实验三 凝胶过滤法分离蛋白质
凝胶过滤层析法分离蛋白质
（2）凝胶的特点
属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条 件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要 有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。 交联葡聚糖凝胶
聚丙烯酰胺凝胶
琼脂糖凝胶
（3）凝胶的选择
多孔网孔结构 A. 葡聚糖凝胶 (商品名: Sephadex，Dextran) 型号: G-10 – G-200
馏水，进行洗脱，直到两带分开
② 检查Hb在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后，
用试管分步收集洗脱液 ③ 10d/管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d ④ 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）
缩二脲反应 （双缩脲反应）
O
O CuSO4 碱性 紫 红色
H2N - C - NH - C - NH2
实验一 凝胶过滤层析法分离蛋白质
一、 实验目的
1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。
二、 实验原理
1. 常用生化实验技术
分光光度技术
电泳技术
离心技术 层析技术
2. 层析技术（色谱技术）
是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附 力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲 和力等）建立起来的技术。
5. 加样
① 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露
出床面时，立即关闭出口（将干未干） ② 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面 ③ 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出, 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水
6. 洗脱
① 当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸
按操作形式不同分类
名称 柱层析法 操作形式 固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方 向前移而达分离的层析法，包括一般柱层 析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
所以，要根据具体情况选择使用。
凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatograph y）、分子筛过滤（molecularsieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。
这样被分离物质即被按分子的大小分开。
用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
了解凝胶层析分基本原理，学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
三、试剂和材料
1）载体：葡聚糖凝胶G-50 2）样品液：
含蓝色葡聚糖2000[相对分子质量在200万以上，蓝色]， 红色水溶性百里香酚蓝[分子质量488.60，红色]
3）洗脱液： 50mmol/L pH3.0 磷酸缓冲液。
（每组200ml。溶液配方：磷酸氢二钠：1.754g；磷酸二氢钠： 0.796g；NaCl：1.752g，用水定容至200ml。配制完成后用盐酸调pH 值为3.0）
凝胶过滤层析原理示意图
一、目的 二、原理
1）凝胶层析是基于分子大小不同而进行分离的一种分离方 法。 2）将一定量的含有不同大小分子的混合原料加在柱上并用 流动相洗脱，则无法进入多孔凝胶颗粒内部的大分子会直接随 流动相由凝胶颗粒之间的空隙被洗脱下来； 3）小分子因可深入凝胶颗粒内部而受到很大的阻滞，最晚 洗脱下来； 4）中等大小的分子虽可进入凝胶颗粒内部但并不深入，受 到凝胶颗粒的阻滞作用不强，因而在两者之间被洗脱下来。
8
实验步骤
五、收集： 1、用试管进行样品的收集，每管1ml。
2、注意观察层析柱内分离现象，并观察收集管内颜色深浅， 以—、+、++等记号记录两种物质洗脱液的颜色。或者用400nm， 550nm测其OD值
六、凝胶柱的处理： 1、凝胶柱用过后，反复用蒸馏水（2~3倍床体积）通过柱即可。
2、如果凝胶有颜色或比较脏，需用0.5 mol/L 的NaOH-0.5 mol/L NaБайду номын сангаасl洗涤，再用蒸馏水洗。
7
实验步骤
三、平衡： 1、将洗脱液与恒流泵相连，用2倍床体积的洗脱液平衡，平衡 完成后，检测流出液的pH值是否为3.0。 四、加样和洗脱： 1、将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口。 2、将400ul的样品沿层析柱管壁小心加入，加完后，在打开底 端出口。 3、用少量洗脱液清洗柱内壁2次，加洗脱液至液层4cm左右， 按上恒流泵，开始洗脱。
实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质课件
实验三葡聚糖凝胶柱 层析纯化蛋白质课件
目录
• 实验原理 • 实验材料与设备 • 实验步骤 • 结果分析与讨论 • 注意事项与安全
01
实验原理
