生化药物质量标准中的生物检定及其进展
生物药物分析方法
谈谈生物药物分析方法—现状与发展趋势摘要：本文对生物药物分析方法进行了较全面的阐述，并对近年来生物药物分析的新方法、新技术的进展及应用前景进行探讨。
关键词：生物药物分析生物药物包括直接从生物体分离纯化所得生化药物及利用基因重组技术或其它生物技术研制的生物技术药物及生物制品[1]。
由于生物药物具有毒性低、副作用小、易被吸收的特点，同时具有多方面的生物活性及功能，在疾病的预防、诊断及治疗方面有着突出贡献。
随着人们对生命本质及身体健康的日益关注，生物药物的研究和开发日趋增加，控制生物药物的质量，加强药物分析检测技术日益受到重视。
本文将对用于生物药物的鉴别、检查和含量测定的方法进行分析比较，并对近年来生物药物分析的新方法、新技术的进展及应用前景进行探讨。
一．生物药物分析方法生物药物分析主要包括化学方法、仪器分析方法和生物检定法。
1．化学法化学法包括重量法和滴定法重量法：指待测物经处理后分离出与待测组分相关的单质或化合物，根据其质量，确定该组分的含量。
硫酸软骨素的测定及胰酶中脂肪含量的测定均采用重量法[2]。
滴定法：指利用化学反应定量关系，根据消耗标准溶液的体积确定待测物的含量。
目前滴定法在我国药典中仍占有一定的比例，氨基酸类和糖类药物多用滴定方法进行含量测定[3]。
化学方法主要用于常量分析，准确度较高，但操作繁琐，耗时较长，不利于实现自动化，在药典及近年来的研究中有所下降。
而仪器分析方法的研究、应用与改进则是生物药物分析的热点。
2．仪器分析方法仪器分析方法用于微量和痕量分析，灵敏度较高。
主要包括光学法、电化学法、色谱法、电泳法、酶法、免疫法。
(1)光学法在生物药物分析中常用的光学分析方法有：紫外/可见分光光度法、荧光法、红外吸收分光光度法、核磁共振、质谱等。
紫外/可见分光光度法：主要是利用生物大分子中的某些基团对特定波长具有光吸收作用或某些特殊基团可与某些化学试剂反应生成稳定的颜色，根据吸收光的波长及强度对物质进行定性定量分析。
生物药物质量控制的生化分析方法
生物药物质量控制的生化分析方法生物药物质量控制的生化分析方法摘要：总结生物药物质量控制的生化分析方法，从生物多肽蛋白类药物、核酸类药物、酶类药物、重组DNA药物等几方面分类阐述了生物药质量控制的具体技术方法。
有助于研究和发展现代分析技术，加强生物药物质量控制，推动我国医药产业发展。
关键词：生物药物质量控制生化分析Biological drugs quality control of biochemical analysis method2021060221 liuyongganAbstract：Summarize biological drugs quality control of biochemicalanalysis method, It expounded classification for quality control of specific technical method from biological polypeptide protein drugs, nucleic acid drugs, enzymes drugs and recombinant DNA drug. Help to research and development of modern analytical technology, andstrengthening biological drugs quality control, impelling our country medicine industry development.Keywords：biological drugs quality control biochemical analysis 1 多肽与蛋白质类药物的主要分析方法1.1 蛋白质药物的纯度分析纯度控制是每一种药物都必需的质量保证手段。
