用于特定应用的DNA分子。
通
过合理选择和操作各个步骤，可以有效地回收大量DNA样品，并满足各种实验和应用的需要。
PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理
PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理【实验原理】1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA 片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。
商品化的T载体有很多。
本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。
这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
【试剂与器材】（一）试剂1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液3.琼脂糖（Agarose）4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
2 / 95.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
6.70%乙醇7.胶回收试剂盒（Omega公司）（二）器材水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。
【操作方法】（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司Gel Extraction Kit为例）1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。
2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。
PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接) PCR实验技术
PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接)
【实验原理】
1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。
商品化的T载体有很多。
本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。
这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
【试剂与器材】
（一）试剂
1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液
3.琼脂糖（Agarose）
4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
1 / 9。
DNA胶回收实验技术总结
DNA胶回收实验技术总结一。
提高胶回收量的办法：1）增加电泳时的上样量。
2）电泳缓冲液用新鲜配制的。
3）切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。
4）把切的两块或多块胶融化后,无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上.5）溶胶时所加的溶液可多一点,这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。
6）胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高,可在溶胶液中加入10ul（PH 5.0,3mol/L的NaAC)；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30％异丙醇在加热溶解胶后的液体里。
7）加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟(大约需10分钟），以使乙醇充分挥发。
8）最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30—50μl洗脱液洗脱（不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱）；洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。
9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜,第二天再离心回收，效果不错。
10）将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。
二。
几种PCR 产物回收的详方法和步骤1）普通胶回收如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可以切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后,酚、酚／氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可.另外好像还有冷冻法，没作过，不是很清楚.2）从低熔点凝胶回收DNA纯化DNA片段加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris—HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA)，置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。
待放至室温,加等量酚（TE饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀)，12000rpm，3分钟离心.反复1—2次。
取上层液，加0。
1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2)和2。
DNA重组的主要步骤
DNA重组的主要步骤
DNA重组是指通过分离、移植和修饰DNA序列来改变基因组的过程。
主要步骤如下:
1.DNA分离: 通过酶切、洗脱或电泳等方法将所需
的DNA片段从基因组中分离出来。
2.DNA连接: 使用酶如连接酶或DNA连接酶将所
需的DNA片段连接在一起。
3.DNA克隆: 将连接好的DNA片段插入到载体中，
如质粒或菌系，进行DNA克隆。
4.DNA纯化: 从质粒或菌系中纯化出重组DNA。
5.DNA检测: 通过测序、质粒分析或其他方法检测
重组DNA的纯度和完整性。
6.DNA应用: 将重组DNA应用于基因疗法、基因
工程、药物研发等领域。
重组技术是基因工程的基础，广泛应用于生物医药、农业等领域。
在这个过程中，需要使用高纯度DNA质粒和严格的操作条件来保证重组DNA的质量。
7.DNA转化：将重组DNA转化为目标细胞，使之
能够生长和繁殖。
8.筛选：筛选出含有目标基因的细胞。
9.验证：使用多种方法（如Southern南方杂交、PCR
聚合酶链反应等）来验证重组DNA的纯度和完整性。
10.应用：将重组DNA应用于基因疗法、基因工程、
药物研发等领域。
DNA重组技术是一种高精度的分子生物学技术，可以通过改变基因组结构来改变生物体的性状。
这项技术在基因疗法、基因工程、药物研发、农业等领域都有着重要应用。
在进行DNA重组时，需要严格遵循实验流程和操作规范，避免误操作。
DNA的酶切与连接1.实验目的了解DNA限制性内切酶和连接的作用...