葡聚糖凝胶柱层析的原理
葡聚糖凝胶是一种具有三维网络结构的凝胶，具有良好的机 械强度和化学稳定性。它可以通过改变凝胶孔径的大小来分 离不同大小的分子。
当混合物溶液通过葡聚糖凝胶柱时，分子量较小的物质可以 进入凝胶孔内，而分子量较大的物质则被排阻在外。随着流 动相的流动，分子量小的物质逐渐被冲出凝胶柱，而分子量 大的物质则被滞留在凝胶柱内或缓慢流出。
结果的讨论与优化
结果讨论
根据实验结果，讨论凝胶柱层析纯化蛋白质的效果，分析可能影响分离效果和蛋 白质纯度的因素，如凝胶柱的填装、洗脱液的组成和洗脱速度等。
结果优化
根据结果讨论，提出优化实验条件的建议，如改变凝胶柱的填装方式、调整洗脱 液的组成或改变洗脱速度等，以提高蛋白质的分离效果和纯度。
05
注意事项与安全
分离度的计算
分离度是相邻两个峰之间的距离与峰宽的比值，可以通过测量洗脱液中 蛋白质的浓度变化来计算。
03
回收率的计算
回收率是纯化后蛋白质的质量与纯化前蛋白质的质量的比值，可以通过
称重法或紫外吸收法来测量。
蛋白质纯度的检测
检测方法：蛋白质纯度的检测方法包 括电泳法、质谱法、免疫学检测法和 光谱分析法等。电泳法是最常用的方 法之一，可以通过观察电泳图谱来判 断蛋白质的纯度。
电泳图谱的分析：电泳图谱中，单一 的、清晰的条带表明蛋白质纯度较高 ；而模糊的、多条带则表明蛋白质中 含有杂质。
纯度标准：蛋白质纯度标准通常由国 际蛋白质协会制定，分为一级、二级 和三级纯度标准。一级纯度标准要求 蛋白质中仅含有一种单体蛋白质，不 含有其他杂质；二级纯度标准要求蛋 白质中主要含有一种单体蛋白质，其 他杂质含量不得超过5%；三级纯度标 准要求蛋白质中主要含有一种单体蛋 白质，其他杂质含量不得超过10%。
凝胶过滤纯化实验报告
1. 熟悉凝胶过滤纯化实验的原理和操作方法。
2. 掌握凝胶过滤纯化蛋白质的基本步骤。
3. 学习通过凝胶过滤纯化实验对蛋白质进行分离和鉴定。
二、实验原理凝胶过滤纯化实验是一种基于分子筛效应的蛋白质分离和纯化技术。
实验中，利用凝胶颗粒的多孔结构，将待纯化的蛋白质溶液通过凝胶层析柱，根据蛋白质分子量的大小进行分离。
分子量较小的蛋白质可以进入凝胶颗粒的孔隙，滞留时间较长，而分子量较大的蛋白质则不能进入凝胶颗粒，滞留时间较短，从而实现蛋白质的分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质样品- 凝胶层析柱- 凝胶颗粒（如Sephadex G-75）- 洗脱液（如磷酸盐缓冲液）- 蛋白质标准品- 紫外分光光度计- 显微镜2. 实验仪器：- 凝胶层析柱- 移液器- 烧杯- 离心机- 紫外分光光度计1. 制备凝胶层析柱：将凝胶颗粒与洗脱液混合，加入凝胶层析柱中，让凝胶颗粒自然沉淀，形成凝胶床。
2. 加样：将蛋白质样品与洗脱液混合，用移液器取适量加入凝胶层析柱顶部。
3. 洗脱：用洗脱液缓慢滴加至凝胶层析柱中，待样品全部通过凝胶层析柱后，继续用洗脱液冲洗，收集洗脱液。
4. 蛋白质鉴定：取一定量的洗脱液，用紫外分光光度计检测蛋白质含量。
5. 分析结果：将收集到的洗脱液进行SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质分离效果。
五、实验结果与分析1. 紫外分光光度计检测结果显示，蛋白质在洗脱过程中逐渐释放，表明凝胶过滤纯化实验成功。
2. SDS-PAGE电泳结果显示，蛋白质在凝胶层析柱中被成功分离，表明凝胶过滤纯化实验达到了预期效果。
六、实验讨论1. 凝胶过滤纯化实验是一种简单、高效、温和的蛋白质分离和纯化方法，适用于分子量不同的蛋白质分离。
2. 实验过程中，凝胶层析柱的制备、加样、洗脱等步骤需严格按照操作要求进行，以保证实验结果的准确性。
3. 凝胶过滤纯化实验的分离效果与凝胶颗粒的孔径、洗脱液的选择等因素有关，应根据实验需求选择合适的凝胶颗粒和洗脱液。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
【实验器材】
层析柱 恒流泵 紫外检测仪 部分收集器 试管等普通玻璃器皿
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
【实验试剂】
待分离样品 葡聚糖凝胶 Sephadex G-100 洗脱液：0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液
凝胶层析法分离纯化蛋白质
【原理】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离的技术。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋 白质分子量大小进行分 离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。
单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的 程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
带网入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过凝滤胶层层析法分析离纯过化蛋程白质 示意图
凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤凝胶层层析法析分离过纯化程蛋白质示意图
总结：
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。
凝胶分离法
观察凝胶与水分层, 此间不能使胶面干掉。
注：如床表面不平整，可在凝胶表面用玻璃棒轻轻 搅动，再让凝胶自然沉降，使床面平整。
③调节流速：调节凝胶床所能承受的最大水压，
使出口流速7-8d/min。
3、加 样、洗脱、收集
