不同单色光对紫色红曲霉生长、色素和桔霉素合成的影响

第37卷第2期2019年3月食品科学技术学报Journal of Food Science and TechnologyVol．37No．2Mar．2019doi：10．3969/j．issn．2095-6002．2019．02．008文章编号：2095-6002（2019）02-0048-08引用格式：刘宏，陈迪，陈勉华，等．不同单色光对紫色红曲霉生长、色素和桔霉素合成的影响［J］．食品科学技术学报，2019，37（2）：48－55．LIU Hong，CHEN Di，CHEN Mianhua，et al．Effects of different monochromatic light on growth，pigments and citrinin bio-synthesis of Monascus purpureus［J］．Journal of Food Science and Technology，2019，37（2）：48－55．不同单色光对紫色红曲霉生长、色素和桔霉素合成的影响刘宏1，陈迪1，2，陈勉华1，李贞景1，王昌禄1，*（1．天津科技大学食品工程与生物技术学院/省部共建食品营养与安全国家重点实验室/食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457；2．河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001）摘要：以紫色红曲霉M9为研究对象，研究不同单色光对其生长、色素和桔霉素合成的影响。

采用观察法和高效液相色谱法对紫色红曲霉M9在持续红光、黄光、绿光、蓝光照射下的菌落形态及6种红曲色素产量进行研究。

采用高效液相色谱法和ＲT-qPCＲ法对不同红光光照时间和光照强度下红曲色素和桔霉素产量以及相关基因表达量进行测定。

结果表明，红光是最显著的促进紫色红曲霉M9生长和色素产生的光源。

高产红曲色素、低产桔霉素的最佳光照时间和强度分别为30 min/d和300lx，初步推测红曲色素合成相关基因mppA/B/D/F、mppＲ1/Ｒ2、MpPKS5、MpFasA2/B2可能参与两种橙色素的生物合成，mppC、mppE可能参与两种红色素和两种黄色素的生物合成；桔霉素合成相关基因ctnA/D/E/F/G/H/I、orf1/3/4/5、pksCT可能参与桔霉素的合成代谢，而ctnＲ1可能参与桔霉素的分解代谢。

关键词：紫色红曲霉M9；单色光；生长；红曲色素；桔霉素中图分类号：TS201.3文献标志码：A收稿日期：2018－09－26基金项目：国家自然科学基金资助项目（31330059；31571820）。

第一作者：刘宏，女，硕士研究生，研究方向为发酵食品与生物资源开发。

*通信作者：王昌禄，男，教授，博士生导师，主要从事食品生物技术方面的研究。

红曲霉可以产生大量具有生物活性物质的次级代谢产物［1－3］。

红曲色素作为红曲霉的主要次级代谢产物，具有多种生物活性［4－12］。

人们已完成了6种主要红曲色素的结构鉴定，包括两种红色素：红斑红曲胺（rubropunctamine，ＲUM）、红曲玉红胺（monascorubramine，MOM）；两种黄色素：红曲素（monascin，MS）、红曲黄素（ankaflavin，AK）；两种橙色素：红斑红曲素（rubropunctatin，ＲUN）、红曲玉红素（monascorubrin，MON）［3］。

真菌肾脏毒素———桔霉素的发现引起了人们对于红曲霉安全性的争论，限制了红曲产品的开发和应用［13］；因此，在提高红曲色素产量的同时降低桔霉素产量，对红曲产品开发和应用具有重要意义。

光作为一种重要信号，可用来调控丝状真菌的生长、发育及次生代谢。

不同波长的单色光对丝状真菌的生长发育及次级代谢的影响各不相同［14］。

大量研究［15－18］表明，不同光源对红曲霉色素和桔霉素的产生有很大影响，但研究还不够深入。

目前，系统研究不同光源对红曲霉生长及色素产生的报道并不多见，研究红光不同光照条件对红曲色素和桔霉素产生的影响也鲜有报道。

本文拟对不同波长单色光特别是红光对紫色红曲霉（Monascus purpureus）M9生长、色素和桔霉素产量的影响进行研究，并从分子水平上初步探讨光照培养对红曲色素和桔霉素代谢机理的影响，希望为光照发酵法高产红曲色素、低产桔霉素提供技术支撑，为红曲霉次生代谢途径研究提供参考。

841材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌种来源红曲霉菌株（Monascus purpureus M9），由天津科技大学食品工程与生物技术学院发酵食品与生物资源开发研究室保藏。

1.1.2主要试剂葡萄糖、蛋白胨、NaNO 3、MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4，天津市化学试剂一厂；无水乙醇，天津市江天化工技术有限公司；琼脂粉，北京索莱宝生物科技公司，以上试剂均为国产分析纯。

乙腈、甲酸（国产色谱纯试剂），上海安谱科学仪器有限公司；Gold-viewI 型核酸染色剂、6ˑDNA Loading Buffer 、1kb plus DNA Ladder （国产生化试剂），北京索莱宝生物科技公司；DM2000Marker （国产生化试剂），康维世纪生物科技有限公司；Plant ＲNA Kit ，美国Omega Bio －Tek 公司；HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit ，康维世纪生物科技有限公司；SYBＲ PremixEx TaqTM II ，Takara （大连）有限公司。