DNA的酶切与连接1. 实验目的了解DNA限制性内切酶和连接的作用原理，学习和掌握利用限制性内切酶进行DNA 消化和片段的方法和技术。
2. 实验原理DNA限制性内切酶和连接酶是遗传工程中实现DNA的切割和重组的重要工具酶，也是基因工程技术赖以生存的基础。
1970年Smith H·O等从流感病毒中提取了第一个限制性内切酶Hind II，其作用于外源DNA后，切割产生平末端。
人们经过研究发现，限制性内切酶可以识别双链DNA分子上的特异序列，通常识别区具有回纹结构，并使两个特定核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
目前已经从微生物中发现了200多种限制性内切酶，其中大部分可以切割DNA形成粘性末端。
如EcoR I，可以识别6个碱基的序列：▼5’ ――――――GA TTC――――――3’3’ ――――――CTTAAG――――――5’▲切割后形成的片段5’――――――G AA TTC――――――3’3’――――――CTTAA G――――――５’当限制性内切酶作用于DNA时可以形成的酶切片段数为：片段数目= 切点数+1 （线状DNA）片段数目= 切点数（环状DNA）切点出现的频率为1/4s（S为识别顺序所含的碱基数目）DNA连接酶则可以将切开的DNA片段连接起来，此时需要接口两端具有磷酸根。
对粘性末端的单链可以进行点接，对于平末端来说也可以进行连接，但是需要较多的酶。
在基因工程中，可以利用同一种限制性内切酶分别切割目标DNA和运载体，然后利用T4DNA 连接酶将目标序列整合到运载体中，使DNA中的3’-OH与5’-P生成磷酸二酯键。
3. 实验用具及材料电泳仪、恒温水浴锅、紫外检测仪、微量移液器、Eppendorf离心管10×酶切反应缓冲液、T4DNA连接酶缓冲液、溴酚蓝指示液、EB电泳缓冲液、PBR322质粒DNA、pXZ6质粒DNA，λphage DNA、DNA Marker EcoRI Hind III。
DNA合成及其具体操作流程探析
DNA合成及其具体操作流程探析DNA合成是生物科学中的重要技术手段，通过人工合成DNA序列，科学家可以进行基因修饰、基因工程以及生物学研究等。
本文将探析DNA合成的基本原理及其具体操作流程。
一、DNA合成的基本原理DNA合成是指通过人工合成DNA链的方法，将特定的DNA序列合成出来。
DNA合成的基本原理是利用核苷酸分子之间的磷酸二酯键反应，将单个的核苷酸链接成DNA链。
DNA合成的一般步骤包括：脱保护、酶切、连接和纯化等。
1. 脱保护：DNA合成通常使用的是有机化学方法，在合成过程中，核苷酸的羟基会被保护基团所保护，以防止其与其他核苷酸发生反应。
在DNA链合成完毕后，需要通过化学方法将保护基团去除，使得DNA链上的每个核苷酸都暴露出可反应的羟基。
2. 酶切：在DNA合成过程中，需要将已合成的DNA链切割成所需的片段。
通过使用特定的限制性内切酶，可以在特定的位置切割DNA 链。
酶切的结果是一条含有相应酶切位点的DNA链断裂，并暴露出能够连接的末端。
3. 连接：DNA片段合成完成后，需要将这些片段连接起来，形成完整的DNA序列。
连接的方法包括DNA连接酶催化的连接反应、连接酶独立的连接反应等。
连接反应的关键是将两条DNA片段的末端通过磷酸二酯键连接，形成连续的DNA链。
4. 纯化：合成出的DNA链需要进行纯化处理，将其中的杂质去除，以获得较纯的DNA产物。
纯化的方法包括凝胶电泳、柱层析、质粒放大复制等。
通过这些纯化方法，可以去除多余的核苷酸、限制性内切酶、连接酶以及其他杂质。
二、DNA合成的具体操作流程DNA合成按规模可以分为小规模合成和大规模合成两种。
下面将重点介绍小规模DNA合成的具体操作流程。
1. 设计合成序列：首先，需要根据研究的需要和目的，设计合成所需的DNA序列。
合成序列可以通过计算机软件进行设计，并考虑到所需的限制性内切酶位点、引物结合位点等。
2. 下单：将设计好的DNA序列提交给合成公司，进行下单。
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四. 操作步骤
1. 酶切反应 ① 设计酶切体积为20~30µl，计算清楚酶切系统中各成 分的用量，清晰做好记录，如果是同一条件下进行多 个酶切反应，建议统一加好共同的组分后，分装； ② 先加入正确体积的无菌双蒸水，加入1/10体积的10x 酶切缓冲液，混匀； ③ 在冰浴条件下加入适量的限制性内切酶； ④ 加入适量的DNA样品； ⑤ 弹匀，短暂离心；
实验七
基因片段的亚克隆
(DNA的酶切 的酶切、 (DNA的酶切、回收和连接）
一.实验目的