蛋白质的纯度检定方法有：PAGE、SDS-PAGE、CE、IEF、HPLC包括凝胶排阻层次、各种反相HPLC，离子交换色谱、疏水色谱等。
药物分析：常用定量分析法与应用——生物检定法
（⼀）概述⽣物检定法是利⽤药物对⽣物体（整体动物、离体组织、微⽣物等）的作⽤以测定其效价或⽣物活性的⼀种⽅法。
它以药物的药理作⽤为基础、⽣物统计为⼯具，运⽤特定的实验设计，通过供试品和相应的标准品或对照品在⼀定条件下⽐较产⽣特定⽣物反应的剂量⽐例，来测得供试品的效价。
（⼆）⽣物检定法的应⽤范围1．药物的效价测定对⼀些采⽤理化⽅法不能测定含量或理化测定不能反映临床⽣物活性的药物可⽤⽣物检定法来控制药物质量。
中国药典收载了洋地黄、胰岛素、肝素、绒促性素、缩宫素、硫酸鱼精蛋⽩等的⽣物测定法及各种抗⽣素的微⽣物测定法。
有些天然药物、⽣物制品（包括⽣化药物）往往因结构复杂，⽽且往往⼜是由结构类似、⽐例不定的多种成份组成，很难⽤理化⽅法反映其⽣物活性；另⼀些药物，尤其是⼀些激素类药物，其结构相近，⽽⽣物活性不同；还有些药物虽可⽤理化⽅法测定含量，但含量不能完全反映效价，如天青A变⾊反应测定肝素，测定结果与抗凝⾎效价不⼀致。
因此，这些药物的质量控制都离不开⽣物检定。
2．微量⽣理活性物质的测定⼀些神经介质，激素等微量⽣理活性物质，由于其很强的⽣理活性，在体内的浓度很低，加上体液中各种物质的⼲扰，很难⽤理化⽅法测定。
⽽不少活性物质的⽣物测定法由于灵敏度⾼、专⼀性强，对供试品稍作处理即可直接测定。
如⼄酰胆碱，5-羟⾊胺等活性物质的测定。
3．中药质量的控制中药成份复杂，⼤部分中药的有效成份尚未搞清，难以⽤理化⽅法加以控制，但可⽤⼀些以其疗效为基础的⽣物测定⽅法来控制其质量。
4．某些有害杂质的限度检查如农药残留量、内毒素等致热物质、抗⽣素及⽣化制剂中降压物质的限度检查等。
由于⽣物差异的存在，⽣物检定结果误差较⼤，重现性较差，需要控制的条件较多，加上测定费时，计算繁琐，所以，⽣物检定主要⽤于⽆适当理化⽅法进⾏检定的药物，补充了理化检验的不⾜。
药品生物检定技术简介
门冬酰胺酶（抗肿瘤药） Ch.P（2005）二部 本品系自埃希大肠杆菌（E.coli ASI.357）
或欧文菌（Er-winia casotovora）中提取制备的 具有酰氨基水解作用的酶。
肝素钠（抗凝血药） Ch.P（2005）二部 本品系自猪或牛的肠黏膜中提取的硫酸氨
基葡聚糖的钠盐，属黏多糖类物质。
小包装容器的数量。
例：2支（瓶）/2板×12粒
检查量：指一次试验所用供试品的总量
（g 或 ML）
例： 2×10=20ML
24×0.25=6g
2、对照试验： 阳性对照
阴性对照
9
3、检查方法：
a、薄膜过滤法：应用广、准确性高，适用 于任何药品、尤其是具有抑菌作用的
。
b、直接接种法：操作简便，适用于无 抑菌 作用的供试品。
中文名称
英文名或缩写
适应症
重组人干扰素a1b
rhuIFNaIb
上皮生长因子
(EGF)
粒细胞集落刺激因子
(GCSF)
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)
红细胞生成素
(EPO)
溶栓药物链激酶
(SK)
重组人胰岛素
Humulin
Novolin
Humalog
白细胞介素-2
rhuIL-2
治疗病毒性角膜炎 烧伤或创伤治疗外用药物
细胞因子类（重组人干扰素）
生长因子类（重组人表皮生长因子）
激素类（重组人胰岛素）
酶类（重组链激酶）
疫苗（重组乙型肝炎疫苗）
单克隆抗体
37
重组DNA技术
38
国外重组DNA制品
中文名称
英文名或缩写
适应症
胰岛素
生物检定在药品质量标准中的作用
生物检定在药品质量标准中的作用
王亚敏
【期刊名称】《中国生化药物杂志》
【年(卷),期】2007(28)2
【摘要】目前生物检定在药品尤其是生化药物质量控制其活性、效价等方面仍发挥重要作用.此文综述了生物检定在药品质量控制中的作用.