①.放水： 将出口打开，使床面上的蒸馏水缓慢下流， 达到床面将近露出为止，关紧出口。 （注意：不可使床面干掉，以免气泡进入凝胶）
交联葡聚糖凝胶（Sephadex）
• 葡聚糖和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。
• 按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。
• Sephadex G-10，15，25，50，75，100，150，200
• 数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。 Sephadex
G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。
②加样：用吸管吸取0.5ml脲酶粗提取液，缓慢地沿着 层析柱内壁加于床表面 注意：尽量不使床面扰动
③洗脱、收集：接上贮液瓶，进行洗脱，流出的液体分别 收集在小离心管中， 流速：7- 8d/分钟， 收集量：为3ml/管 (先用一支刻度离心管, 后可根据高度用普通管) 数量：共收集约8-9管（澄清后在收集1-2管） 注意：必须保持床面平整，而且不能干，随时加蒸馏水。
实验2
脲酶的凝胶过滤 分离纯化
实验 原理
脲酶分子量较大，脲酶粗制品通过交 联葡聚糖Senhadex G－150层析柱 酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内， 而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可 扩散进入凝胶颗粒。
用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶 首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离 的目的。
0.1ml 2.9ml 2滴
充分混匀
Nessler试剂 0.75ml 0.75ml 0.75ml
蛋白质分离纯化方法之凝胶过滤层析法
蛋白质分离纯化方法之凝胶过滤层析法在进行蛋白质研究时，首先需要选择一套合适的蛋白分离和蛋白纯化方法来获取高纯度的生物制品，来进行下一步的研究。
由于蛋白质具有颗粒大且不同蛋白质分子大小不同等特点，因此可以根据蛋白质分子大小不同而进行分离，这种分离方法有透析、超滤、离心和凝胶过滤，常包含在一些蛋白分离公司的服务中。
凝胶过滤是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，也称为分子排阻层析或分子筛层析。
凝胶过滤可以利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按照分子大小分开，从而达到分离的目的。
在一些蛋白分离公司的服务中，凝胶过滤层析法常与其他层析方法配合使用。
1、凝胶过滤层析法的基本原理凝胶过滤层析法的主要装置是填充凝胶颗粒的层析柱，柱中最常用的填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶，为惰性的多孔网状结构物质。
当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入其内部，而是被排阻在凝胶颗粒外部，在颗粒之间的空隙中向下移动，并最先流出柱外。
小分子物质能进入凝胶颗粒内部，因此流程较长。
这样不同大小的分子因所经路径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。
美迪西是一家医药研发外包服务公司，提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。
凝胶过滤层析法用于蛋白分离和蛋白纯化，具有操作条件温和，适用于分离不稳定的化合物的特点。
且凝胶颗粒不带电荷，不与被分离物质发生反应，因此溶质回收率接近100%，而且设备简单、分离效果好、重现性强，凝胶柱还可以反复使用，所以该方法被广泛应用于蛋白质等大分子物质非分离纯化、分子质量测定、脱盐等试验中。
2、凝胶过滤层析法纯化重组人干扰素α2b的研究将凝胶过滤层析方法用于通过基因工程方法获得的工程菌种纯化，可以制备高纯度的样品，提高生物活性，为进一步开展药学研究和长效制备提供了依据。
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质
实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。
2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。
Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。
一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
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实验三 凝胶过滤法分离蛋白质
【实验目的】
了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
【基本原理】
凝胶过滤其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特
点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶过滤的主要装置是填充凝胶颗粒的层析柱。目前使用较多的凝胶时交联葡聚糖凝胶
（商品名是Sephadex）。这种高分子材料具有一定孔径的网络结构。高亲水，在水溶液里吸水
可膨胀。其交联高的小号胶Sephadex-G-25适用于脱盐。
当在填充好凝胶颗粒的层析柱顶加入被分离的分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱
时，小分子物质可进入胶粒内部，而受排的大分子不能进入胶粒内部，由此二者在洗脱过程
所经路程长短不同而得以分离。由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路
程短，最先流出；而渗入胶粒内部的小分子物质受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流
动，所经路程长，最后流出；通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按由
大到小的顺序流出实现分离的目的。
凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物。凝胶颗粒不带电荷，不与被分离
物质发生反应，因此溶质回收率接近100%，而且设备简单、分离效果好、重现性强，凝胶柱
还可反复使用，所以广泛应用于蛋白质等大分子物质非分离纯化、分子质量测定、脱盐等用
途。
在含有血红蛋白（Mw=64500）的溶液中加入过量的高铁氰化钾（K3Fe（CN）6，Mw=327.25）,
血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白（MetHb）。为了除去多余的高铁氰化钾，等到
较纯的MetHb（红褐色）洗脱较快，而小分子高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，从而达到将
MetHb完全分离出来的目的。
【实验试剂、材料和器材】
（一）试剂
（1）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：
称取磷酸氢二钠20.7472g和磷酸二氢钠3.1167g，溶于约900mL的蒸馏水中，调pH值到7.0，
最后定容到1000mL。
（2）0.4% K3Fe（CN）6：
称取0.4g K3Fe（CN）6，溶于100mL蒸馏水中。
（3）生理盐水：0.85~0.9%氯化钠水溶液，置于冰箱中预冷。
（4）四氯化碳（CCl4）
（5）交联葡聚糖（Sephadex-G-25）
（二）材料
动物的抗凝全血
（三）器材
pH计，1.5cm×20cm的层析柱，电子天平，冰箱，试管，容量瓶，量筒，大烧杯，玻璃棒，
胶头滴管等
【操作步骤】
1.凝胶溶胀
称取5 g Sephadex-G-25，倾入锥形瓶中，加60mL蒸馏水搅匀后静置，充分溶胀（在
室温下约需6h或者在沸水浴中溶胀2h）。凝胶溶胀后，需要蒸馏水洗涤约3次，每次应
将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出来，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速。洗后将
凝胶浸泡在10倍体积的磷酸缓冲液中过夜待用。
2.装柱
取层析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，加入缓冲液，打开出口，将气
泡赶走，关闭下端出口。然后从管顶向柱内加入缓冲液约6cm高，将已经溶胀好的
Sephadex-G-25搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的
Sephadex-G-25，使凝胶自然沉降高度到17cm左右床面上覆盖3mL缓冲液，关闭出口，
在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸，待凝胶柱形成后，在洗脱液中加入磷酸盐缓冲溶液以
2~3倍体积的磷酸盐缓冲液流过凝胶柱，以平衡凝胶，最后关闭出口。
3.样品处理
（1）血红蛋白溶液的制备
取草酸盐抗凝全血3mL离心，吸去上层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后
3000r/min离心5min，弃去上清液，重复洗3次。最后一次吸去上清液后在红细胞层上
面加等体积蒸馏水，摇匀。再加1/2体积CCl4，用力振摇3min，3000r/min离心5min。
吸取上层澄清的血红蛋白液备用。此溶液中血红蛋白浓度约为10%（置4℃暂存，一周
用完）
（2）样品
血红蛋白液、0.4% K3Fe（CN）6和蒸馏水按照3:8:2混合，制成MetHb混合样品。
3.上样和过滤
凝胶平衡后，用胶头滴管除去凝胶柱面的溶液。吸混合样品0.5mL左右，在距离床
面1mm处沿管内壁轻轻转动加样品，切勿搅动床面。然后打开柱下口，控制流速让样
品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲溶液，并用1~2倍体积的此缓冲
液洗脱，但注意切勿搅动床面凝胶。
4.部分收集
控制流速为0.5mL/min左右（即约每六秒一滴），用试管收集洗脱液。并观察柱上
的色带，待黄色的0.4% K3Fe（CN）6完全洗脱下来后，再继续收集两管透明的洗脱液
作为对照，关闭出口。
5.凝胶回收
收集样品后，凝胶柱可用3~5倍体积洗脱液继续洗脱，即可重复使用或回收凝胶。
凝胶暂时不用可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。若放在室温下保存应加入0.02%
叠氮钠（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐剂，以防发霉。用时以水洗去防腐剂即可用。凝
胶长期不用，可用水洗涤，分次加百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使之
平衡，再换下一浓度的乙醇，让凝胶逐步脱水，再用乙醚除乙醇，抽干即可，或将凝胶
洗净后抽干，在表面皿上30℃逐步烘干。
【思考题】
1.利用凝胶层析分离混合物时，怎样才能得到较好的分离效果？
2.凝胶过滤法在蛋白质分析中还有何应用？