1.掌握DNA酶切的基本原理。 2.学习和了解限制性内切酶的 使用方法。 3.学习和掌握DNA片段胶回收 的方法
二.实验原理
1.核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一 类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解 酶，它们的功能类似于高等动物的免疫系统，用 于抗击外来DNA的侵袭。现已发现几百种限制性 内切酶，它们以内切方式水解核酸链中的磷酸二 酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。由于 限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割， 因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化 分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收 到广泛应用。
用灭菌的ddH2O补至20µl，37℃ 1小时。可根据需要 按比例放大。
pGFPuv和pBSK的酶切体系 pGFPuv和pBSK的酶切体系： 的酶切体系：
酶切体系 10×RE buffer (E) 100×BSA DNA EcoR I Hind III ddH2O 质粒载体（pGFPuv和pBSK） 6 µl 0.6 µl 6 µg 0.6 µl 0.6 µl X µl → 合计60 µl
六.DNA片段的胶回收 DNA片段的胶回收
• 电泳洗脱法 • 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 • 冻融回收法 • 玻璃奶回收法 • 柱回收法（按说明书进行）
Gel Extraction Protocol
胶回收后用30-50 µl无菌 双蒸水洗脱DNA片段， 取1-5 µl进行电泳检测， 取2-5 µl测定OD260nm 下的光吸收值，计算 DNA的浓度。 注：1 OD (260nm)相当 于双链DNA浓度为50 µg /ml
• Note:
1. Concentration: 20,000 and 100,000 units/ml. Assayed on lambda DNA 2. Storage Conditions: 250 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5mg/ml BSA, and 50% glycerol. Store at -20°C 3. Diluent Compatibility: Diluent B 4. Heat Inactivation: 65°C for 20 minutes 5. Not sensitive to dam, dcm or mammalian CpG methylation 6. Conditions of low ionic strength, high enzyme concentration, glycerol concentration > 5% or pH > 8.0 may result in star activity
三. 试剂与器材
〈一〉试剂
1. 限制性内切酶EcoRI, HindIII ；10×内切酶缓冲 液 2. T4DNA连接酶；10×连接酶缓冲液 3. 电泳缓冲液（0.5×TBE或1×TAE） 4. 琼脂糖；溴酚兰；溴化乙锭(工作浓度0.5µg/ml) 5. 酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；灭菌双蒸水
充分混匀后，用离心机短时（10秒）离心，于37℃保温3-4 小时或过夜，65℃保温10分钟使限制性内切酶失活。
五.注意事项
• 酶的定义: 酶的定义: 在标准条件下,1小时完全消化1µg线型DNA分子 所需的酶量定义为1U； • 影响限制性内切酶活性的生物因子： 影响限制性内切酶活性的生物因子：
1. 酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质； 2. 识别序列在DNA中的分布频率； 3. 与DNA的构象有关（SC,L,OC）； 4. DNA的纯度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）；
九.DNA片段的连接 片段的连接
1. 根据目的片段和载体大小，以等摩尔比（载体DNA： 插入DNA片段=1:2~ 1:3）计算各自DNA加样量 连接体系：