【总页数】4页(P133-136)
【作者】王亚敏
【作者单位】国家食品药品监督管理局,药品审评中心,北京,100038
【正文语种】中文
【中图分类】R392-33
【相关文献】
1.白带Ph值侧定在妇检普查中的辅助作用 [J], 朱宇航
2.ERCP中细胞刷检和胆汁肿瘤标志物测定在胆管癌诊断中的价值 [J], 杨名友;陈幼祥
3.右美托咪定在乳腺活检手术患者中的临床应用 [J], 于晓东;杨静远;冯艳宏
4.临床微生物检验医师在检报系统中的重要作用 [J], 过祥豹
5.膜活检结合胸水腺苷脱氨酶的测定在诊断结核性胸膜炎中的作用 [J], 刘卫;凌宙贵;汪春梅;蒋连强;蒋荣芳
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生化药物质量标准中的生物检定及其进展
生长激素
重法和胫骨法
重组人胰岛素 小鼠或家兔血糖法 HPLC
降钙素
大鼠血钙法
HPLC
低分子肝素 血浆凝固法或家兔 分光光度法 全血凝固法
ChP2005 BP2007 ChP2005 BP2007 ChP2005 BP2007 BP2007
在本实验室已用理化测定代替生物测定 两种方法间具有良好相关性（P﹤0.01）的品种
活性测定分类
活性测定---定量：质量标准中生物效价 测定（HCG、HMG、肝素）
---半定量 ---定性
活性测定------半定量
半定量------当理化测定占主导地位，生物效价 测定降为辅助作用，只用于活性检查，设定限 值，采用半定量方法，不需精确的生物统计， 尽可能减少实验动物用量
如治疗二型糖尿病新药重组人胰高血糖素类多 肽-1（7-36）质量标准中采用半定量方法（限 值为小鼠血糖降低应大于20%）进行活性检查
生化药名
生物测定方法
理化测定方法 收载标准
伟素
大鼠血脂清除率法 分光光度法
(Sulodexide)
重组绒促性素 幼小鼠子宫增重法 HPLC (rHCG)
重组卵泡刺激 幼大鼠卵巢增重法 HPLC 素(rFSH)
重组黄体生成 幼大鼠精囊增重法 HPLC 素(rLH)
企业标准 企业标准 企业标准 企业标准
BP2007版胰岛素采用HPLC法
ChP2005版二部，动物胰腺提取的胰岛素定量生物测定
中国药典2010年版二部生化药品专业科研项目
1、药品中氨基酸分析方法的研究（归纳分类）。（中检所负责） 2、蛋白质含量测定方法的规范化研究，增订附录。（上海所负
责） 3、人工肠液和胃液中所用酶试剂的标准化研究。（中检所和北
动态 药品生物检定技术
动态药品生物检定技术
药品生物检定技术是指对药品中的生物成分进行评估和检测的科学技术。
药品中的生物成分包括微生物、细胞、基因等。
药品生物检定技术的发展主要体现在以下几个方面：
1. 微生物检定技术：药品中可能存在各种微生物污染，如细菌、真菌、酵母等。
微生物检定技术通过灭菌、菌落计数、PCR
等方法，对药品中的微生物进行检测和鉴定。
2. 细胞检定技术：某些药品中可能存在动物或人类细胞，例如生物制剂中的细胞培养液。
细胞检定技术可以通过细胞培养、细胞增殖和细胞标志物检测等方法，对药品中的细胞进行检测和分析。
3. 基因检定技术：某些药品中可能含有基因工程产物，如蛋白质药物。
基因检定技术可以通过PCR、DNA测序等方法，对
药品中的基因进行检测和确认。
药品生物检定技术的发展，可以确保药品的质量和安全性。
同时，随着基因工程和细胞治疗领域的发展，药品生物检定技术也在不断创新和完善，以应对新的药品类型和新的挑战。
生化药物分析及生物检定技术
一、平皿法
4．药品的预处理 (2) 固体、半固体或黏稠液供试品 ③ 不溶于水的膜剂供试品 取100cm2，剪碎， 加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液100mL(必 要时可增加稀释剂)，浸泡，振摇，作为供试液。 ④ 肠溶胶囊(片)供试品 称取供试品10g，置 含pH6.8无菌磷酸盐缓冲液100mL的锥形瓶内， 于45℃水浴中，保湿，振摇，使溶解作为供试液。
