丹参酮ⅡA抗宫颈癌鳞癌细胞增殖效应及其雌激素受体亚型介导机制的研究

丹参酮ⅡA抗宫颈癌鳞癌细胞增殖效应及其雌激素受体亚型介导机制的研究

摘要：目的 观察丹参酮ⅡA对宫颈癌鳞癌Siha细胞增殖的影响，探讨其作用机制。方法 不同浓度丹参酮ⅡA作用人宫颈癌鳞癌Siha细胞，MTT法和流式细胞术测定Siha细胞增殖速率和增殖周期分布，Western blot测定Siha细胞磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）、细胞周期蛋白（Cyclin）D表达。结果 1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹参酮ⅡA显著抑制宫颈癌鳞癌Siha细胞增殖，该抑制作用可被雌激素受体（ER）α拮抗剂MPP增强、可被ERβ拮抗剂PHTPP减弱；1×10-5、5×10-6、1×10-6 mol/L丹参酮ⅡA干预后Siha细胞增殖指数显著下降；1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹参酮ⅡA干预后Siha细胞p-ERK、Cyclin D蛋白表达水平显著降低。结论 丹参酮ⅡA抑制宫颈癌鳞癌Siha细胞增殖是通过靶细胞ER途径实现的，并通过降低p-ERK、Cyclin D表达量发挥抗增殖作用。