1.1.3主要培养基麦芽汁琼脂培养基（MEA ）：将麦芽磨碎，加入4倍体积水，60ħ水浴至麦芽糖度为18 20ʎBX ，8层纱布过滤，置于－20ħ冰箱备用。

使用时融化麦芽汁，将糖度调为10 12ʎBX ，加入质量分数为3%琼脂，121ħ灭菌20min 。

种子液培养基：葡萄糖6g ，蛋白胨2g ，NaNO 31g ，MgSO 4·7H 2O 0.5g ，KH 2PO 41g ，自来水100mL ，乳酸调pH 值至5.5左右，121ħ灭菌20min 。

液体发酵培养基：大米粉5g ，NaNO 30.3g ，MgSO 4·7H 2O 0.1g ，KH 2PO 40.15g ，自来水100mL ，pH 值自然，121ħ灭菌20min 。

固体平板培养基：麦芽糖4g ，可溶性淀粉5g ，蛋白胨3g ，琼脂3g ，自来水100mL ，pH 值自然，121ħ灭菌20min 。

1.2仪器与设备SW －CJ －1FD 型超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LS －B50L 型立式压力蒸汽灭菌锅，上海华线医用核子仪器有限公司；LＲH －250－GII 型微电脑控制光照培养箱，广东省医疗器械厂；J －26XP 型高速冷冻离心机，贝克曼库尔特（中国）有限公司；1200型高效液相色谱仪、MX3000P 型实时荧光定量PCＲ仪，美国安捷伦科技有限公司；KW －T8ZW －12W 型LED 单色灯（红光、黄光、绿光和蓝光），深圳宸华照明有限公司。

1.3实验方法1.3.1菌株保藏和种子液制备用无菌接种环挑取紫色红曲霉M9菌丝，划线于麦芽汁斜面培养基上，30ħ培养7 9d ，将活化好的菌种保藏于4ħ冰箱，一个月活化一次。

向紫色红曲霉M9试管斜面加入5mL 生理盐水，用无菌孢子铲轻轻刮取孢子，制成孢子悬液。

将孢子悬液全部倒入种子培养基中，在30ħ，180r /min 的摇床中培养36 40h ，制成种子液。

1.3.2菌落形态观察将制备好的种子液过8层无菌纱布，得到孢子悬液，通过血球计数板将孢子浓度调为106个/mL 。

取20μL 孢子悬液，单点法加在固体平板培养基中心，待菌液被培养基充分吸收后转入装有LED 单色灯（红光、黄光、绿光和蓝光）的恒温培养箱中。

调整光照强度为100lx ，光照组置于光源的正下方，黑暗组避光培养，30ħ静置培养10d ，分别在第4、7、10天记录菌落形态。

1.3.3液态发酵方法和光照条件将制备好的种子液过8层无菌纱布，得到孢子悬液，调孢子浓度为106个/mL 。

将5mL 孢子悬液接种于50mL 的大米液态发酵培养基中，置于30ħ恒温培养箱中，静置培养10d 。

光照实验分为两组。

第一组将恒温培养箱划分为5个独立灯室，每个灯室安装不同波长的LED 单色光（红光、黄光、绿光和蓝光）。

光照强度调整为100lx ，光照时间为持续光照，避光室为黑暗培养。

第二组将恒温培养箱划分为5个独立灯室，每个灯室安装红色LED 单色光，分别在不同光照时间15、30、45、60min /d ，不同光照强度100、200、300、400lx 下培养，避光室为黑暗培养。

1.3.4红曲色素和桔霉素的提取方法将发酵结束后的红曲霉菌丝体烘干至恒重，用研钵将其磨成粉末状，过80目筛。

准确称取0.5000g 红曲粉末样品，装入10mL 离心管中，加入4mL 75%乙醇，振荡混匀，超声30min ，3500r /min 离心10min ，收集上清液于10mL 容量瓶中。

向沉淀物中加入3mL 75%乙醇，混匀，超声30min ，3500r /min 离心10min ，收集上清液。

再重复此操作一次，将3次94第37卷第2期刘宏等：不同单色光对紫色红曲霉生长、色素和桔霉素合成的影响上清液合并，用75%乙醇定容至10mL。

稀释10倍后，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，高效液相色谱（HPLC）法进行分析。

1.3.5红曲色素和桔霉素的HPLC检测1.3.5.1红曲色素的测定色谱柱：XDB－C18（5μm，4.6mmˑ150mm）；流动相：A泵（水+0.1%甲酸），B泵（乙腈）。

乙腈和水分别过0.45μm的有机系滤膜和水系滤膜，脱气30min。

检测器：DAD（二极管阵列检测器），流速为1mL/min，检测波长为410nm，检测温度为25ħ，进样量为20μL。

梯度洗脱方法如表1。

表1HPLC梯度洗脱流动相比例Tab．1Mobile phases of gradient elution in HPLCt/min流动相A/%流动相B/%0 2065 2535 7520 35257535 4025 6575 351.3.5.2桔霉素的测定色谱柱：XDB－C18（5μm，4.6mmˑ150mm）；流动相：A泵（水，色谱纯甲酸调pH值为2.5），B泵（乙腈）。

乙腈和水分别过0.45μm的有机系滤膜和水系滤膜，脱气30min。

检测器为荧光检测器，流速为1mL/min，检测波长为激发波长（λex）331nm，发射波长（λem）500nm，检测温度为25ħ，进样量为20μL。

桔霉素检测采用等度洗脱，流动相中水与乙腈的比例为55%：45%。

1.3.6红曲色素和桔霉素合成相关基因表达量的测定方法以NCBI（National Center for Biotechnology Infor-mation）报道的红曲霉色素和桔霉素合成相关基因序列为参考序列。