一、平皿法
o 5．细菌总数计数 o (7) 结果报告 菌数报告：选择菌落数在30～300
之间的稀释级平板计数，以该稀释级的平均平板菌落数 乘稀释倍数作为报告菌数；若邻近的2个稀释级平均平 板菌落数均在30～300之间，计算级间比值，当比值 ≤2时，以2级菌落数的平均值为报告菌落数，比值大于 2但不超过5时，按低稀释级平均菌落数乘稀释倍数为 报告菌数。当比值大于5时，或高稀释级的菌落数大于 或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应重新验证； 各稀释级平均菌落数均不足30时，以最低稀释级平均 菌落数乘稀释倍数为报告菌数；如各稀释级平板均无菌 落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，以小于 1乘以最低稀释倍数的值为报告菌数。
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及
其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检
查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控
制菌检查。微生物限度检查应在环境洁净度 10 000级下的局部洁净度100级的单向流 空气区域内进行，其全过程必须严格遵守无 菌操作，防止再污染。
二、检查方法
药品微生物限度检查采用活菌计数，
三、生化药物分析进展 总体向理化/仪器分析发展 如：GC、HPLC、UV、TR、质谱、磁共振、 超离技术、放射免疫、酶试剂、酶电极检 测等。 另，应用细胞培养，对生化药的活力 和效价检测。 单克隆体免疫分析技术及基因分析技 术，提高检测限量和灵敏度。
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发展趋势
减少实验动物用量、降低实验费用 缩短实验周期，提高实验准确度、精密度和稳
定性 检测方法的in vitro代替in vivo 简单代替繁琐
生物测定正从主导地位的定量测定降为辅助作 用的半定量、定性测定，直至被取代
•
胰岛素（动物胰腺提取）生物检定
USP29版胰岛素生物鉴别试验( Bioidentity test) 半定量的8只家兔血糖法（SH、SL，TH、TL组，每组2
涉及到多组分生化药特性的指标应订入质量标准 ，如过 敏物质、降压物质、异常毒性等。活性测定也是反映产 品质量的重要指标，有时比含量测定更具专属性，建议 将活性测定收入标准
•
生物检定（bioassay ）
按生物体分类：体内测定 (in vivo)---整体动物 体外测定(in vitro)---离体器官
只），生物效价不得低于15 USP U/mg
定量的生物效价测定需用24只家兔血糖法（ SH、SL， TH、TL组，每组6只）
定量法用于胰岛素标准品标定、新制剂稳定性的考察、 胰岛素类似物特异性活性的测定，而不用于常规检定
BP2007版胰岛素采用HPLC法
ChP2005版二部，动物胰腺提取的胰岛素定量生物测定
WHO国际药典及药品专家委员会第42次专家会议 (2007年10月 )讨论对于胰岛素、缩宫素等由原来 生物测定转化为理化测定的提议
•
安全性检查（safety test）
一般原则： 注射液为肌内注射：异常毒性、过敏反应物质等