组分 目的片段（GFP基因） pBSK质粒DNA 10×连接酶buffer T4 DNA连接酶 dd H2O 体积 2 µl 1µ µl 1 µl 0.5 µl X µl → 合计10 µl
• 影响限制性内切酶活性的生物因子： 影响限制性内切酶活性的生物因子： 5. 内切酶用量不超过总反应体积的10%； 6. 消化时间适当延长有利于提高酶活性； 7. 加DNAse-free的BSA 可以起到稳定酶活性的作用； 8. 用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活性； 9. 酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可使用； 10.DNA样品应不含重金属离子。
150 ml×4 瓶（Amp+），用于两个质粒的接种 100 ml ×4瓶(Amp-)，留做感受态细胞 固体（含1.5%琼脂粉）： 每组100 ml，共1200ml，可一起配再分装 每组倒5个平板（ Amp+），用于次周转化
灭菌。
八．实验安排---续 实验安排 续
周五： 用Kit 提取质粒DNA，倒琼脂糖凝胶板（1%），进行琼脂糖凝胶 提取质粒DNA，倒琼脂糖凝胶板（1%），进行琼脂糖凝胶 电泳和浓度测定 每人分别提取pGFPuv、pBSK质粒 各一管，每管60µl 每人分别提取pGFPuv、pBSK质粒 各一管，每管60µl 取1-2µl电泳， 1-5µl用dd H2O稀释后 在紫外分光光度计下测 2µl电泳， 5µl用 OD260及OD280，并计算浓度 对质粒酶切过夜 周六： 酶切样品琼脂糖凝胶（1%）电泳 酶切样品琼脂糖凝胶（1%）电泳 用Kit对酶切后的DNA（ pBSK 大片段和GFP基因片段）片段进行 Kit对酶切后的DNA（ 大片段和GFP基因片段）片段进行 胶回收 每组用一个柱子回收 电泳检测胶回收情况，用紫外检测回收 DNA的浓度后，存放于DNA的浓度后，存放于20℃冰箱中 20℃
七.胶回收注意事项
1. 将电泳槽用ddH2O反复清洗干净, 倒入新鲜
配制的灭菌电极缓冲液； 2. 根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板； 3. 切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶； DNA 4. 要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减 少对DNA的损伤； 5. 熔胶要完全 。
八．实验安排
周四： 熟悉实验原理及步骤，清洗三角瓶、量筒等器皿，装枪头，1.5 / 0.5 ml离心管，装牙签及配溶液等 50×TAE :500 ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0): 500 ml 1mol/L Tris.Cl (pH8.0): 500 ml 0.1mol/L CaCl2: 500 ml ddH2O: 每组100 ml 5 mol/L NaOH: 100 ml 配LB培养基 液体：全班1000 ml
2.DNA的酶切反应 DNA的酶切反应
分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。 它能识别双链DNA分子中特定的靶序列（4～ 8bp),并在该序列内切断DNA，形成特有的粘末 端或平端。
3. DNA的连接 的连接
在T4DNA连接酶的作用下，平端或带有相同粘末 端的DNA分子可以连接上。DNA连接酶的作分三 步： ① T4DNA 连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合 物。 ② 酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’羟基切 口的DNA分子上，使DNA腺苷化。 ③ 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
⑥ 置所用限制性内切酶最适温度水浴中，酶切1~3小时， 酶切过夜则建议改用稍大的酶切体积，以避免水分蒸 发过多影响的酶切体系各组分浓度改变过大; ⑦ 置65℃水浴中10分钟，对限制性内切酶进行灭活，不 同的酶灭活条件可能不同，请参照说明书进行; ⑧ 进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果; ⑨ 反应体系： 10×内切酶缓冲液 DNA 限制性内切酶 2µl 1-1.5µg 2-5单位
2. 台式离心机离心10秒以混合均匀，16℃连接4小时至过 夜，连接产物存放于4℃或直接转化细菌。