关键词：丹参酮ⅡA；宫颈癌鳞癌Siha细胞；雌激素受体；细胞增殖；细胞周期；磷酸化细胞外信号调节激酶；细胞周期蛋白D DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.014 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）06-0051-05 Abstract： Objective To study the effects of tanshinone ⅡA on proliferation of cervical squamous cancer Siha cells； To discuss its possible molecular mechanism. Methods Cervical squamous cancer Siha cells were treated with different doses of tanshinone ⅡA. The effects of tanshinone ⅡA on proliferation of Siha cells were measured by MTT assay and flow cytometry analysis. The effects of tanshinone ⅡA on expression levels of phospho-extracellular regulate kinase （p-ERK） and Cyclin D in Siha cells were measured by Western blot. Results 1×10-5， 5×10-6， 1×10-6， 5×10-7 mol/L tanshinone ⅡA significantly inhibited Siha cell proliferation and such effect could be enhanced by ERα antagonist MPP and attenuated by ERβ antagonist PHTPP. 1×10-5， 5×10-6， 1×10-6 tanshinone ⅡA could significantly decrease the proliferation index of Siha cells. 1×10-5， 5×10-6， 1×10-6， 5×10-7 mol/L tanshinone ⅡA could significantly reduce the protein expression levels of p-ERK and Cyclin D of Siha cells. Conclusion Tanshinone ⅡA can inhibit cervical squamous cancer Siha cell proliferation and such effect is realized via estrogen receptor pathway. Tanshinone ⅡA plays anti-proliferation roles by reducing the expression levels of p-ERK and Cyclin D. Key words： Tanshinone ⅡA； cervical squamous cancer Siha cell； estrogen receptor； cell proliferation； cell cycle； phospho-extracellular regulate kinase； Cyclin D 丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦、养血安神等功效。现代药理研究表明，丹参具有保护心血管、增强机体免疫功能、抗菌、抗炎、抗氧化等作用[1-2]；特别是在多个靶器官均具有抗肿瘤功效[3-4]。丹参酮ⅡA是从丹参中提取的重要脂溶性活性成分，是丹参发挥抗肿瘤作用的主要药效成分[5]。本实验前期研究表明，丹参酮ⅡA具有抗乳腺癌T47D细胞增殖的作用[6]，且经经典核雌激素受体（ER）α和β介导。近年来，宫颈癌的发生率在妇科肿瘤中明显上升[7]，丹参酮ⅡA是否具有抗宫颈癌的作用？该作用是否经ER介导？2种ER亚型在介导过程中的作用是否有差异？为了验证上述假设，本研究选取人宫颈癌鳞癌Siha细胞，探讨丹参酮ⅡA对其增殖过程的影响及其ER亚型介导途径。 1 实验材料 1.1 药物和细胞株 丹参酮ⅡA，中国食品药品检定研究院，纯度98%。人宫颈癌鳞癌Siha细胞，北京协和医学院细胞中心。 1.2 主要试剂与仪器 DMEM（高糖）、无酚红DMEM（高糖）、胎牛血清、活性炭-葡聚糖处理胎牛血清，Hyclone公司；雌二醇（E2）、MTT、DMSO、RNase、碘化丙啶、甲醇，Sigma公司；β-肌动蛋白抗体，中杉金桥公司；磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）、细胞周期蛋白（Cyclin）D抗体，Santa Cruz公司；ERα、ERβ特异性拮抗剂MPP、PHTPP，Tocris公司；甘氨酸、Tween20，Amresco公司；BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液、浓缩胶缓冲液、分离胶缓冲液、蛋白相对分子质量Marker、ECL超敏发光液，普利莱基因有限公司；二抗Anti-Rabbit IgG/HRP和Anti-Goat IgG/HRP，北京康为世纪生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。CO2培养箱（Binder），酶联免疫检测仪（Epson LX-800），倒置显微镜（Olympus），凝胶成像分析仪（Pharmacia），流式细胞仪（BD）。 2 实验方法 2.1 细胞培养 人宫颈癌鳞癌Siha细胞常规培养在含10%胎牛血清的DMEM高糖溶液中，培养条件为37 ℃、5%CO2及相对饱和湿度。实验开始前4 d PBS洗涤细胞2次后，改为在无酚红DMEM（含5%CDT-FBS）中培养，以耗尽细胞内储存的雌激素。 2.2 MTT法测定细胞增殖速率 Siha细胞传代3次，经无酚红DMEM（含5%CDT-FBS）培养4 d后，选取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次，加无血清DMEM，以细胞密度3×l03个/孔接种于96孔板，每孔培养液总体积为200 μL。培养24 h待细胞贴壁后，换为含1×l0-8 mol/L E2和1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹参酮ⅡA的DMEM培养液中继续培养，拮抗组同时加入1×l0-8 mol/L MPP或PHTPP，每种受试物均设7个复孔。48 h后加MTT（5 mg/mL、15 μL/孔），继续孵育4 h，小心吸去培养液，每孔加DMSO 150 μL。以DMSO调零，于酶标仪570 nm处测定各孔吸光度（A）值，取其平均值，计算细胞增殖速率（实验组A值÷对照组A值）。 2.3 细胞周期测定 取经无酚红DMEM（含5%CDT-FBS）培养4 d的Siha细胞，以5×105个/瓶密度接种于25 cm2的培养瓶中，以无血清DMEM接种24 h待细胞贴壁后，换为含1×l0-8 mol/L E2和1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹参酮ⅡA DMEM培养液中继续培养48 h后终止，获得细胞用70%冷乙醇4 ℃固定过夜，RNase处理，碘化丙啶染色，2 h内流式细胞仪检测细胞周期分布，计算细胞增殖指数[（S+G2/M）÷（G0/G1+S+G2/M）×100%]。 2.4 Western blot检测细胞磷酸化细胞外信号调节激酶、细胞周期蛋白D蛋白表达 细胞预处理过程同“2.3”项。药物作用48 h后，收集细胞，加入细胞裂解液，12 000×g离心5 min，将上清液进行蛋白含量测定后用于分析。蛋白变性后上样，SDS-PAGE电泳（浓缩胶80 V，分离胶120 V），半干电转膜仪转膜（80 V，75 min）。5%脱脂奶粉37 ℃振摇1 h将膜封闭；分别加p-ERK、Cyclin D、β-肌动蛋白一抗，4 ℃孵育过夜。HRP标记的二抗37 ℃振摇1 h后，将PVDF膜置ECL混合液中室温下振荡孵育5 min，X胶片曝光，显影、定影、扫描后，以β-actin表达量为对照观察结果。 3 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件进行分析。实验数据以―x±s表示，组间比较采用方差分析，组间多重比较用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。 4 结果 4.1 丹参酮ⅡA对Siha细胞增殖的影响 MTT法检测显示，48 h 时1×l0-8 mol/L E2可使Siha细胞增殖速率明显增加（P<0.01），加入MPP或PHTPP后其促增殖作用均受到抑制。而1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹参酮ⅡA对Siha细胞增殖均具有抑制作用；加入MPP可增强其增殖抑制作用，而加入PHTPP拮抗其增殖抑制作用，见表1。 4.2 丹参酮ⅡA对Siha细胞增殖指数的影响