检查项。原料和工艺易污染热原且用量较大者应 考虑设热原检查项 注射液为静脉注射 必需设异常毒性、热原(细菌 内毒素) 、过敏反应物质检查、降压反应物质检查 、溶血与凝聚检查等所有安全性检查项 多组分生化药注射剂基本技术要求 : 由于原材料为生物来源，成品中含有各种生化物 质，为保证注射给药的安全，一般须进行过敏物 质、降压物质、异常毒性等检查
•
生产工艺验证的品种
DNA重组人生长激素、人胰岛素、人胰高 血糖素 ，降钙素等常规检定已用理化测定 （HPLC） 药典（BP、ChP）规定：在研发阶段，生 产过程中的产品必须用体内生物测定方法 测定其生物效价，直到生产稳定为止
•
活性测定分类
活性测定---定量：质量标准中生物效价 测定（HCG、HMG、肝素）
ChP 2005 ChP 2005
孕马血清促性腺 雌幼大鼠卵巢增重法 激素
升压素
大鼠血压升高法
效价测定 鉴别
BP2007 USP29
人胰高血糖素 兔血糖升高法
工艺验证 BP2007
人红细胞生成素 小鼠网织红细胞计数 效价测定 ChP 2005
•
生化药标准中的体外生物检定（1）
离体动物器官、细胞培养、生化酶促反应、免疫学活性等测定法
---半定量 ---定性
•
活性测定------半定量
半定量------当理化测定占主导地位，生物效价 测定降为辅助作用，只用于活性检查，设定限 值，采用半定量方法，不需精确的生物统计， 尽可能减少实验动物用量
如治疗二型糖尿病新药重组人胰高血糖素类多 肽-1（7-36）质量标准中采用半定量方法（限 值为小鼠血糖降低应大于20%）进行活性检查
(Sulodexide)
重组绒促性素 幼小鼠子宫增重法 HPLC (rHCG)
重组卵泡刺激 幼大鼠卵巢增重法 HPLC 素(rFSH)
重组黄体生成 幼大鼠精囊增重法 HPLC 素(rLH)
企业标准 企业标准 企业标准 企业标准
•
发展方向
取代 在今后药品质量标准中生物测定逐渐被先进 的理化方法、或能保证临床用药安全有效的其它 方法所取代，或只存在于生产研究阶段
14、生化药品过敏原的研究。（中检所负责） 15、辅酶A HPLC法与效价测定法的相关验证。（河南所负责） 16、磷测定方法的方法学研究。（上海所负责） 17、多酶片的质量标准提高。（陕西所负责） 18、复方氨基酸注射液等输液中铝元素考察及检查方法的建立。
（辽宁所牵头） 19、修订分子排阻色谱法中生物大分子聚合物分子量与分子量分
•
中国药典2010年版二部生化药品专业科研项目
1、药品中氨基酸分析方法的研究（归纳分类）。（中检所负责 ）
2、蛋白质含量测定方法的规范化研究，增订附录。（上海所负 责）
3、人工肠液和胃液中所用酶试剂的标准化研究。（中检所和北 京所负责）
4、缩宫素、降钙素等品种用HPLC法替代生物测定法的研究。 （各品种起草单位）。
，中检所复核，各品种起草单位参加） •
中国药典2010年版二部生化药品专业科研项目
11、降压物质（组胺、类组胺）质谱检测与动物实验相关性的研 究。（中检所负责，上海所、广州所、天津所参与）
12、应用PCR对人源性药品原材料残留病毒核酸的研究。（中山 大学负责）
13、生化药注射剂、滴眼剂的可见异物检查研究。（北京所牵头 ，各品种起草单位参加）
效价测定 效价测定 效价测定 效价测定
白细胞介素-2 （IL-2） 肿瘤坏死因子 （TNF）
CTLL-2细胞/MTT比色法 L929细胞/结晶紫染色法
促进细胞生长 效价测定 抑制细胞生长 效价测定
碱性成纤维细胞生长因子 3T3细胞/MTT染色法 （bＦＧＦ）
促进细胞生长
•
效价测定
实验设计与生物统计
ChP2005版二部缩宫素仍用定量生物测定法
•
生化药标准中的体内生物检定（1）
Байду номын сангаас
生化药名
生测方法
应用
收载标准
HMG 尿促性素
FSH大鼠卵巢增重法 鉴别
ChP 2005
LH大鼠精囊增重法 效价测定
HCG绒促性素 雌幼小鼠子宫增重法 效价测定 ChP 2005
垂体后叶
大鼠血压升高法
效价测定 ChP 2005
HPLC
低分子肝素 血浆凝固法或家兔 分光光度法 全血凝固法
ChP2005 BP2007 ChP2005 BP2007 ChP2005 BP2007 BP2007
•
在本实验室已用理化测定代替生物测定 两种方法间具有良好相关性（P﹤0.01）的品种
生化药名
生物测定方法
理化测定方法 收载标准
伟素
大鼠血脂清除率法 分光光度法
结果较平稳，误差小，重现性好
肝素含片内LMWH不是化学纯品，是一定分子量范围内的 多相性成分的分布，其相对分子量、糖链长度、硫酸化数 目和位置、结构的不均一性对显色反应的分光光度法均有 一定误差
•
正确的实验设计并运用生物统计 提高实验的准确度和精密度
•标准曲线法与量反应平行线4·4法测定同一批肝素含片产品抗FXa效价比较
5、等电聚焦电泳法的规范化研究，增订附录（中检所负责） 6、体外生物活性测定法标准化研究。（中检所负责） 7、多合成肽（8、14、28、3、4、9肽）的相关物、不相关物的
分析。（中 检所负责） 8、硫酸软骨素、香菇多糖、低分子肝素等多糖类药物的分子量
及分布的标准物质的研究。（中检所） 9、多烯酸乙酯的相关物、不相关物的分析。（北京所） 10、氨基酸原料药中其他氨基酸检查方法的考察。（河南所牵头
生物测定（无论体内、体外 ）的实验误差比理化 测定要大
控制实验误差尤为重要 试验控制（良好实验操作、试验材料一致性） 合理的实验设计 运用生物统计
•
例如肝素含片质量标准 （9th册地标升国标）
内为低分子肝素:LMWH，对FXa效价测定采用体外 酶促反应的分光光度法 实验设计为标准曲线法 对其相关系数（r）和每一浓度重复次数均未作要求
生化药名
生测方法
原理
应用
干扰素（IFN）
粒细胞集落刺激因子（GCSF） 粒细胞-巨嗜细胞集落刺 激因子（GM-CSF） 表皮生长因子（EGF）
Wish细胞病变抑制/结晶紫染 色法 NFS-60细胞/MTT比色法
TF-1细胞/MTT比色法
3T3细胞/MTT比色法
间接保护细胞 促进细胞生长 促进细胞生长 促进细胞生长
•
活性测定------定性
定性（鉴别 Identity）对质量控制能用理化测 定的产品，生物测定从主导地位的定量测定降 为次要的鉴别项的定性测定，只用较少的动物
例如USP29版：缩宫素（oxytocin）子宫收缩 法用于鉴别；升压素（Vasopressin）大鼠血 压升高法用于鉴别，效价测定均采用HPLC法
生物检定是反映产品质量的重要指标，具 有专属性
当前英国、美国及中国药典都有收载
•
生物检定的重要作用
新药研发初始阶段(体外测定筛选有效成分 、整体动物试验确认药效)
生产阶段：评价产品批与批之间稳定性和 一致性
生产工艺验证 （生物检定可监测不曾预料、不易发现的 构象变化，它是所有变化的综合效应）
生化药物质量标准中的 生物检定及其进展
2020年6月2日星期二
生物检定（bioassay ）
一些生化药物质量标准中有生物活性测定 安全性检查
（多组分生化药的原材料来源于人、动物的组织或者体液 ，或者通过发酵而来。其组分不明确、按照化学药品的 质控方式很难控制其质量 ）
多组分生化药注射剂基本技术要求：
•
生物检定进展
科技发展，一些生化药已由现代生物技术 （DNA重组、生物合成等 ）获得
检测技术、结构分析水平的提高 产品纯度 生产工艺的成熟、完善，产品达到高纯
生物测定 繁琐、实验周期长、准确度差、误差大、耗 费大量人力、物力
随着对动物保护、对实验动物减少、替代、优化（3R ）的呼声越来越高，生物测定已不适应现代科学技术 的发展
本实验室增加要求r >0.98和每一浓度至少重复2次 对同一批号肝素含片产品测定其抗FXa效价，结果误
差仍大，重现性差，波动大，缺乏可比性